Yüksek spinal sıvı protein düzeyleri ya değiştirilmiş bir kan-beyin bariyeri veya intratekal sentez arasında plazma proteininin difüzyon sonucu olabilir. Bu makalede, her iki vakanın da ayrımına yardımcı olan ve intrathecally sentezlenmiş proteinlerin nicel ölçümlerini sağlayan optimize edilmiş bir test protokolü sunulmuştur.
Beyin ve omurilikte bulunan bir sıvı olan beyin omurilik sıvısı (BOS), hem temel hem de klinik bilim için büyük önem taşımaktadır. BOS protein bileşiminin analizi, nörolojik hastalıkların yanı sıra temel nörolojik araştırmalarda da önemli bilgiler sağlar. Bir uyarı, BOS cinsinden ölçülen proteinlerin hem intratekal sentezden hem de serumdan transudasyondan kaynaklanabilir ve BOS’un protein analizi sadece bu iki bileşenin toplamını belirleyebilir. Protein transudasyonu ile hayvan modellerinde ve insanlarda intrathecally üretilen proteinler arasında ayrım yapmak için, geleneksel protein analiz araçlarını kullanan BOS protein profilleme ölçümleri, kan-beyin arabiriminin bütünlüğünün bir göstergesi olan albumin BOS/serum quotient (Qalbumin)ve intrakalprotein sentezinin bir tahmini olan protein indeksini (Qprotein/Qalbumin)içermelidir. Bu protokol, bos ve kan toplamadan, intratekal protein sentezinin kantitatif ölçümü ve nörolojik bozuklukların fare modellerinde BBI bozukluğunun kantitatif ölçümü için tüm prosedürü göstermektedir.
Beyin ve omuriliği çevreleyen berrak ve renksiz bir sıvı olan beyin omurilik sıvısı (BOS), büyük klinik ve temel bilimsel öneme sahiptir. BOS merkezi sinir sisteminin elektrolitik ortamını korur (CNS), sistemik asit-baz durumunu dengeler, nöronal ve glial hücrelere besin kaynakları, CNS için lenfatik bir sistem olarak fonksiyonları, ve hormonlar taşır, nörotransmitter, sitokinler ve CNS boyunca diğer nöropeptidler1. Böylece, BOS bileşimi CNS aktivitesini yansıttığından, bu sıvı CNS’nin fizyolojik ve patolojik durumunu karakterize etmek için değerli, dolaylı da olsa erişim sağlar.
BOS, yüz yılı aşkın bir süredir CNS’yi etkileyen koşulları teşhis etmek için kullanılmıştır ve bu süre içinde öncelikle klinisyenler tarafından bir tanı aracı olarak incelenmiştir. Ancak, son yıllarda nörobiyologlar CNS patofizyolojisi çalışma için BOS potansiyelini tanıdı. Özellikle, bu analizin dinamik değişimlere ışık tutabileceği beklentisiyle, BOS’un protein bileşiminin ayrıntılı bir şekilde incelenmesine olanak sağlayan nörolojik alanda çeşitli yüksek işlem protein analiz araçları kullanılmaya başlanmıştır. CNS içinde meydana gelen.
Luminex ve Simoa teknolojileri 2 gibi multipleksimmünoassay teknikleri teknolojik gelişmeler,3, çok düşük konsantrasyonlarda proteinlerin yüzlerce tespit yeteneği ile bugün araştırmacılar sağlar. Ayrıca, bu aynı teknolojiler küçük örnek hacimlerin kullanımına izin vermekte, böylece küçük hayvanlarda, fareler de dahil olmak üzere, sınırlı sayıda BOS numune hacminin yakın zamana kadar sıvının ayrıntılı karakterizasyonlarını engellediği çalışmaları teşvik etmektedir.
Bununla birlikte, bir uyarı BOS cinsinden ölçülen proteinlerin hasarlı bir kan-beyin arayüzü (BBI) nedeniyle intratekal sentez ve / veya serum transudation elde edilebilmiştir. Ne yazık ki, BOS protein analizi tek başına sadece bu iki bileşenin toplamını belirleyebilirsiniz. Transudate ve intrathecally üretilen proteinler arasında ayrım yapmak için, mevcut protein analiz aracını kullanan BOS protein ölçümleri serum konsantrasyonlarında bireysel değişkenlik ve bariyer bütünlüğü için ayarlanmalıdır. Ancak, bu ayarlama yaygın klinik uygulamada kullanılan rağmen, örneğin, BOS IgG indeksi, intratekal IgG sentezi tespit etmek için yüksek duyarlılığa sahip4,5,6, Bugüne kadar çok az araştırma çalışmaları serum konsantrasyonu ve bariyer bütünlüğü için BOS protein konsantrasyonları düzeltilmiş var7,8.
Günümüzde Reibergram yaklaşımı, proteinlerin bariyer fonksiyonunu ve intratekal sentezini belirlemenin en iyi yoludur. Bu analizleri BOS / serum bölüm diyagramları grafiksel bir değerlendirme, entegre bir şekilde, hem bariyer (dys) fonksiyonu ve intratekal protein sentezi, sadece kan kaynaklı protein atıfta9,10. Çok bol protein albumin genellikle referans protein olarak seçilir çünkü sadece karaciğerde üretilir ve büyüklüğü, yaklaşık 70 kDa, küçük ve büyük proteinler arasında ara protein11. Analiz diyagramı ilk olarak 1987 yılında Reiber ve Felgenhauer tarafından immünglobulinlerin (Igs)11’inana sınıfları için tanımlanmıştır, ampirik olarak binlerce insan örneğinin analizinden elde edilen sonuçlara dayanmaktadır9. Yaklaşım daha sonra moleküler difüzyon / akış hızı12teorisinde difüzyon iki Fick yasalarının uygulanması ile doğrulandı . Böyle bir teori bariyer yoluyla bir proteindifüzyon uhiperbolik bir dağılıma sahiptir ve nicel CNSproteinlerindinamiklerini açıklayabilir gösterir 9,13. Genel olarak, intratekal protein sentezini göstermek için Reibergram kullanmanın avantajı, aynı anda serumdan BOS giren protein fraksiyonunu ve yerel üretim nedeniyle BOS’ta bulunan protein miktarını aynı anda tanımlamasTır.
Bu makale ve ilgili protokol, BOS ve kan toplamadan BOS protein düzeylerini düzelten son hesaplamalara kadar tüm prosedürü, nörolojik fare modellerinde intratekal protein sentezinin nicel ölçümü için tanımlar. Bozukluk -ları. Bu prosedür, (1) herhangi bir BOS proteininin patofizyolojik kökenini ve (2) bariyer bütünlüğünün stabilitesini ve işlevsel önemini değerlendirmek için bir temel sağlar. Bu prosedür ve protokol sadece fare BOS örneklerinin değerlendirilmesinde yararlı olmakla kalmıyor, aynı zamanda nörolojik hastalıklar ve insan hastalarının çok sayıdaki hayvan modellerinde BOS’un analizinde de yararlıdır.
Artmış BOS protein konsantrasyonlarının değerlendirilmesi için kullanılan kantitatif yöntemler, CNS’nin fizyolojik ve patolojik durumunun karakterizasyonunda yararlı araçlardır. Ancak, BOS protein düzeylerinin güvenilir bir şekilde ölçülmesinin ötesinde, BOS proteinlerinin saptanması, BOS’ta kan ve CNS kaynaklı fraksiyonlar arasında ayrım yapan sonuçların bir ifadesi nin ifade sini gerektirir. Ancak, bugüne kadar, yaygın olarak kullanılan protein niceleme tahlilleri iki protein bileşeni arası…
The authors have nothing to disclose.
Yazarlar Karşılaştırmalı Tıp ve Araştırma Merkezi (CCMR) Dartmouth de fareler bu çalışmalar için kullanılan kendi uzman bakımı için personel teşekkür ederiz. Bu araştırmayı Bornstein Araştırma Fonu finanse etti.
1 mL insulin syringe | BD | 329650 | |
1 mL syringe | BD | 329622 | |
25 gauge needle | BD | 305122 | |
3 mL syringe | BD | 309582 | |
30 gauge insulin needle | BD | 305106 | |
Absorbent pads | Any suitable brand | ||
Acepromazine | Patterson Vet Supply Inc | ||
BioPlex Handheld Magnetic Washer | BioRad | 171020100 | Magnet |
BioPlex MAGPIX Multiplex Reader | BioRad | 171015001 | |
BioPlex Pro Flat Bottom Plates | BioRad | 171025001 | |
Biotinilated detection antibody | Any suitable source | The antibody has to be directed against the species of the protein of interest. | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A4503 | |
Buprenorphine hydrochloride | PAR Pharmaceutical | NDC 42023-179-05 | |
Capillary Tubes | Sutter Instrument | B100-75-10 | OD: 1.0 mm, ID: 0.75 mm Borosilicate glass 10 cm; drawn over Bunsen to make ID smaller. |
Centrifuge tube, 0.2 mL | VWR | 20170-012 | |
Centrifuge tube, 0.5 mL | VWR | 87003-290 | |
Centrifuge tube, 1.5 mL | VWR | 87003-294 | |
Chlorhexidine diacetate | Nolvasan | E004272 | |
Disposable pipettes tips | Any suitable brand | ||
Ear bars | KOPF Instruments | 1921 or 1922 | |
Ethanol | Kopter | V1001 | |
Freezer | VWR | VWR32086A | |
Gauze | Medline | NON25212 | |
Heating pad | Sunbeam | XL King Size SoftTouch, 4 Heat Settings with Auto-Off, Teal, 12-Inch x 24-Inch | |
Induction Chamber | VETEQUIP | ||
Isoflurane | Patterson Vet Supply Inc | NDC 14043-704-06 | |
Ketamine (KetaVed) | Patterson Vet Supply Inc | ||
MagPlex Microspheres (antibody-coupled) | BioRad | Antibody-coupled magnetic bead | |
Microplate Shaker | Southwest Scientific | SBT1500 | |
Microretractors | Carfill Quality | ACD-010 | Blunt – 1 mm |
Microsoft Office (Excel) | Microsoft | ||
MilliPlex MAP Mouse Immunoglobulin Isotyping Magnetic Bead Panel | EMD Millipore | MGAMMAG-300K | Commercial kit for the quantification through Luminex of a panel of immunoglobulin isotypes and subclasses in mouse fluids. |
Mouse Albumin capture ELISA kit | Novus Biological | NBP2-60484 | Commercial kit for the quantification through ELISA of albumin in mouse fluids. |
Multichannel pipette | Eppendorf | 3125000060 | |
Non-Sterile swabs | MediChoice | WOD1002 | Need to be autoclaved for sterility |
Oxygen | AIRGAS | OX USPEA | |
Pasteur Pippettes | Fisher | 13-678-20A | 5 & 3/4" |
PDS suture with disposable needle, 6-0 Prolen | Patterson Vet | 8695G | P-3 Reverse Cutting, 18" |
PE-Streptavidin | BD Biosciences | 554061 | |
Pipetters | Eppendorf | Research seriers | |
Polyethylene tubing | |||
Refrigerated Centrifuge | Beckman Coulter | ALLEGRA X-12R | |
Scale | Uline | H2716 | |
Scalpel | Feather | EF7281 | |
Shaver | Harvard Apparatus | 52-5204 | |
Standard proteins | Any suitable source | The best choice for a reference standard is a purified, known concentration of the protein of interest. | |
Stereotaxic instrument | KOPF Instruments | Model 900LS | Standard Accessories |
Sterile 1 x PBS | Corning Cellgro | 21-040-CV | |
Sterile saline | Baxter | 0338-0048-02 | 0.9 % Sodium Chloride Irrigation USP |
Surgical Forceps Curved, 7 (2) | Fine Science Tools | 11271-30 | Dumont |
Surgical Scissors | Fine Science Tools | 14094-11 | Stainless 25x |
Vaporizer + Flow meter | Moduflex Anhestesia Instruments | ||
Vortex | Fisher | 02-215-414 | |
Warming pad | Kent Scientific Corporation | RT-JR-20 | |
Water Sonicator | Cole Parmer | EW-08895-01 | |
Xylazine | Patterson Vet Supply Inc |