Los niveles elevados de proteína de líquido cefalorraquídeo pueden ser el resultado de la difusión de proteína plasmática a través de una barrera hematoencefálica alterada o de la síntesis intratecal. En este artículo se presenta un protocolo de prueba optimizado que ayuda a discriminar ambos casos y proporciona mediciones cuantitativas de proteínas sintetizadas intratecalmente.
El líquido cefalorraquídeo (LCR), un líquido que se encuentra en el cerebro y la médula espinal, es de gran importancia para la ciencia básica y clínica. El análisis de la composición de proteínas del LIF proporciona información crucial en la investigación básica de neurociencia, así como en enfermedades neurológicas. Una advertencia es que las proteínas medidas en el LSC pueden derivar tanto de la síntesis intratecal como de la transudación del suero, y el análisis proteico del LSC sólo puede determinar la suma de estos dos componentes. Para discriminar entre la transudación de proteínas de la sangre y las proteínas producidas intratecalmente en modelos animales, así como en humanos, las mediciones de perfilado de proteínas CSF utilizando herramientas convencionales de análisis de proteínas deben incluir el cálculo del cociente cSF/suero de albúmina (Qalbúmina),un marcador de la integridad de la interfaz hematoencefálico (BBI) y el índice de proteínas(proteínaQ /Qalbumin),una estimación de la síntesis de proteínas intralacales. Este protocolo ilustra todo el procedimiento, desde el LCM y la recolección de sangre hasta los cálculos de cocientes e índices, para la medición cuantitativa de la síntesis de proteínas intratecales y el deterioro de la BBI en modelos de ratón de trastornos neurológicos.
El líquido cefalorraquídeo (LCR), un líquido transparente e incoloro que rodea el cerebro y la médula espinal, tiene una gran importancia clínica y científica básica. El LSN preserva el entorno electrolítico del sistema nervioso central (SNC), equilibra el estado sistémico de la base de ácidos, suministra nutrientes a las células neuronales y gliales, funciona como un sistema linfático para el SNC, y transporta hormonas, neurotransmisores, citoquinas y otros neuropéptidos a lo largo del SNC1. Así, como la composición del LSNC refleja la actividad del SNC, este fluido ofrece un valioso, aunque indirecto, acceso para caracterizar el estado fisiológico y patológico del SNC.
El LSN se ha utilizado para diagnosticar afecciones que afectan al SNC durante más de cien años, y durante la mayor parte de este tiempo, fue estudiado principalmente por los médicos como una herramienta de diagnóstico. Sin embargo, en los últimos años los neurobiólogos han reconocido el potencial del LIF para estudiar la fisiopatología del SNC. En particular, se han introducido varias herramientas de análisis de proteínas de alto rendimiento en el ámbito de la neurociencia, lo que permite un estudio detallado de la composición proteica del LSCA, con la expectativa de que este análisis puede ayudar a proporcionar información sobre los cambios dinámicos que ocurre dentro del SNC.
Los desarrollos tecnológicos en técnicas de inmunoensayo multiplex como Luminex y Simoa technologies2,3, proporcionan a los investigadores hoy en día la capacidad de detectar cientos de proteínas a concentraciones muy bajas. Además, estas mismas tecnologías permiten el uso de pequeños volúmenes de muestra, promoviendo así estudios en animales pequeños, incluidos ratones, en los que volúmenes de muestras limitados de LIF han impedido caracterizaciones detalladas del fluido hasta hace poco.
Sin embargo, una advertencia es que las proteínas medidas en el LCC pueden derivar de la síntesis intratecal y/o la transudación del suero debido a una interfaz hematoencefálica (BBI) dañada. Desafortunadamente, el análisis proteico del LIF por sí solo sólo puede determinar la suma de estos dos componentes. Para discriminar entre las proteínas transsufechadas y producidas intratecalmente, las mediciones de proteínas CSF que utilicen cualquier herramienta de análisis de proteínas disponible deben ajustarse para la variabilidad individual en las concentraciones séricas, así como para la integridad de la barrera. Sin embargo, aunque este ajuste se utiliza comúnmente en la práctica clínica, por ejemplo, el índice IgG de La CSF, que tiene alta sensibilidad para detectar la síntesis intratecal de IgG4,5,6, hasta la fecha muy pocos estudios de investigación han corregido las concentraciones de proteína CSF para la concentración sérica y la integridad de la barrera7,8.
Actualmente, el enfoque Reibergram es la mejor manera de determinar la función de barrera y la síntesis intratecal de proteínas. Se trata de una evaluación gráfica en diagramas de cocientes CSF/suero que analiza, de forma integrada, tanto la función de barrera (dys) como la síntesis de proteínas intratecales, refiriéndose a una proteína exclusivamente derivada de la sangre9,10. La albúmina proteica muy abundante suele ser elegida como proteína de referencia porque se produce sólo en el hígado y porque su tamaño, de aproximadamente 70 kDa, es intermedio entre proteínas pequeñas y grandes11. El diagrama de análisis fue definido por primera vez por Reiber y Felgenhauer en 1987 para las principales clases de inmunoglobulinas (Igs)11,siendo empíricamente basado en los resultados obtenidos del análisis de miles de muestras humanas9. El enfoque fue confirmado posteriormente por la aplicación de las dos leyes de difusión de Fick en la teoría de la difusión molecular/velocidad de flujo12. Tal teoría demuestra la difusión de una proteína a través de la barrera tiene una distribución hiperbólica y puede explicar cuantitativamente la dinámica de las proteínas en el SNC9,13. En general, la ventaja de utilizar el Reibergram para demostrar la síntesis de proteínas intratecales es que identifica simultáneamente la fracción proteica que entra en el LRESULT desde el suero, así como la cantidad de proteína que se encuentra en el LIF debido a la producción local.
El presente artículo y el protocolo relacionado describen todo el procedimiento, desde el LC y la recolección de sangre hasta los cálculos finales que corrigen los niveles de proteína CSF, para la medición cuantitativa de la síntesis de proteínas intratecales en modelos de ratón de Trastornos. Este procedimiento proporciona una línea de base para evaluar (1) el origen fisiopatológico de cualquier proteína del LCP y (2) la estabilidad y la importancia funcional de la integridad de la barrera. Este procedimiento y protocolo no sólo son útiles para evaluar muestras de CSF de ratón, sino que también son útiles en el análisis de la CSF en una multitud de modelos animales de enfermedades neurológicas y pacientes humanos.
Los métodos cuantitativos para la evaluación del aumento de las concentraciones de proteínas del LSC son herramientas útiles en la caracterización del estado fisiológico y patológico del SNC. Sin embargo, más allá de la cuantificación fiable de los niveles de proteína sofo, la detección de proteínas del LIF requiere una expresión de resultados que discriminen entre las fracciones derivadas de la sangre y del SNC en el LRESULT. Sin embargo, hasta la fecha, los ensayos de cuantificación de proteínas comúnm…
The authors have nothing to disclose.
Los autores agradecen al personal del Centro de Medicina Comparada e Investigación (CCMR) de Dartmouth por su cuidado experto de los ratones utilizados para estos estudios. El Fondo de Investigación Bornstein financió esta investigación.
1 mL insulin syringe | BD | 329650 | |
1 mL syringe | BD | 329622 | |
25 gauge needle | BD | 305122 | |
3 mL syringe | BD | 309582 | |
30 gauge insulin needle | BD | 305106 | |
Absorbent pads | Any suitable brand | ||
Acepromazine | Patterson Vet Supply Inc | ||
BioPlex Handheld Magnetic Washer | BioRad | 171020100 | Magnet |
BioPlex MAGPIX Multiplex Reader | BioRad | 171015001 | |
BioPlex Pro Flat Bottom Plates | BioRad | 171025001 | |
Biotinilated detection antibody | Any suitable source | The antibody has to be directed against the species of the protein of interest. | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
Buprenorphine hydrochloride | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
Capillary Tubes | Sutter Instrument | B100-75-10 | OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm Borosilicate glass 10 cm; drawn over Bunsen to make ID smaller. |
Centrifuge tube, 0.2 mL | VWR | 20170-012 | |
Centrifuge tube, 0.5 mL | VWR | 87003-290 | |
Centrifuge tube, 1.5 mL | VWR | 87003-294 | |
Chlorhexidine diacetate | Nolvasan | E004272 | |
Disposable pipettes tips | Any suitable brand | ||
Ear bars | KOPF Instruments | 1921 or 1922 | |
Ethanol | Kopter | V1001 | |
Freezer | VWR | VWR32086A | |
Gauze | Medline | NON25212 | |
Heating pad | Sunbeam | XL King Size SoftTouch, 4 Heat Settings with Auto-Off, Teal, 12-Inch x 24-Inch | |
Induction Chamber | VETEQUIP | ||
Isoflurane | Patterson Vet Supply Inc | NDC 14043-704-06 | |
Ketamine (KetaVed) | Patterson Vet Supply Inc | ||
MagPlex Microspheres (antibody-coupled) | BioRad | Antibody-coupled magnetic bead | |
Microplate Shaker | Southwest Scientific | SBT1500 | |
Microretractors | Carfill Quality | ACD-010 | Blunt – 1 mm |
Microsoft Office (Excel) | Microsoft | ||
MilliPlex MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead Panel | EMD Millipore | MGAMMAG-300K | Commercial kit for the quantification through Luminex of a panel of immunoglobulin isotypes and subclasses in mouse fluids. |
Mouse Albumin capture ELISA kit | Novus Biological | NBP2-60484 | Commercial kit for the quantification through ELISA of albumin in mouse fluids. |
Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000060 | |
Non-Sterile swabs | MediChoice | WOD1002 | Need to be autoclaved for sterility |
Oxygen | AIRGAS | OX USPEA | |
Pasteur Pippettes | Fisher | 13-678-20A | 5 & 3/4" |
PDS suture with disposable needle, 6-0 Prolen | Patterson Vet | 8695G | P-3 Reverse Cutting, 18" |
PE-Streptavidin | BD Biosciences | 554061 | |
Pipetters | Eppendorf | Research seriers | |
Polyethylene tubing | |||
Refrigerated Centrifuge | Beckman Coulter | ALLEGRA X-12R | |
Scale | Uline | H2716 | |
Scalpel | Feather | EF7281 | |
Shaver | Harvard Apparatus | 52-5204 | |
Standard proteins | Any suitable source | The best choice for a reference standard is a purified, known concentration of the protein of interest. | |
Stereotaxic instrument | KOPF Instruments | Model 900LS | Standard Accessories |
Sterile 1 x PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
Sterile saline | Baxter | 0338-0048-02 | 0.9 % Sodium Chloride Irrigation USP |
Surgical Forceps Curved, 7 (2) | Fine Science Tools | 11271-30 | Dumont |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | Stainless 25x |
Vaporizer + Flow meter | Moduflex Anhestesia Instruments | ||
Vortex | Fisher | 02-215-414 | |
Warming pad | Kent Scientific Corporation | RT-JR-20 | |
Water Sonicator | Cole Parmer | EW-08895-01 | |
Xylazine | Patterson Vet Supply Inc |