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Medicine

Koronare Vorläuferzellen und lösliche Biomarker bei kardiovaskulärer Prognossie nach koronarer Angioplastie

doi: 10.3791/60504 Published: January 28, 2020

Summary

Die Entwicklung von schweren kardiovaskulären Ereignissen, die die kardiovaskuläre Prognose nach der koronaren Angioplastie beeinflussen, wird durch das Ausmaß der koronaren Schäden und der Gefäßreparatur beeinflusst. Die Verwendung neuartiger koronarer zellulärer und löslicher Biomarker, die auf Gefäßschäden und -reparaturen reagieren, sind nützlich, um die Entwicklung von MACEs und Prognosen vorherzusagen.

Abstract

Wichtige unerwünschte kardiovaskuläre Ereignisse (MACEs) wirken sich negativ auf die kardiovaskuläre Prognose von Patienten aus, die aufgrund einer koronaren ischämischen Verletzung einer koronaren Angioplastie unterzogen werden. Das Ausmaß der koronaren Schäden und die Mechanismen der Gefäßreparatur sind Faktoren, die die zukünftige Entwicklung von MACEs beeinflussen. Intrinsische gefäßliche Merkmale wie die Plaqueeigenschaften und die Komplexität der Koronararterie haben prognostische Informationen für MACEs gezeigt. Die Verwendung von intrakoronar zirkulierenden Biomarkern wurde jedoch als bequeme Methode zur Früherkennung und Prognose von MACEs postuliert, da sie dynamische Mechanismen mit koronaren Schäden und Reparaturen stärker widerspiegeln. Die Bestimmung koronar zirkulierender Biomarker während der Angioplastie, wie die Anzahl der Subpopulationen mononuklearer Vorläuferzellen (MPCs) sowie die Konzentration löslicher Moleküle, die Entzündungen, Zellhaftung und -reparatur reflektieren, Bewertung zukünftiger Entwicklungen und Prognose von MACEs 6 Monate nach der koronaren Angioplastie. Diese Methode wird durch ihre translationale Natur und bessere Leistung als periphere blutzirkulierende Biomarker in Bezug auf die Vorhersage von MACEs und ihre Auswirkungen auf die kardiovaskuläre Prognose, die für die Risikoschichtung von Patienten angewendet werden kann, hervorgehoben. mit koronaren Herzkrankheit unter angioplasty.

Introduction

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Koronare Angioplastie und Stents stellen ein Bergungsverfahren für Patienten mit koronaren Herzerkrankungen (CAD) dar. Jedoch, große unerwünschte kardiovaskuläre Ereignisse (MACEs), einschließlich Herz-Kreislauf-Tod, Myokardinfarkt, koronare Restenose, und Episoden von Angina oder Dekompensierung Herzinsuffizienz, kann Monate nach koronaren Eingriff auftreten, was zu ungeplanten Besuchen im Krankenhaus. MACEs sind weltweit verbreitet und ihre Morbi-Sterblichkeit ist hoch1.

Koronare ischämische Verletzungen induzieren eine frühe vaskuläre Reaktion und reparative Mechanismen, die die Mobilisierung von MPCs aufgrund ihrer Differenzierungsfähigkeit und/oder ihres angio-reparativen Potenzials sowie der Produktion von löslichen Molekülen wie interzellulären Adhäsionsmolekülen (ICAMs), Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) und reaktiven Sauerstoffspezies, die die Zelladhäsion, gewebeumbauenund, reflektieren, reflektieren. Obwohl intrinsische gefäßliche Merkmale wie Plaque-Eigenschaften und koronare Arterienkomplexität verwendet wurden, um MACEs vorherzusagen, haben einige Studien vorgeschlagen, dass Biomarker im Zusammenhang mit den Mechanismen der Verletzung und Reparatur im koronaren Endothel sehr nützlich für die frühe Identifizierung und Prognose von kardiovaskulären Ereignissen bei Patienten mit CAD, die koronare Angioplastie2,3,4,5.

Kontinuierliches Interesse am Verständnis der Mechanismen, die CAD-Verletzungen und -Reparaturen zugrunde liegen, hat die Forscher motiviert, intrakoronar zirkulierende Biomarker zu untersuchen, da die koronare Probenahme Gefäßschäden genauer widerspiegelt und6repariert. Die Charakterisierung von koronaren Biomarkern in Studien am Menschen war jedoch knapp7,8,9. Daher bestand der Zweck dieser Studie darin, eine Methode zur Bestimmung der Menge an koronar zirkulierenden MPCs und löslichen Molekülen zu beschreiben, die sowohl Gefäßverletzungen als auch Reparaturen widerspiegeln, und zu zeigen, ob diese Biomarker mit MACEs und der klinischen Prognose von CAD-Patienten, die einer koronaren Angioplastie unterzogen wurden, in Verbindung gebracht werden. Diese Methode basiert auf der Verwendung von vaskulären, zirkulierenden MPCs und löslichen Molekülen, die durch Probenahmevonstellen am nächsten an der Gefäßschädigung gewonnen werden. Es kann auch nützlich sein für klinische Studien für Dieschämien unterden Gliedmaßen, Schlaganfall, Vaskulitis, venöse Thrombose, und andere Verletzungen mit Gefäßverletzungen und Reparatur.

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Protocol

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Dieses Protokoll entspricht den institutionellen Leitlinien der Ethikkommission für die menschliche Forschung.

1. Koronare Angiographie, Ultraschall und Blutentnahme

  1. Fordern Sie klinische und demografische Basisinformationen an, bevor koronare Interventionen vorliegen. Sammeln Sie die Daten des Einzelnen: Alter, Geschlecht, aktueller Raucherstatus, Body-Mass-Index (BMI), Bluthochdruck, Dyslipidämie, Diabetes mellitus, Medikamente und die Indikation für die aktuelle koronare Angiographie.
  2. Führen Sie die koronare Angiographie durch Herzkatheterisierung mit einem radialen Ansatz durch. Dieses Verfahren sollte unter einem Fluoroskopie-Leitfaden im Hämodynamikraum von erfahrenen Kardiologen durchgeführt werden.
    HINWEIS: Identifizieren Sie auswertbare Schiffe. Für die vorliegende Studie wurden auswertbare Gefäße als Arterien mit Abschnitten größer als 1,5 mm und Lumenstenose von mehr als 50 % definiert.
  3. Fördern Sie den intravaskulären Ultraschallkatheter in den Bereich des Interesses und zeichnen Sie Bilder auf. Verwenden Sie die entsprechende Software, um die kleinste Luminalfläche zu lokalisieren und zu messen.
  4. Verwenden Sie einen koronaren Katheter, um 10 ml Blut von der nächstgelegenen Stelle zur Plaque zu sammeln.
  5. Planen Sie nach der Entlassung des Patienten periodische medizinische Bewertungen, um Studienendpunkte zu verfolgen. Wenn ein telefonischer Kontakt nicht möglich ist oder sich ein Arztbesuch um mehr als 2 Monate verzögert, bitten Sie eine autorisierte Person (zuvor entworfen), die Studienendpunkte zu überprüfen.
    ANMERKUNG: Betrachten Sie einen der folgenden MACE: 1) herzkardialen Tod, 2) neuen Myokardinfarkt, 3) instabile Angina, die zu einem außerplanmäßigen Arztbesuch innerhalb von 24 h, 4) Stent-Restenose führt, wie die koronare Angiographie zeigt, 5) Episoden von dekompensierten Herzinsuffizienz, die klinische Aufmerksamkeit erfordert.

2. Bestimmung der zirkulierenden MPCs (Abbildung 2)

  1. Verarbeiten Sie das Blut innerhalb von 1 h aus der Sammlung. 6 ml des gesammelten Blutes in ein 15 ml konisches Rohr geben und 1:1 (v/v) mit 1x Phosphatgepufferter Saline (PBS), pH = 7,4 verdünnen.
  2. Fügen Sie 2 ml Dichtegradientenmedium zu drei Reagenzgläsern hinzu. Übertragen Sie vorsichtig drei gleich große Volumen-Aliquots verdünntes Blut in jedes Reagenzglas, das das Dichtegradientenmedium enthält.
    HINWEIS: Das Gesamtvolumen des Dichtegradienten mittleres und verdünntes Blut sollte drei Viertel der maximalen Kapazität des Reagenzglases nicht überschreiten.
  3. Zentrifuge bei 1.800 x g, 4 °C für 30 min. Übertragen Sie das Band an der Schnittstelle zwischen den Schichten in ein neues Rohr. Fügen Sie 2 ml PBS und Zentrifuge bei 1.800 x g, 4 °C für 6 min. Das Pellet enthält die MPCs.
  4. Waschen Sie das Pellet mehrmals. Die vorherige Lösung absaugen und das Zellpellet in frischem PBS vorsichtig wieder aufhängen. Für nachfolgende Wähehen Zentrifuge bei 1.800 x g,4 °C für 2 min. Wiederholen Sie den Vorgang 6x.
  5. Setzen Sie das Zellpellet in 1 ml PBS wieder auf. Mischen Sie 20 l der Zellsuspension mit 0,4% Trypan blau, verdünnt 1:1 (v/v). Tragen Sie einen Tropfen auf ein Hämozytometer auf und zählen Sie die ungefärbten Zellen unter einem Lichtmikroskop.
  6. Fahren Sie mit der MPCs-Bestimmung fort. Etikettieren Sie 5 ml Durchflusszytometrieröhrchen und aliquotout aus 1 x 106 Zellen pro Röhre. Bereiten Sie die entsprechenden isotypübereinstimmenden Kontrollantikörper vor. Zentrifuge bei 1.800 x g, 4 °C für 6 min und den Überstand entsorgen.
  7. Fügen Sie den primären Antikörper hinzu, der in 100 l einer Antikörper-Inkubationslösung verdünnt wurde, die aus 1x PBS (pH = 7,4), 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) und 0,05% Rinderserumalbumin (BSA) besteht. 10 s aufsetzen und 20 min bei 4 °C lichtgeschützt inkubieren. Das Protokoll kann bei diesem Schritt angehalten werden, indem die Lymphozyten in 4% Paraformaldehyd in PBS fixiert und Proben bis zu 24 h bei 4 °C gelagert werden.
    HINWEIS: Die letzten Konzentrationen der primären Antikörper, die im vorliegenden Protokoll verwendet wurden, waren CD45 1:50, CD34 1:20, KDR 1:50, CD184 1:20, CD133 1:50.
  8. Zentrifuge bei 1.800 x g, 4 °C für 2 min und den Überstand entsorgen. Resuspend in 500 l mit 1x PBS (pH = 7,4), 2 mM EDTA.
  9. Führen Sie eine Flusszytometrieanalyse durch. Verwenden Sie isotypübereinstimmende Kontrollantikörper, um die Hintergrundfärbung einzurichten. Wählen Sie dann Lymphozyten aus, die sich im FSC/SSC-Plot ausbreiten und versuchen, Restgranulozyten, Zellablagerungen und andere Partikel auszuschließen, die sich normalerweise im unteren, links verteilten Diagramm befinden. Eine solche Verteilung wird als 100% betrachtet.
  10. Verwenden Sie ein Tor, das eine hohe Anzahl von Zellen mit dem gemeinsamen Immunophenotyp CD45+ und CD34+enthält. Verwenden Sie für doppelt positive Immunophenotypen ein Gate, das zuvor CD45+, CD34+identifiziert, wobei entweder KDR (VEGFR-2)+, CD133+oder CD184+hinzufügt sind. Identifizieren Sie die MPC-Subpopulationen anhand ihrer spezifischen Zelloberflächenmarker. Melden Sie sich als Prozentsatz der Gated-Ereignisse.
  11. Identifizieren Sie die wichtigsten Teilpopulationen von MpCs. In der vorliegenden Studie waren die wichtigsten Immunophenotypen CD45+CD34+CD133+, CD45+CD34+CD184+, CD45+CD34+CD184+, CD45+CD34+KDR+, CD45+CD34+KDR+CD133+und CD45+CD34+KDR+CD184.
    HINWEIS: Die verwendeten Zelloberflächenmarker waren CD45 (Lymphozyten), CD34 (endotheliale und/oder vaskuläre Zellen), KDR (VEGFR-2, Membranmarker von Endothelzellen), CD133 (endotheliale Vorläuferzellen) und CD184 (hämatopoetische Stammzellen und Endothelzellen).

3. Bestimmung von plasmalöslichen Biomarkern

  1. Verwenden Sie einen enzymgebundenen Immunsorbent-Assay (ELISA), um die Konzentration von SICAM-1 und MMP-9 zu bestimmen(Abbildung 3, obere Reihe).
    1. Zentrifugieren Sie die Blutproben bei 3.000 x g,Raumtemperatur für 5 min und sammeln Sie das Plasma.
    2. Beschriften Sie die Normen, Probenröhrchen und Steuerröhrchen. Die vorbeschichteten Brunnen in der Assayplatte durch Waschen des 2x mit dem im ELISA-Kit enthaltenen Waschpuffer ausdemaieren.
    3. Übertragen Sie die Standards, Proben und Kontrollen auf die Brunnen. Bei 37 °C 90 min versiegeln und inkubieren.
      HINWEIS: Lassen Sie die Brunnen nicht vollständig trocknen.
    4. Entsorgen Sie den Inhalt und fügen Sie den Biotin-Detektionsantikörper hinzu. Bei 37 °C 60 min versiegeln und inkubieren.
    5. Entsorgen Sie den Inhalt und waschen Sie 3x. Versiegeln Sie die Plaque und inkubieren Sie nacheinander mit Streptavidin-Arbeitslösung gefolgt von Tetramethylbenzidin-Substrat bei 37 °C für 30 min, lichtgeschützt. Waschen Sie 3x zwischen Inkubationen. Wenn sich die Farbe entwickelt, fügen Sie die Stop-Lösung hinzu und lesen Sie die optische Dichteabsorption in einem Mikroplatten-ELISA-Reader.
  2. Verwenden Sie einen immunmagnetischen Multiplexing-Test, um die Konzentration des Tumornekrosefaktors alpha (TNF) und Interleukin 1 beta (IL-1) zu bestimmen (Abbildung 3, untere Reihe).
    1. Beschriften Sie die Normen, Probenröhrchen und Steuerröhrchen.
    2. Wirbel die magnetischen Perlen Fläschchen für 30 s. Übertragen Sie die Perlensuspension auf entsprechend große Rohre, und dann auf die Brunnen in der Multiplexing-Assay-Platte. Periodische Wirbel vermeidet Niederschlag der Perlen.
    3. Setzen Sie die handgehaltene Magnetplattenscheibe sicher ein. Warten Sie 2 min, bis sich die Perlen auf dem Boden jedes Brunnens ansammeln und sowohl die handgehaltene Magnetische Plattenscheibe als auch die Plattenmontage schnell über einem Waschbecken oder Abfallbehälter umkehren. Denken Sie daran, die handgehaltene magnetische Plattenscheibe zu verwenden, um die Perlen in den Brunnen zu halten.
    4. Fügen Sie 150 L Waschpuffer in jeden Brunnen und warten Sie 30 s, damit sich die Perlen auf der Unterseite ansammeln. Verwerfen Sie den Inhalt wie in Schritt 3.2.3. Fügen Sie dann 25 L universellen Assay-Puffer (im Kit vorgesehen) hinzu, gefolgt von 25 L vorbereiteten Standards, Proben und Kontrollen.
    5. Versiegeln Sie die Platte und brüten Sie für mindestens 60 min bei Raumtemperatur, lichtgeschützt, mit konstantem Schütteln bei 500 Rpm. Alternativ über Nacht bei 4 °C bebrüten, lichtgeschützt, möglichst bei 500 Umdrehungen von 15.00 Uhr.
    6. Waschen Sie 2x durch Zugabe von 150 l Waschpuffer und warten Sie 30 s. Entsorgen Sie den Inhalt durch Einsetzen der handgehaltenen magnetischen Plattenscheibe. Warten Sie 2 min und invertieren Sie über ein Waschbecken oder einen Abfallbehälter.
    7. Sequenziell mit 25 l Detektions-Antikörpergemisch, gefolgt von 25 L Streptavidin-PE-Lösung bei Raumtemperatur für 30 min, versiegelt und lichtgeschützt, mit konstantem Schütteln bei 500 Umdrehungen pro Minute inkubieren. 2x zwischen Inkubationen waschen, wie in Schritt 3.2.6 beschrieben.
    8. Erhalten Sie die Messwerte. Fügen Sie 120 L Lesepuffer hinzu. Versiegeln Sie die Platte und bebrüten 5 min bei Raumtemperatur, lichtgeschützt, mit konstantem Schütteln bei 500 Umdrehungen von 15.00 Uhr. Führen Sie die Lesung auf einem Multiplexing-Assay-Reader aus. Passen Sie die Messparameter entsprechend jedem Analyten an.

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Representative Results

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Koronare, venöse Sinus und peripheres Blut wurden von 52 Patienten entnommen, die einer koronaren Angiographie unterzogen wurden (Abbildung 1) und eine hohe Prävalenz von Bluthochdruck und Dyslipidämie zeigten. Bei der klinischen Nachbeobachtung wurden 11 (21,1%) MACEs traten 6 Monate nach koronarer Angiographie auf: Tod (n = 1), Angina, die einen Krankenhausaufenthalt erfordert (n = 6), Myokardinfarkt (n = 2) und/oder Hinweise auf Herzinsuffizienz (n = 4).

Die koronare Ausgangskonzentration der meisten MPC war bei Patienten, die MACEs entwickelten , signifikant niedriger (Abbildung 4), mit einem größeren Rückgang der MPC-Subpopulationen CD34+CD133+ CD45+CD34+CD133+CD184 + CD184+. Ebenso hatten Patienten, die MACEs entwickelten, eine erhöhte Ausgangsbasis in koronaren Mengen von sICAM-1 und niedrigerem MMP-9 (Tabelle 1).

Koronare MPCs (Subpopulationen CD45+CD34+CD133+ CD45+CD34+CD133+CD184+) und sICAM-1 (dichotomisiert durch ihre Medianwerte) zeigten prognostische Fähigkeit für das MACE-freie Überleben (Abbildung 5).

Darüber hinaus charakterisierten wir die Dynamik von löslichen Biomarkern unter verschiedenen Bedingungen, da es nur sehr wenige Informationen über die koronare Blutbestimmung gibt. Die Expression des Tumornekrosefaktors alpha (TNF) zeigte Variationen je nach Messzeitpunkt (Prä- oder Postangioplastie) und der Lage der koronaren Probenahme auf der Grundlage eines Vergleichs verschiedener Lumenbereiche an derselben Koronararterie mit intravaskulärem Ultraschall (Abbildung 6).

Figure 1
Abbildung 1: Koronare Angiographie und Blutentnahme. Das Bild zeigt die Herzkatheterisierung mit einem radialen Ansatz, der unter einer Fluoroskopie-Führung im Hämodynamikraum durchgeführt wird. Kardiologie-Experten bewerten die Herzkranzgefäße während der Angiographie und sammeln koronares Blut vom nächstgelegenen Ort zur Atherom-Plakette und/oder Sinusblut durch einen Herzkatheter kurz vor der Ballonangioplastie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 2
Abbildung 2: Blutprobenvorbereitung und MPCs-Bestimmung durch Durchflusszytometrie. (A) Dichtegradient nach Blutzentrifugation (blauer Pfeil = Lymphozytenband). (B) Sammlung der Lymphozytenphase. (C) Wäwasse mit 1x PBS. (D) Zentrifugation. (E) Pelletbildung am Boden des Reagenzglases. (F) Neubauer Zellaufhängungslast. (G) Lymphozytenzellzahl mittels Lichtmikroskopie. (H) Bestimmung der Zellsubpopulationen durch Durchflusszytometrie. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 3
Abbildung 3: Immunoassays zur Bestimmung blutlöslicher Mediatoren. Obere Reihe: Enzymgebundener Immunsorbent-Assay (ELISA). Das Bild zeigt, wie Informationen aus den Kartenbeispielen (Notebook) an die Software übertragen wurden, um die Messwerte nach Probenvorbereitung, Antikörperinkubation und Wäbungen zu starten. Es zeigt auch gelbe Farbentwicklung, entweder in den Standardbrunnen (linke Spalten in der Plaque) oder in den Testproben (rechte Spalten in der Plaque). Untere Reihe: Immunmagnetischer Multiplexing-Assay. Nach Probenvorbereitung, magnetischer Bead-Antikörper-Inkubation und Wähinformationen wurden die Probeninformationen an die entsprechende immunmagnetische Multiplexing-Assay-Systemlesersoftware übertragen und eine typische Standardkurve im Bildschirm angezeigt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 4
Abbildung 4: Koronarzirkulierende mononukleäre Vorläuferzellen (MPCs). Die Abbildung zeigt die Basiswerte %MPCs. (A) Repräsentative Messwerte aus der Durchflusszytometrie. (B) Quantifizierung von %MPCs-Subpopulationen mit Durchflusszytometrie, nach Darstellung von MACEs (*) = signifikanter Unterschied, mit p < 0,05. Diese Zahl wurde von Suérez-Cuenca et al.10geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 5
Abbildung 5: Koronar zirkulierende zelluläre (MPCs), lösliche Biomarker und Prognose. Die Abbildung zeigt die von ELISA ermittelten koronaren Blutmengen von (A) %MPCs, die durch Durchflusszytometrie und (B) Plasmakonzentration von sICAM-1 bestimmt werden, die beide nach darstellung der MACEs während der 6-monatigen Nachbeobachtungszeit dargestellt werden. Die blaue Linie gibt die Anzahl der Personen mit Risikowerten für jeden Biomarker an, z. B. niedrigere %MPCs oder höhere sICAM-1. sICAM-1 = lösliches interzelluläres Adhäsionsmolekül 1. Diese Zahl wurde von Suérez-Cuenca, et al.10geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Figure 6
Abbildung 6: Bedingungen zur Bestimmung der Variabilität der koronaren zirkulierenden löslichen Biomarker. Die Abbildung zeigt Veränderungen in der intrakoronaren Konzentration des Tumornekrosefaktors alpha (TNF), entsprechend dem Zeitpunkt der Messung(A: Präangioplastie oder B: Postangioplastie) sowie die Lage der koronaren Probenahme (Vergleich zwischen zwei koronaren Lumendurchmessern bei einem 3,5 mm Cutoff, gemessen durch intravaskulären Ultraschall). (*) = p < 0,05 Unterschied der vor- und nachderangioplasty erhaltenen Biomarker und Differenz der Probenahme an den Orten der koronaren Lumendurchmesser von 3,5 mm vs. >3,5 mm. Diese Zahl wurde von Suérez-Cuenca et al.11geändert. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.

Table 1
Tabelle 1: Blutlösliche Biomarker. (*) zeigt p < 0,05 Differenz-Biomarker aus koronarem Blut und peripherer Durchblutung an. (**) zeigt p < 0,05, ohne MACEs im Vergleich zu MACEs; einseitigen unabhängigen T-Test. Abkürzungen: sICAM-1 = lösliches interzelluläres Adhäsionsmolekül 1; IL-1- = Interleukin 1 Beta; MMP-9 = Matrix-Metalloproteinase 9.

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Discussion

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Die Blutentnahme aus der betroffenen Herzkranzgefäße kann schwierig sein. Manchmal ist die Herzkranzgefäße kaum zugänglich. In diesem Fall kann die Probenahme aus der venösen Sinus eine Alternative sein. Wir führten Validierungstests durch, in denen zirkulierende Biomarker in der Herzkranzgefäße mit venösen Sinus verglichen wurden, ohne signifikante Unterschiede. Die Leistung zirkulierender Biomarker wurde jedoch nur für koronare Proben validiert. Daher muss die Leistung von Biomarkern, die aus der venösen Sinus gewonnen werden, noch erforscht werden.

Es ist am besten, die Proben für MPCs innerhalb der ersten 3 h nach der Blutentnahme zu verarbeiten. Daher sollte eine gute Kommunikation zwischen dem Kardiologie-Team und den Laborforschern hergestellt werden. Während der Isolierung von MFC ist bei der Ablagerung von Blutproben während der Dichtegradientenvorbereitung beim Waschen des MPCs-Pellets Vorsicht geboten. Schließlich übertragen wir aus Bequemlichkeit immer Zellen in ein Zytometrierohr, fügen die primären Antikörper hinzu, fixieren und speichern die Zellen über Nacht bei 4 °C und führen die Durchflusszytometrie am Tag danach aus. In Bezug auf die Biomarker-Rolle zirkulierender MPCs wurden wichtige Anstrengungen unternommen, um die klinisch nützlichsten Immunophenotypen zwischen Dengenerationitorenzellen12zu standardisieren, aber eine Einschränkung der Studie kann die Tatsache sein, dass bestimmte Subpopulationen zirkulierender Vorläuferzellen nicht vollständig für alle klinischen Szenarien innerhalb von CAD oder anderen Gefäßerkrankungen charakterisiert wurden. Daher sollten in jeder Studie verschiedene zirkulierende Vorläuferzellsubpopulationen untersucht werden.

Bei der Bestimmung der löslichen Marker umfassen einige allgemeine Empfehlungen für ELISA- und Multiplexing-Assays die Verwendung einer Mehrkanalpipette, das Ablegen von Lösungen an der Unterseite jedes Brunnens, ohne die Seitenwände zu berühren, und die Vermeidung des Austrocknens der Brunnen während des Assays. Überprüfen Sie immer die Probenverteilung in der Platte, insbesondere für den Multiplexing-Assay, um eine Ausfällung der Magnetischen Perlen durch konstantes Wirbeln zu vermeiden. Achten Sie auch darauf, die Bodenplatte in die handgehaltene magnetische Plattenscheibe einzulegen, um die magnetischen Perlen in den Brunnen zu erhalten, da sonst die Proben während der Wäsche verloren gehen.

Wir fanden heraus, dass koronare zirkulierende MPCs, hauptsächlich solche hämatopoetischen Ursprungs, sowie sICAM-1 und MMP-9 hervorragende Biomarker für die Vorhersage und Prognose von MACEs waren. Dies steht im Einklang mit der Vorstellung, dass Entzündungsreaktionen und/oder Gefäßschäden Mediatoren homing Signale für MPC-Mobilisierung und Rekrutierung stimulieren, Förderung der lokalen Gewebereparatur4. Dementsprechend fanden wir Variationen in diesen Biomarkern in mehreren Einstellungen. Veränderungen in Bezug auf die Angioplastie und/oder die Lage der koronaren Probenahme können durch die Auswirkungen des Aufpralls auf die Atherom-Plakette während der Angioplastie, die Größe der Plaque und die Freisetzung von löslichen Mediatoren erklärt werden, die innerhalb der Plaque in den koronaren Fluss11eingebunden sind. Erhöhte IL-1, wurde konsequent an der Entwicklung der Plaque und klinischen Komplikationen beteiligt13.

Unserer Kenntnis nach ist dies die erste Studie, die prospektiv die Rolle von koronar zirkulierenden MPCs und löslichen Mediatoren von Gefäßverletzungen und -reparaturen als prognostische Biomarker in einer Population mit CAD bewertet, die der koronaren Angioplastie unterzogen wird, einschließlich Charakterisierung von Veränderungen im Zusammenhang mit der Angioplastie, der Lage der koronaren Probenahme und dem Vergleich von koronaren und peripheren Probennahmen. Wir denken, dass die Methode leicht in jedem Krankenhaus etabliert werden kann, das koronare Angiographie durchführt. Eine Einschränkung ist jedoch, dass wir diese Methode hauptsächlich bei Patienten mit chronisch stabiler Angina angewendet haben, die aus einer Notaufnahme entlassen wurden.

Aktuelle traditionelle Methoden, die für MACEs-Vorhersage oder Prognose in CAD verwendet werden, weisen eine moderate Vorhersagefähigkeit auf. Das Interesse an der Suche nach neuartigen Biomarkern, die auf den pathophysiologischen Mechanismen basieren, die für die Reparatur und Regeneration nach CAD und Angioplastie verantwortlich sind, ist gestiegen. Solche Biomarker haben eine ähnliche oder bessere Vorhersageleistung im Vergleich zu herkömmlichen Methoden3,4,5,14,15gezeigt. Daher denken wir, dass die Rolle von koronar zirkulierenden MFC und löslichen Mediatoren bei der Vorhersage des Risikos für MACEs in zukünftigen prospektiven Studien weiter untersucht werden wird.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts zu verraten.

Acknowledgments

Die Autoren danken der Unterstützung des Institutionellen Programms E015; und Fondo Sectorial FOSSIS-CONACYT, SALUD-2014-1-233947.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BSA Roche 10735086001 Bovine Serum Albumin (BSA) as a buffering agent, stabilizer, standard and for blending.
Calibration Beads Miltenyi Biotec / MACS #130-093-607 MACQuant calibration beads are supplied in aqueous solution containing 0.05% sodium azide. 3.5 ml for up to 100 tests
CD133/1 (AC133)-PE Milteny Biotec / MACS #130-080-801 Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer
CD184 (CXCR4)-PE-VIO770 Miltenyi Biotec / MACS #130-103-798 Monoclonal, Isotype recombinant human IgG1, conjugated
CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC Miltenyi Biotec / MACS #130-093-601 Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer
CD34-FITC Miltenyi Biotec / MACS #130-081-001 The monoclonal antibody clone AC136 detecs a class III epitope of the CD34
CD45- VioBlue Miltenyi Biotec / MACS #130-092-880 Monoclonal CD45 Antibody, human conjugated
Conical Tubes Thermo SCIENTIFIC #339651 15ml conical centrifuge tubes
Cytometry Tubes FALCON Corning Brand #352052 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube. 12x75 style. Sterile.
EDTA BIO-RAD #161-0729 Heavy metals, (as Pb) <10ppm, Fe <0.01%, As <1ppm, Insolubles <0.005%
Improved Neubauer Without brand Without catalog number Hemocytometer for cell counting. (range 0.1000mm, 0.0025mm2)
K2 EDTA Blood Collection Tubes BD Vacutainer #367863 Lilac plastic vacutainer tube (K2E) 10.8mg, 6 mL.
Lymphoprep Stemcell Technologies 01-63-12-002-A Sterile and checked on the presence of endotoxins. Density: 1.077±0.001g/mL
Paraformaldehyde SIGMA-ALDRICH #SZBF0920V Fixation of biological samples, (powder, 95%)
Pipette Transfer 1,3mL CRM Globe PF1016, PF1015 The transfer pipette is a tool that facilitates liquid transfer with greater accuracy.
Test Tubes KIMBLE CHASE 45060 13100 Heat-resistant test tubes. SIZE/CAP 13 x 100 mm

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Koronare Vorläuferzellen und lösliche Biomarker bei kardiovaskulärer Prognossie nach koronarer Angioplastie
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Suárez-Cuenca, J. A., Robledo-Nolasco, R., Alcántara-Meléndez, M. A., Díaz-Hernandez, L. J., Vera-Gómez, E., Hernández-Patricio, A., Sánchez-Díaz, K. S., Gutiérrez-Buendía, J. A., Contreras-Ramos, A., Ruíz-Hernández, A. S., Pérez-Cabeza de Vaca, R., Mondragón-Terán, P. Coronary Progenitor Cells and Soluble Biomarkers in Cardiovascular Prognosis after Coronary Angioplasty. J. Vis. Exp. (155), e60504, doi:10.3791/60504 (2020).More

Suárez-Cuenca, J. A., Robledo-Nolasco, R., Alcántara-Meléndez, M. A., Díaz-Hernandez, L. J., Vera-Gómez, E., Hernández-Patricio, A., Sánchez-Díaz, K. S., Gutiérrez-Buendía, J. A., Contreras-Ramos, A., Ruíz-Hernández, A. S., Pérez-Cabeza de Vaca, R., Mondragón-Terán, P. Coronary Progenitor Cells and Soluble Biomarkers in Cardiovascular Prognosis after Coronary Angioplasty. J. Vis. Exp. (155), e60504, doi:10.3791/60504 (2020).

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