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Medicine

Células progenitoras coronárias e biomarcadores solúveis no prognóstico cardiovascular após angioplastia coronária

doi: 10.3791/60504 Published: January 28, 2020

Summary

O desenvolvimento de grandes eventos cardiovasculares adversos, que afetam o prognóstico cardiovascular após a angioplastia coronariana, são influenciados pela extensão dos danos coronários e reparo vascular. O uso de novos biomarcadores celulares coronários e solúveis, reativos a danos vasculares e reparos, são úteis para prever o desenvolvimento de MACEs e prognósticos.

Abstract

Os principais eventos cardiovasculares adversos (MACEs) impactam negativamente o prognóstico cardiovascular de pacientes submetidos à angioplastia coronariana devido a lesão isquêmica coronariana. A extensão dos danos coronários e os mecanismos de reparação vascular são fatores que influenciam o desenvolvimento futuro dos MACEs. Características vasculares intrínsecas como as características da placa e a complexidade da artéria coronária têm demonstrado informações prognósticos para MACEs. No entanto, o uso de biomarcadores circulantes intracoronários foi postulado como um método conveniente para a identificação precoce e prognóstico dos MACEs, pois refletem mais de perto mecanismos dinâmicos envolvendo danos coronários e reparos. Determinação de biomarcadores circulantes coronários durante a angioplastia, como o número de subpopulações de células progenitoras mononucleares (MPCs), bem como a concentração de moléculas solúveis refletindo inflamação, adesão celular e reparo, permite avaliação de desenvolvimentos futuros e o prognóstico de MACEs 6 meses após a angioplastia coronária. Este método é destacado por sua natureza translacional e melhor desempenho do que biomarcadores circulantes de sangue periféricos em relação à previsão de MACEs e seu efeito sobre o prognóstico cardiovascular, que pode ser aplicado para estratificação de risco dos pacientes com doença arterial coronariana submetida à angioplastia.

Introduction

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A angioplastia coronariana e o stent representam um procedimento de resgate para pacientes com doença arterial coronariana (CAD). No entanto, grandes eventos cardiovasculares adversos (MACEs), incluindo morte cardiovascular, infarto do miocárdio, restenose coronariana e episódios de angina ou insuficiência cardíaca descompensada, podem ocorrer meses após a intervenção coronária, provocando visitas não programadas ao hospital. MacEs são comuns em todo o mundo e sua morbi-mortalidade é alta1.

A lesão isquêmica coronariana induz a resposta vascular precoce e mecanismos reparativos envolvendo mobilização de MPCs devido à sua capacidade de diferenciação e/ou potencial de angioção-reparative, bem como a produção de moléculas solúveis como moléculas de adesão intercelular (ICAMs), metaloproteinases matrizes (MMPs) e espécies de oxigênio reativa, refletindo adesão celular, remodelação de tecidos e estresse oxidativo. Embora características vasculares intrínsecas como características da placa e complexidade arterial coronariana tenham sido utilizadas para prever MACEs, alguns estudos têm sugerido que biomarcadores relacionados aos mecanismos de lesão e reparo que ocorrem no endotelo coronário poderiam ser muito úteis para a identificação precoce e prognóstico de eventos cardiovasculares em pacientes com CAD submetidos à angioplastia coronariana2,3,4,5.

O interesse contínuo em entender os mecanismos subjacentes à lesão cad e reparo tem motivado os investigadores a estudar biomarcadores circulantes intracoronários, pois a amostragem coronária reflete mais de perto danos vasculares e reparos6. No entanto, a caracterização de biomarcadores coronários em estudos humanos tem sido escassa7,8,9. Portanto, o objetivo do presente estudo foi descrever um método para determinar a quantidade de MPCs circulantes coronários e moléculas solúveis, refletindo tanto a lesão vascular quanto a reparação, e mostrar se esses biomarcadores estão associados aos MACEs e ao prognóstico clínico dos pacientes cad que foram submetidos à angioplastia coronária. Este método baseia-se no uso de MPCs e moléculas solúveis relacionadas a vasculares e circulantes obtidas por locais de amostragem mais próximos aos danos causados pelo vaso. Também pode ser útil para estudos clínicos para isquemia de membros inferiores, derrame, vasculite, trombose venosa e outras lesões envolvendo lesão vascular e reparo.

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Protocol

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Esse protocolo atende às diretrizes institucionais do Comitê de Ética em Pesquisa Humana.

1. Angiografia Coronariana, Ultrassom e Amostragem de Sangue

  1. Solicite informações clínicas e demográficas de linha de base antes da intervenção coronária. Coleta os dados do indivíduo: idade, sexo, estado atual de tabagismo, índice de massa corporal (IMC), pressão alta, dislipidemia, diabetes mellitus, medicamentos e a indicação para a angiografia coronariana atual.
  2. Realizar angiografia coronariana através do cateterismo cardíaco usando uma abordagem radial. Esse procedimento deve ser realizado um guia de fluoroscopia na sala de hemodinâmica por cardiologistas especialistas.
    NOTA: Identifique embarcações valiosas. Para o presente estudo, os vasos valiosos foram definidos como artérias com seções maiores que 1,5 mm e estenose de lúmen de mais de 50%.
  3. Avance o cateter de ultrassom intravascular para a região de interesse e grave imagens. Use o software apropriado para localizar e medir a menor área luminal.
  4. Use um cateter coronário para coletar 10 mL de sangue do local mais próximo da placa.
  5. Após a alta do paciente, agendar avaliações médicas periódicas para acompanhar os pontos finais do estudo. Se o contato telefônico não for possível ou uma visita médica for adiada por mais de 2 meses, solicite uma pessoa autorizada (previamente projetada) para verificar os pontos finais do estudo.
    NOTA: Considere qualquer um dos seguintes MACE: 1) morte cardiovascular, 2) novo infarto do miocárdio, 3) angina instável que levou a uma consulta médica não programada dentro de 24 h, 4) restenose stent como demonstrado pela angiografia coronariana, 5) episódios de descompensados insuficiência cardíaca exigindo atenção clínica.

2. Determinação dos MPCs circulantes (Figura 2)

  1. Processe o sangue dentro de 1h da coleta. Transfira 6 mL do sangue coletado para um tubo cônico de 15 mL e dilua 1:1 (v/v) com soro fisiológico 1x fosfato (PBS), pH = 7,4.
  2. Adicione 2 mL de média gradiente de densidade a três tubos de ensaio. Transfira cuidadosamente três alíquotas de volume igual de sangue diluído em cada tubo de ensaio contendo o meio gradiente de densidade.
    NOTA: O volume total de gradiente de densidade médio e sangue diluído não deve exceder três quartos da capacidade máxima do tubo de ensaio.
  3. Centrífuga a 1.800 x g, 4 °C por 30 min. Transfira a banda na interface entre as camadas para um novo tubo. Adicione 2 mL de PBS e centrífuga sem 1.800 x g,4 °C para 6 min. A pelota conterá os MPCs.
  4. Lave a pelota várias vezes. Aspirar a solução anterior e suspender suavemente a pelota celular em PBS fresco. Para as gestões subsequentes, centrífuga a 1.800 x g, 4 °C por 2 min. Repita o processo 6x.
  5. Resuspender a pelota de celular em 1 mL de PBS. Misture 20 μL da suspensão celular com 0,4% azul trypan, diluído 1:1 (v/v). Aplique uma gota em um hemocímetro e conte as células não manchadas um microscópio leve.
  6. Prossiga para a determinação dos MPCs. Rotular tubos de citometria de fluxo de 5 mL e aliquot out 1 x 106 células por tubo. Prepare os anticorpos de controle correspondentes com fósforo de isotipo. Centrífuga a 1.800 x g, 4 °C por 6 min e descartar o supernatante.
  7. Adicione o anticorpo primário diluído em 100 μL de uma solução de incubação de anticorpos composta por 1x PBS (pH = 7,4), 2 mM ácido etilenodiaminatetracético (EDTA) e 0,05% de albumina de soro bovino (BSA). Resuspender por 10 s e incubar por 20 min a 4 °C, protegido pela luz. O protocolo pode ser pausado nesta etapa, fixando os linfócitos em 4% paraformaldeídos na PBS e armazenando amostras até 24 h a 4°C.
    NOTA: As concentrações finais dos anticorpos primários utilizados no protocolo atual foram CD45 1:50, CD34 1:20, KDR 1:50, CD184 1:20, CD133 1:50.
  8. Centrífuga a 1.800 x g, 4 °C por 2 min e descartar o supernatante. Resuspender em 500 μL de 1x PBS (pH = 7,4), 2 mM EDTA.
  9. Realizar análise de citometria de fluxo. Use anticorpos de controle com fósforo de isotipo para configurar a coloração de fundo. Em seguida, selecione linfócitos espalhados na trama fsc/SSC, tentando excluir granulocitos residuais, detritos celulares e outras partículas, que geralmente estão localizadas na parte inferior, deixada distribuída na trama. Tal distribuição é considerada 100%.
  10. Use um portão contendo um alto número de células com imunofenótipo comum CD45+ e CD34+. Para imunofenótipos duplos positivos, use um portão de identificação anterior de CD45+,CD34+, com a adição de KDR (VEGFR-2)+,CD133+, ou CD184+. Identifique as subpopulações do MPC por seus marcadores específicos de superfície celular. Reporte como a porcentagem de eventos fechados.
  11. Identifique as principais subpopulações de MPCs. No presente estudo os principais imunofenótipos foram CD45+CD34+CD133+,CD45+CD34+CD184+,CD45+CD34+CD133+C Dd184+,CD45+CD34+KDR+, CD45+CD34+KDR+CD133+, e CD45+CD34+KDR+CD184.
    NOTA: Os marcadores de superfície celular utilizados foram CD45 (linfócitos), CD34 (células endoteliais e/ou vasculares), KDR (VEGFR-2, marcador de membrana de células endoteliais), CD133 (células progenitoras endoteliais) e CD184 (células-tronco hematopoiéticas e células-tronco endoteliálas).

3. Determinação de Biomarcadores Solúveis de Plasma

  1. Use um ensaio imunosorbent ligado à enzima (ELISA) para determinar a concentração de SICAM-1 e MMP-9 (Figura 3,linha superior).
    1. Centrífuga as amostras de sangue a 3.000 x g,temperatura ambiente para 5 min e coletar o plasma.
    2. Rotular os padrões, tubos de amostra e tubos de controle. Equilibre os poços pré-revestidos na placa de ensaio lavando 2x com o tampão de lavagem fornecido no kit ELISA.
    3. Transfira os padrões, amostras e controles para os poços. Vedae e incuba a 37 °C por 90 min.
      NOTA: Não deixe os poços secarem completamente.
    4. Descarte o conteúdo e adicione o anticorpo de detecção de biotina. Vedae e incuba a 37 °C por 60 min.
    5. Descarte o conteúdo e lave 3x. Selar a placa e incubar sequencialmente com solução de trabalho de streptadina seguida de substrato tetrametilbenzidina a 37 °C por 30 min, protegido por luz. Lave 3x entre incubações. Quando a cor se desenvolver, adicione a solução de parada e leia a absorção de densidade óptica em um leitor ELISA microplacado.
  2. Use um ensaio imunomagnético multiplexante para determinar a concentração do fator necrose tumoral alfa (TNFα) e interleucina 1 beta (IL-1β) (Figura 3,linha inferior).
    1. Rotular os padrões, tubos de amostra e tubos de controle.
    2. Vórtice os frascos de contas magnéticas por 30 s. Transfira a suspensão da contas para tubos de tamanho adequado e, em seguida, para os poços na placa de ensaio multiplexeto. O vórtice periódico evita a precipitação das contas.
    3. Insira com segurança a lavadora de placas magnéticas portáteis. Espere 2 min para que as contas se acumulem na parte inferior de cada poço e invertam rapidamente tanto a lavadora de placas magnéticas portáteis quanto o conjunto de placas, sobre uma pia ou recipiente de resíduos. Lembre-se de usar a lavadora de placas magnéticas portátil para manter as contas dentro dos poços.
    4. Adicione 150 μL de tampão de lavagem em cada poço e espere 30 s para permitir que as contas se acumulem na parte inferior. Descarte o conteúdo como na etapa 3.2.3. Em seguida, adicione 25 μL de buffer de ensaio universal (fornecido no kit) seguido por 25 μL de padrões, amostras e controles preparados.
    5. Selar a placa e incubar por pelo menos 60 min à temperatura ambiente, protegido pela luz, com constante agitação a 500 rpm. Alternativamente, incuba durante a noite a 4 °C, iluminado, com constante agitação a 500 rpm, se possível.
    6. Lave 2x adicionando 150 μL de tampão de lavagem e espere 30 s. Descarte o conteúdo inserindo a lavadora de placa magnética portátil. Espere 2 min e inverta sobre uma pia ou recipiente de lixo.
    7. Incubasequencialmente com 25 μL de mistura de anticorpos de detecção seguido por 25 μL de solução streptavidin-PE a temperatura ambiente por 30 min, lacrada e protegida pela luz, com tremor constante a 500 rpm. Lave 2x entre incubações, conforme descrito na etapa 3.2.6.
    8. Obtenha as leituras. Adicione 120 μL de tampão de leitura. Selar a placa e incubar 5 min à temperatura ambiente, protegido pela luz, com tremor constante a 500 rpm. Faça a leitura em um leitor de ensaios multiplexing. Ajuste os parâmetros de leitura de acordo com cada anestesia.

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Representative Results

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O sangue coronário, venoso e periférico foram coletados de 52 pacientes submetidos à angiografia coronariana (Figura 1)e apresentaram alta prevalência de hipertensão e dislipidemia. No acompanhamento clínico, 11 (21,1%) MacEs ocorreu 6 meses após angiografia coronariana: morte (n = 1), angina que exige atendimento hospitalar (n = 6), infarto do miocárdio (n = 2) e/ou evidência de insuficiência cardíaca (n = 4).

A concentração coronária da linha de base da maioria dos CCs foi significativamente menor em pacientes que desenvolveram MACEs (Figura 4),com maior diminuição nas subpopulações do MPC CD34+CD133+ e CD45+CD34+CD133+CD184+. Da mesma forma, os pacientes que desenvolveram MACEs apresentaram aumento da linha de base em quantidades coronárias de sICAM-1 e MMP-9 inferior (Tabela 1).

MPCs coronários (subpopulações CD45+CD34+CD133+ e CD45+CD34+CD133+CD184+) e sICAM-1 (dicotomizada por seus valores medianos) demonstraram capacidade de prognóstico para sobrevivência livre de MACE(Figura 5).

Caracterizamos ainda a dinâmica dos biomarcadores solúveis em diferentes condições, pois há muito pouca informação sobre a determinação do sangue coronário. A expressão do fator necrose tumoral alfa (TNFα) apresentou variações de acordo com o tempo de medição (pré ou pós-angioplastia) e a localização da amostragem coronária baseada na comparação de diferentes áreas de lúmen na mesma artéria coronária usando ultrassom intravascular(Figura 6).

Figure 1
Figura 1: angiografia coronariana e coleta de sangue. A imagem mostra cateterismo cardíaco usando uma abordagem radial, realizada um guia de fluoroscopia na sala de hemodinâmica. Especialistas em cardiologia avaliam os vasos coronários durante a angiografia e coletam sangue coronário do local mais próximo da placa de aterro e/ou sangue sinuso através de um cateter cardíaco pouco antes da angioplastia de balão. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 2
Figura 2: Preparação de amostras de sangue e determinação de MPCs por citometria de fluxo. (A) Gradiente de densidade após centrífuga de sangue (seta azul = banda linfócito). (B)Coleção da fase linfócito. (C) Lava-tacada com 1x PBS. (D) Centrífuga. (E)Formação de pelotas na parte inferior do tubo de ensaio. (F)Carga de suspensão celular neubauer. (G)Contagem de células linfócitos usando microscopia leve. (H)Determinação das subpopulações celulares por citometria de fluxo. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 3
Figura 3: Imunoensaios para determinar mediadores solúveis de sangue. Linha superior: Ensaio imunosorbent ligado à enzima (ELISA). A imagem mostra como as informações das amostras do mapa (notebook) foram transferidas para o software para iniciar as leituras após a preparação da amostra, incubação de anticorpos e lava. Também mostra desenvolvimento de cores amarelas, seja nos poços padrão (colunas esquerdas na placa) ou nas amostras de teste (colunas direitas na placa). Linha inferior: Ensaio multiplexante imunomagnético. Após a preparação da amostra, incubação de anticorpo magnético e lava-fitas, as informações da amostra foram transferidas para o software apropriado do leitor de ensaios imunomagnéticos, e uma curva padrão típica é mostrada na tela. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 4
Figura 4: Células progenitoras mononucleares circulantes pela coronária (MPCs). O número mostra subpopulações de %MPCs. (A)Leituras representativas da citometria do fluxo. (B) Quantificação de subpopulações de %MPCs com citometria de fluxo, traçada de acordo com a apresentação de MACEs (*) = diferença significativa, com p < 0,05. Este número foi modificado de Suárez-Cuenca et al.10. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 5
Figura 5: Celular circulante coronário (MPCs), biomarcadores solúveis e prognóstico. O número mostra quantidades de sangue coronário de linha de base de subpopulações(A)%MPCs determinadas por citometria de fluxo e(B)concentração plasmática do SICAM-1 determinada pela ELISA, ambas traçadas de acordo com a apresentação de MACEs durante o seguimento de 6 meses. A linha azul indica o número de indivíduos com valores de risco para cada biomarcador, como %MPCs mais baixos ou sICAM-1 mais elevado. sICAM-1 = molécula de adesão intercelular solúvel 1. Este número foi modificado de Suárez-Cuenca, et al.10. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Figure 6
Figura 6: Condições que determinam a variabilidade dos biomarcadores solúveis coronariais circulantes. A figura apresenta alterações na concentração intracoronária do fator necrose tumoral alfa (TNFα), de acordo com o tempo de medição (A: Pré-angioplastia ou B: Pós-angioplastia) bem como a localização da amostragem coronária (comparação entre dois diâmetros lúmencorários em um corte de 3,5 mm, medido por ultrassom intravascular). =p < 0,05 diferença de biomarcadores obtidos pré-vs. pós-angioplastia, e diferença de amostragem em locais de diâmetros de lúmen coronário ≤3,5 mm vs. >3,5 mm. Este número foi modificado de Suárez-Cuenca et al.11. Clique aqui para ver uma versão maior deste valor.

Table 1
Tabela 1: Biomarcadores solúveis de sangue da linha de base. (*) indica p < 0,05 diferença biomarcadores de sangue coronário versus circulação periférica. (**) indica p < 0,05, sem MACEs vs. com MACEs; T-test independente de uma cauda só. Abreviaturas: sICAM-1 = molécula de adesão intercelular solúvel 1; IL-1β = interleucina 1 beta; MMP-9 = metaloproteinase matriz 9.

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Discussion

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A coleta de sangue da artéria coronária afetada pode ser difícil. Às vezes, a artéria coronária mal é acessível. Neste caso, a amostragem do seio venoso pode ser uma alternativa. Realizamos testes de validação comparando biomarcadores circulantes em artéria coronária versus seio venoso, sem diferenças significativas. No entanto, o desempenho dos biomarcadores circulantes foi validado apenas para amostragem coronária. Portanto, o desempenho dos biomarcadores obtidos a partir do seio venoso continua a ser explorado.

É melhor processar as amostras para MPCs dentro das primeiras 3h após a coleta de sangue. Portanto, uma boa comunicação deve ser estabelecida entre a equipe de cardiologia e os pesquisadores do laboratório. Durante o isolamento dos MPCs, deve-se tomar cuidado ao depositar amostras de sangue durante a preparação de gradiente de densidade ao lavar a pelota dos MPCs. Finalmente, por conveniência, sempre transferimos as células para um tubo de citometria, adicionamos os anticorpos primários, consertamos e armazenamos as células durante a noite a 4 °C, e realizamos a leitura de citometria de fluxo no dia seguinte. Em relação ao papel biomarcador dos MPCs circulantes, esforços importantes têm sido tomados para padronizar os imunofenótipos mais clinicamente úteis entre as células progenitoras12, mas uma limitação do estudo pode ser o fato de que subpopulações específicas de células progenitoras circulantes não foram totalmente caracterizadas para todos os cenários clínicos dentro do CAD ou outras doenças vasculares. Portanto, diferentes subpopulações de células progenitoras circulantes devem ser exploradas em cada estudo.

Durante a determinação de marcadores solúveis algumas recomendações gerais para eLISA e ensaios multiplexing incluem o uso de uma pipeta multicanal, depositar soluções na parte inferior de cada poço sem tocar nas paredes laterais, e evitar a secagem do poços durante o ensaio. Verifique sempre a distribuição da amostra na placa, particularmente para o ensaio multiplexing, para evitar a precipitação das contas magnéticas por vórtices constantes. Além disso, certifique-se de inserir a placa inferior na lavadora de placas magnéticas portáteis para manter as contas magnéticas dentro dos poços, caso contrário as amostras serão perdidas durante as lavantes.

Descobrimos que os MPCs circulantes coronários, principalmente os de origem hematopoiética, bem como o sICAM-1 e o MMP-9, eram biomarcadores excelentes para previsão e prognóstico de MACEs. Isso é consistente com a noção de que mediadores de resposta inflamatória e/ou danos vasculares estimulam sinais de localização para mobilização e recrutamento do MPC, promovendo a reparação local de tecidos4. Assim, encontramos variações nesses biomarcadores em várias configurações. Alterações em relação à angioplastia e/ou localização da amostragem coronária podem ser explicadas pelo efeito do impacto sobre a placa de aterro durante a angioplastia, o tamanho da placa e a liberação de mediadores solúveis seqüetered dentro da placa no fluxo coronário11. O aumento do IL-1β tem sido consistentemente envolvido no desenvolvimento da placa e complicações clínicas13.

Para nosso conhecimento, este é o primeiro estudo que avalia prospectivamente o papel de MPCs circulantes coronários e mediadores solúveis de lesões vasculares e reparo como biomarcadores prognósticos em uma população com CAD submetido à angioplastia coronária, incluindo caracterização de alterações relacionadas à angioplastia, localização da amostragem coronária e comparação de amostragem coronária versus periférica. Achamos que o método pode ser facilmente estabelecido em qualquer hospital realizando angiografia coronariana. No entanto, uma limitação é que aplicamos essa metodologia principalmente em pacientes com angina estável crônica liberada de um pronto-socorro.

Os métodos tradicionais atuais utilizados para previsão ou prognóstico de MACEs no CAD têm capacidade preditiva moderada. Tem havido um crescente interesse em encontrar novos biomarcadores com base nos mecanismos de fisiopatologia responsáveis pela reparação e regeneração que ocorrem após cad e angioplastia. Tais biomarcadores têm mostrado desempenho preditivo semelhante ou melhor em comparação com os métodos tradicionais3,4,5,14,15. Assim, acreditamos que o papel dos MPCs coronariais circulantes e mediadores solúveis na previsão do risco para maces será explorado ainda mais em futuros estudos prospectivos.

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Disclosures

Os autores não têm nada para divulgar.

Acknowledgments

Os autores agradecem o apoio do Programa Institucional E015; e Fondo Sectorial FOSSIS-CONACYT, SALUD-2014-1-233947.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BSA Roche 10735086001 Bovine Serum Albumin (BSA) as a buffering agent, stabilizer, standard and for blending.
Calibration Beads Miltenyi Biotec / MACS #130-093-607 MACQuant calibration beads are supplied in aqueous solution containing 0.05% sodium azide. 3.5 ml for up to 100 tests
CD133/1 (AC133)-PE Milteny Biotec / MACS #130-080-801 Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer
CD184 (CXCR4)-PE-VIO770 Miltenyi Biotec / MACS #130-103-798 Monoclonal, Isotype recombinant human IgG1, conjugated
CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC Miltenyi Biotec / MACS #130-093-601 Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer
CD34-FITC Miltenyi Biotec / MACS #130-081-001 The monoclonal antibody clone AC136 detecs a class III epitope of the CD34
CD45- VioBlue Miltenyi Biotec / MACS #130-092-880 Monoclonal CD45 Antibody, human conjugated
Conical Tubes Thermo SCIENTIFIC #339651 15ml conical centrifuge tubes
Cytometry Tubes FALCON Corning Brand #352052 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube. 12x75 style. Sterile.
EDTA BIO-RAD #161-0729 Heavy metals, (as Pb) <10ppm, Fe <0.01%, As <1ppm, Insolubles <0.005%
Improved Neubauer Without brand Without catalog number Hemocytometer for cell counting. (range 0.1000mm, 0.0025mm2)
K2 EDTA Blood Collection Tubes BD Vacutainer #367863 Lilac plastic vacutainer tube (K2E) 10.8mg, 6 mL.
Lymphoprep Stemcell Technologies 01-63-12-002-A Sterile and checked on the presence of endotoxins. Density: 1.077±0.001g/mL
Paraformaldehyde SIGMA-ALDRICH #SZBF0920V Fixation of biological samples, (powder, 95%)
Pipette Transfer 1,3mL CRM Globe PF1016, PF1015 The transfer pipette is a tool that facilitates liquid transfer with greater accuracy.
Test Tubes KIMBLE CHASE 45060 13100 Heat-resistant test tubes. SIZE/CAP 13 x 100 mm

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References

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Células progenitoras coronárias e biomarcadores solúveis no prognóstico cardiovascular após angioplastia coronária
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Suárez-Cuenca, J. A., Robledo-Nolasco, R., Alcántara-Meléndez, M. A., Díaz-Hernandez, L. J., Vera-Gómez, E., Hernández-Patricio, A., Sánchez-Díaz, K. S., Gutiérrez-Buendía, J. A., Contreras-Ramos, A., Ruíz-Hernández, A. S., Pérez-Cabeza de Vaca, R., Mondragón-Terán, P. Coronary Progenitor Cells and Soluble Biomarkers in Cardiovascular Prognosis after Coronary Angioplasty. J. Vis. Exp. (155), e60504, doi:10.3791/60504 (2020).More

Suárez-Cuenca, J. A., Robledo-Nolasco, R., Alcántara-Meléndez, M. A., Díaz-Hernandez, L. J., Vera-Gómez, E., Hernández-Patricio, A., Sánchez-Díaz, K. S., Gutiérrez-Buendía, J. A., Contreras-Ramos, A., Ruíz-Hernández, A. S., Pérez-Cabeza de Vaca, R., Mondragón-Terán, P. Coronary Progenitor Cells and Soluble Biomarkers in Cardiovascular Prognosis after Coronary Angioplasty. J. Vis. Exp. (155), e60504, doi:10.3791/60504 (2020).

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