Förhöjda spinal Fluid proteinnivåer kan antingen vara resultatet av diffusion av plasmaprotein över en förändrad blod-hjärnbarriären eller intratekal syntes. En optimerad provningsprotokoll presenteras i denna artikel som hjälper till att diskriminera båda fallen och ger kvantitativa mätningar av intratekalt syntetiserade proteiner.
Cerebrospinalvätska (CSF), en vätska som finns i hjärnan och ryggmärgen, är av stor betydelse för både grundläggande och klinisk vetenskap. Analysen av CSF protein sammansättning ger viktig information i grundläggande neurovetenskap forskning samt neurologiska sjukdomar. En varning är att proteiner som mäts i CSF kan härledas från både intratekal syntes och transudation från serum, och proteinanalys av CSF kan bara bestämma summan av dessa två komponenter. Att diskriminera mellan proteintransudation från blodet och intratekalt producerade proteiner i djurmodeller samt hos människor, CSF protein profilering mätningar med hjälp av konventionella proteiner analysverktyg måste omfatta beräkning av albumin CSF/serum kvoten (Qalbumin), en markör för integriteten hos den Blood-brain Interface (BBI), och protein index (qprotein/qalbumin), en uppskattning av intratekal proteinsyntes. Detta protokoll illustrerar hela förfarandet, från CSF och blod insamling till kvoter och index beräkningar, för kvantitativ mätning av intratekal proteinsyntes och BBI försämring i musmodeller av neurologiska sjukdomar.
Cerebrospinalvätska (CSF), en klar och färglös vätska som omger hjärnan och ryggmärgen, innehar stor klinisk och grundläggande vetenskaplig betydelse. CSF bevarar den elektrolytiska miljön i centralanervsystemet (CNS), balanserar systemisk syra-bas status, levererar näringsämnen till neuronala och gliala celler, fungerar som ett lymfsystem för CNS, och transporterar hormoner, signalsubstanser, cytokiner och andra neuropeptider i hela CNS1. Således, som CSF sammansättningen återspeglar aktiviteten i CNS, denna vätska erbjuder en värdefull, men indirekt, tillgång till karakterisera den fysiologiska och patologiska tillståndet i CNS.
CSF har använts för att diagnostisera tillstånd som påverkar CNS i över hundra år, och för det mesta av denna tid, det var främst studeras av kliniker som ett diagnostiskt verktyg. Emellertid, under de senaste åren neurobiologer har erkänt potentialen av CSF för att studera patofysiologin i CNS. I synnerhet har flera olika högpresterande proteinanalys verktyg införts i neurovetenskap sfären så att en detaljerad studie av protein sammansättningen av CSF, med förväntningen att denna analys kan bidra till att ge insikt i de dynamiska förändringarna förekommer i CNS.
Teknisk utveckling i multiplex immunoassay tekniker såsom Luminex och simoa Technologies2,3, ge forskarna idag med förmågan att upptäcka hundratals proteiner vid mycket låga koncentrationer. Dessutom tillåter samma teknik användningen av små provvolymer, vilket främjar studier av små djur, inklusive möss, där begränsade provvolymer av CSF har förhindrat detaljerade karakteriseringar av vätskan tills nyligen.
Ändå, en varning är att proteiner som mäts i CSF kan härledas från intratekal syntes och/eller transudation från serum på grund av en skadad blod-hjärna-gränssnitt (BBI). Tyvärr, proteinanalys av CSF ensam kan bara bestämma summan av dessa två komponenter. För att diskriminera mellan transsudat och intratekalt producerade proteiner, CSF protein mätningar med hjälp av alla tillgängliga proteinanalys verktyg måste justeras för individuell variation i serumkoncentrationer samt barriär integritet. Men även om denna justering ofta används i klinisk praxis, t. ex., CSF-IgG-indexet, som har hög känslighet för detektion av intratekal IgG-syntes4,5,6, har mycket få forskningsstudier korrigerat CSF proteinkoncentrationer för serumkoncentrationen och barriär integriteten7,8.
För närvarande är Reibergram-metoden det bästa sättet att bestämma barriärfunktionen och intratekal syntes av proteiner. Det är en grafisk utvärdering i CSF/serum kvoten diagram som analyserar, på ett integrerat sätt, både barriär (DYS) funktion och intratekal proteinsyntes, med hänvisning till ett exklusivt blod-derived protein9,10. Det mycket rikliga proteinet albumin väljs vanligen som referens protein eftersom det produceras endast i levern och eftersom dess storlek, cirka 70 kDa, är mellanliggande mellan små och stora proteiner11. Analysdiagrammet definierades först av Reiber och Felgenhauer i 1987 för de stora klasserna av immunglobuliner (IGS)11, som empiriskt baserades på de resultat som erhållits från analysen av tusentals Human prov9. Tillvägagångssättet bekräftades därefter av applikationen av de två fick-lagarna av diffusion i teorin av molekylär diffusion/flöde klassar12. En sådan teori visar spridningen av ett protein genom barriären har en hyperbolisk distribution och kan kvantitativt förklara dynamiken i proteiner i CNS9,13. Sammantaget fördelen med att använda Reibergram för att demonstrera intratekal proteinsyntes är att det samtidigt identifierar proteinfraktion som går in i CSF från serum samt mängden protein som finns i CSF på grund av lokal produktion.
Denna artikel och det tillhörande protokollet beskriver hela förfarandet, från CSF och blod insamling till de slutliga beräkningarna korrigera CSF proteinnivåer, för kvantitativ mätning av intratekal proteinsyntes i musmodeller av neurologiska Sjukdomar. Detta förfarande ger en baslinje för att bedöma (1) det patofysiologiska ursprunget för något CSF-protein och (2) stabiliteten och den funktionella betydelsen av barriär integriteten. Detta förfarande och protokoll är inte bara användbart för att bedöma mus CSF prover men är också användbara i att analysera CSF i en mängd djurmodeller av neurologiska sjukdomar och mänskliga patienter.
Kvantitativa metoder för utvärdering av förhöjda halter av CSF-protein är användbara verktyg i karakteriseringen av det fysiologiska och patologiska tillståndet i CNS. Men utöver tillförlitlig kvantifiering av CSF proteinnivåer, detektion av CSF proteiner kräver ett uttryck för resultat som diskriminerar mellan blod-och CNS-härledda fraktioner i CSF. Emellertid, hittills, de vanligaste protein kvantifiering analyser tillåter inte diskriminering mellan de två proteinkomponenterna, även med hjälp av hög k…
The authors have nothing to disclose.
Författarna tackar personalen vid centrum för Komparativ medicin och forskning (CCMR) vid Dartmouth för deras expert vård av möss som används för dessa studier. Forskningsfonden Bornstein finansierade denna forskning.
1 mL insulin syringe | BD | 329650 | |
1 mL syringe | BD | 329622 | |
25 gauge needle | BD | 305122 | |
3 mL syringe | BD | 309582 | |
30 gauge insulin needle | BD | 305106 | |
Absorbent pads | Any suitable brand | ||
Acepromazine | Patterson Vet Supply Inc | ||
BioPlex Handheld Magnetic Washer | BioRad | 171020100 | Magnet |
BioPlex MAGPIX Multiplex Reader | BioRad | 171015001 | |
BioPlex Pro Flat Bottom Plates | BioRad | 171025001 | |
Biotinilated detection antibody | Any suitable source | The antibody has to be directed against the species of the protein of interest. | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
Buprenorphine hydrochloride | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
Capillary Tubes | Sutter Instrument | B100-75-10 | OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm Borosilicate glass 10 cm; drawn over Bunsen to make ID smaller. |
Centrifuge tube, 0.2 mL | VWR | 20170-012 | |
Centrifuge tube, 0.5 mL | VWR | 87003-290 | |
Centrifuge tube, 1.5 mL | VWR | 87003-294 | |
Chlorhexidine diacetate | Nolvasan | E004272 | |
Disposable pipettes tips | Any suitable brand | ||
Ear bars | KOPF Instruments | 1921 or 1922 | |
Ethanol | Kopter | V1001 | |
Freezer | VWR | VWR32086A | |
Gauze | Medline | NON25212 | |
Heating pad | Sunbeam | XL King Size SoftTouch, 4 Heat Settings with Auto-Off, Teal, 12-Inch x 24-Inch | |
Induction Chamber | VETEQUIP | ||
Isoflurane | Patterson Vet Supply Inc | NDC 14043-704-06 | |
Ketamine (KetaVed) | Patterson Vet Supply Inc | ||
MagPlex Microspheres (antibody-coupled) | BioRad | Antibody-coupled magnetic bead | |
Microplate Shaker | Southwest Scientific | SBT1500 | |
Microretractors | Carfill Quality | ACD-010 | Blunt – 1 mm |
Microsoft Office (Excel) | Microsoft | ||
MilliPlex MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead Panel | EMD Millipore | MGAMMAG-300K | Commercial kit for the quantification through Luminex of a panel of immunoglobulin isotypes and subclasses in mouse fluids. |
Mouse Albumin capture ELISA kit | Novus Biological | NBP2-60484 | Commercial kit for the quantification through ELISA of albumin in mouse fluids. |
Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000060 | |
Non-Sterile swabs | MediChoice | WOD1002 | Need to be autoclaved for sterility |
Oxygen | AIRGAS | OX USPEA | |
Pasteur Pippettes | Fisher | 13-678-20A | 5 & 3/4" |
PDS suture with disposable needle, 6-0 Prolen | Patterson Vet | 8695G | P-3 Reverse Cutting, 18" |
PE-Streptavidin | BD Biosciences | 554061 | |
Pipetters | Eppendorf | Research seriers | |
Polyethylene tubing | |||
Refrigerated Centrifuge | Beckman Coulter | ALLEGRA X-12R | |
Scale | Uline | H2716 | |
Scalpel | Feather | EF7281 | |
Shaver | Harvard Apparatus | 52-5204 | |
Standard proteins | Any suitable source | The best choice for a reference standard is a purified, known concentration of the protein of interest. | |
Stereotaxic instrument | KOPF Instruments | Model 900LS | Standard Accessories |
Sterile 1 x PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
Sterile saline | Baxter | 0338-0048-02 | 0.9 % Sodium Chloride Irrigation USP |
Surgical Forceps Curved, 7 (2) | Fine Science Tools | 11271-30 | Dumont |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | Stainless 25x |
Vaporizer + Flow meter | Moduflex Anhestesia Instruments | ||
Vortex | Fisher | 02-215-414 | |
Warming pad | Kent Scientific Corporation | RT-JR-20 | |
Water Sonicator | Cole Parmer | EW-08895-01 | |
Xylazine | Patterson Vet Supply Inc |