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Medicine

कोरोनरी एंजियोप्लास्टी के बाद कार्डियोवैस्कुलर प्रोग्नोसिस में कोरोनरी प्रोजेनिटर सेल और घुलनशील बायोमार्कर

doi: 10.3791/60504 Published: January 28, 2020

Summary

प्रमुख प्रतिकूल हृदय घटनाओं का विकास, जो कोरोनरी एंजियोप्लास्टी के बाद हृदय रोग का पूर्वानुमान को प्रभावित करते हैं, कोरोनरी क्षति और संवहनी मरम्मत की सीमा से प्रभावित होते हैं। उपन्यास कोरोनरी सेलुलर और घुलनशील बायोमार्कर का उपयोग, संवहनी क्षति और मरम्मत के लिए प्रतिक्रियाशील, एमएसे और पूर्वानुमान के विकास की भविष्यवाणी करने के लिए उपयोगी हैं।

Abstract

प्रमुख प्रतिकूल हृदय घटनाओं (एमएसे) कोरोनरी इस्कीमिक चोट के कारण कोरोनरी एंजियोप्लास्टी से गुजर रहे रोगियों के हृदय रोग का ंतारूश को नकारात्मक रूप से प्रभावित करते हैं। कोरोनरी क्षति की सीमा और संवहनी मरम्मत के तंत्र MACEs के भविष्य के विकास को प्रभावित करने वाले कारक हैं। पट्टिका विशेषताओं और कोरोनरी धमनी जटिलता की तरह आंतरिक संवहनी सुविधाओं MACEs के लिए शकुन जानकारी का प्रदर्शन किया है । हालांकि, इंट्राकोरोनरी परिसंचारी बायोमार्कर के उपयोग को एमएसे की प्रारंभिक पहचान और पूर्वानुमान के लिए एक सुविधाजनक विधि के रूप में पोस्ट किया गया है, क्योंकि वे कोरोनरी क्षति और मरम्मत से जुड़े गतिशील तंत्र को अधिक बारीकी से प्रतिबिंबित करते हैं। एंजियोप्लास्टी के दौरान बायोमार्कर परिसंचारी कोरोनरी का निर्धारण, जैसे मोनोन्यूक्लियर प्रोजेनेटर कोशिकाओं (एमपीसी) की उपआबादी की संख्या के साथ-साथ सूजन, सेल आसंजन और मरम्मत को दर्शाती घुलनशील अणुओं की एकाग्रता, के लिए अनुमति देता है भविष्य के विकास का आकलन और मैकईएस का पूर्वानुमान कोरोनरी एंजियोप्लास्टी के 6 महीने बाद। इस विधि को इसकी ट्रांसलेशनल प्रकृति और एमीज़ की भविष्यवाणी और हृदय रोग का पूर्वानुमान पर इसके प्रभाव के बारे में परिधीय रक्त परिसंचारी बायोमार्कर की तुलना में बेहतर प्रदर्शन द्वारा हाइलाइट किया गया है, जिसे रोगियों के जोखिम स्तरीकरण के लिए लागू किया जा सकता है कोरोनरी धमनी रोग एंजियोप्लास्टी के दौर से गुजर के साथ।

Introduction

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कोरोनरी एंजियोप्लास्टी और स्टेंटिंग कोरोनरी धमनी रोग (सीएडी) के रोगियों के लिए एक उबार प्रक्रिया का प्रतिनिधित्व करते हैं। हालांकि, हृदय मृत्यु, मायोकार्डियल इंफेक्शन, कोरोनरी रेस्टेनोसिस, और एंजाइना या क्षतिपूर्ति दिल की विफलता के एपिसोड सहित प्रमुख प्रतिकूल हृदय घटनाओं (एमएसे), कोरोनरी हस्तक्षेप के महीनों बाद हो सकता है, अस्पताल के लिए अनिर्धारित यात्राओं के संकेत । एमएएस दुनिया भर में आम हैं और उनकी मोरबी-मृत्यु दर उच्च1है।

कोरोनरी इस्कीमिक चोट प्रारंभिक संवहनी प्रतिक्रिया और पुनर्विचार तंत्र को प्रेरित करती है जिसमें एमपीसी की समानता क्षमता और/या एंजियो-रिपारेटिव क्षमता के कारण जुड़ाव शामिल है, साथ ही अंतरकोशिकीय आसंजन अणुओं (आईसीएएम), मैट्रिक्स मेटलोप्रोटीनाज़ (एमएमपी), और प्रतिक्रियाशील ऑक्सीजन प्रजातियों जैसे घुलनशील अणुओं का उत्पादन, कोशिका आसंजन, ऊतक रिमॉडलिंग, और ऑक्सीडेंट तनाव को दर्शाती है । हालांकि पट्टिका विशेषताओं और कोरोनरी धमनी जटिलता की तरह आंतरिक संवहनी सुविधाओं MACEs की भविष्यवाणी करने के लिए इस्तेमाल किया गया है, कुछ अध्ययनों का सुझाव दिया है कि चोट और कोरोनरी एंडोथेलियम में होने वाली मरम्मत के तंत्र से संबंधित बायोमार्कर कोरोनरी एंजियोप्लास्टी2,3,4,5को प्रस्तुत सीएडी के साथ रोगियों में हृदय की घटनाओं की प्रारंभिक पहचान और पूर्वानुमान के लिए बहुत उपयोगी हो सकता है ।

सीएडी की चोट और मरम्मत अंतर्निहित तंत्र को समझने में निरंतर रुचि ने जांचकर्ताओं को इंट्राकोरोनरी परिसंचारी बायोमार्कर का अध्ययन करने के लिए प्रेरित किया है, क्योंकि कोरोनरी नमूनाअधिक बारीकी से संवहनी क्षति और मरम्मत6को दर्शाता है। हालांकि, मानव अध्ययन में कोरोनरी बायोमार्कर का लक्षण वर्णनदुर्लभ 7,8,9रहा है। इसलिए, वर्तमान अध्ययन का उद्देश्य कोरोनरी परिसंचारी एमपीसी और घुलनशील अणुओं की मात्रा निर्धारित करने के लिए एक विधि का वर्णन करना था, जो संवहनी चोट और मरम्मत दोनों को दर्शाती है, और यह दिखाने के लिए कि क्या ये बायोमार्कर एमएसीएस और सीएडी रोगियों के नैदानिक पूर्वानुमान से जुड़े हैं जो कोरोनरी एंजियोप्लास्टी से गुजरे थे। यह विधि वेस्कुलर से संबंधित, परिसंचारी एमपीसी और घुलनशील अणुओं के उपयोग पर आधारित है जो पोत क्षति के निकटतम स्थानों का नमूना लेकर प्राप्त होते हैं । यह कम अंग इस्केमिया, स्ट्रोक, वास्कुलाइटिस, वेनस थ्रोम्बोसिस, और संवहनी चोट और मरम्मत से जुड़ी अन्य चोटों के लिए नैदानिक अध्ययनों के लिए भी उपयोगी हो सकता है।

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Protocol

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यह प्रोटोकॉल मानव अनुसंधान आचार समिति के संस्थागत दिशा-निर्देशों को पूरा करता है ।

1. कोरोनरी एंजियोग्राफी, अल्ट्रासाउंड, और रक्त नमूना

  1. कोरोनरी हस्तक्षेप से पहले बेसलाइन नैदानिक और जनसांख्यिकीय जानकारी का अनुरोध करें। व्यक्ति का डेटा एकत्र करें: आयु, लिंग, वर्तमान धूम्रपान की स्थिति, बॉडी मास इंडेक्स (बीएमआई), उच्च रक्तचाप, डिस्लिपिडेमिया, मधुमेह मेलिटस, दवाएं, और वर्तमान कोरोनरी एंजियोग्राफी के लिए संकेत।
  2. रेडियल दृष्टिकोण का उपयोग करके हृदय कैथेटराइजेशन के माध्यम से कोरोनरी एंजियोग्राफी करें। विशेषज्ञ हृदय रोग विशेषज्ञों द्वारा हीमोडायनेमिक्स कमरे में फ्लोरोस्कोपी गाइड के तहत इस प्रक्रिया को किया जाना चाहिए।
    नोट: अमूल्य जहाजों की पहचान करें। वर्तमान अध्ययन के लिए, मूल्यवान जहाजों को धमनियों के रूप में परिभाषित किया गया था, जिनमें 1.5 मिमी से अधिक वर्ग और 50% से अधिक के ल्यूमेन स्टेनोसिस थे।
  3. इंट्रावैस्कुलर अल्ट्रासाउंड कैथेटर को ब्याज और रिकॉर्ड छवियों के क्षेत्र में अग्रिम करें। सबसे छोटे चमकदार क्षेत्र का पता लगाने और मापने के लिए उपयुक्त सॉफ्टवेयर का उपयोग करें।
  4. निकटतम स्थान से पट्टिका तक 10 मिली0 मीटर रक्त एकत्र करने के लिए कोरोनरी कैथेटर का उपयोग करें।
  5. रोगी निर्वहन के बाद, अध्ययन अंत बिंदुओं का पालन करने के लिए आवधिक चिकित्सा मूल्यांकन शेड्यूल करें। यदि टेलीफोन संपर्क संभव नहीं है या एक चिकित्सक की यात्रा 2 महीने से अधिक समय के लिए देरी हो रही है, एक अधिकृत व्यक्ति (पहले से डिजाइन) के लिए अध्ययन endpoints सत्यापित करने का अनुरोध ।
    नोट: निम्नलिखित में से किसी पर विचार करें: 1) हृदय मृत्यु, 2) नई मायोकार्डियल इंफेक्शन, 3) अस्थिर एंजाइना 24 एच, 4 के भीतर एक अनिर्धारित चिकित्सा यात्रा का संकेत दे रही है, जैसा कि कोरोनरी एंजियोग्राफी द्वारा प्रदर्शित किया गया है, 5) डीमुआवजा के एपिसोड नैदानिक ध्यान की आवश्यकता दिल की विफलता।

2. परिसंचारी एमपीसी का निर्धारण(चित्र ा 2)

  1. रक्त को संग्रह से 1 घंटे के भीतर संसाधित करें। एकत्र रक्त के 6 mL को 15 मिलीएल शंकुई ट्यूब पर स्थानांतरित करें और 1x फॉस्फेट बफर्ड लवण (पीबीएस), पीएच = 7.4 के साथ 1:1 (v/v) पतला करें।
  2. तीन टेस्ट ट्यूबों के लिए घनत्व ढाल माध्यम के 2 mL जोड़ें। घनत्व ढाल माध्यम युक्त प्रत्येक परीक्षण ट्यूब में पतला रक्त के तीन बराबर मात्रा aliquots ध्यान से स्थानांतरित करें।
    नोट: घनत्व ढाल माध्यम और पतला रक्त की कुल मात्रा परीक्षण ट्यूब अधिकतम क्षमता के तीन चौथाई से अधिक नहीं होना चाहिए ।
  3. 1,800 x ग्राम,30 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र। परतों के बीच इंटरफेस पर बैंड को एक नई ट्यूब में स्थानांतरित करें। 6 मिन के लिए 1,800 x ग्राम,4 डिग्री सेल्सियस पर पीबीएस और सेंट्रलाइज के 2 एमएल जोड़ें। गोली में एमपीसी होंगे।
  4. पैलेट को कई बार धोएं। पिछले समाधान से Aspirate और धीरे ताजा PBS में सेल गोली फिर से निलंबित । बाद के वॉश के लिए, 1,800 x ग्राम,2 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर अपकेंद्रित्र। प्रक्रिया 6x दोहराएं।
  5. पीबीएस के 1 mL में सेल गोली को फिर से निलंबित करें। 0.4% ट्राइपैन ब्लू, पतला 1:1 (v/v) के साथ सेल निलंबन के 20 माइक्रोन मिलाएं। एक हीमोसाइटोमीटर के लिए एक बूंद लागू करें और एक हल्के माइक्रोस्कोप के नीचे अरंजित कोशिकाओं की गिनती।
  6. एमपीसी दृढ़ संकल्प के लिए आगे बढ़ें। लेबल 5 mL प्रवाह साइटोमेट्री ट्यूब और प्रति ट्यूब 1 x 106 कोशिकाओं को बाहर aliquot। इसी आइसोटाइप-मिलान नियंत्रण एंटीबॉडी तैयार करें। 1,800 x ग्रामपर सेंट्रलाइज, 6 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और सुपरनेटेंट को त्यागदें।
  7. 1x पीबीएस (पीएच = 7.4), 2 एम एम एथिलीनडायमिनेटेट्रासेटिक एसिड (ईटीए), और 0.05% गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) से मिलकर एंटीबॉडी इन्क्यूबेशन समाधान के 100 माइक्रोन में पतला प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें। 10 एस के लिए फिर से सस्पेंड और 4 डिग्री सेल्सियस, प्रकाश संरक्षित पर 20 सीन के लिए इनक्यूबेट। पीबीएस में 4% पैराफॉर्मलडिहाइड में लिम्फोसाइट्स को ठीक करके और 4 डिग्री सेल्सियस पर 24 घंटे तक के नमूनों को संग्रहित करके प्रोटोकॉल को इस कदम पर रोका जा सकता है।
    नोट: वर्तमान प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले प्राथमिक एंटीबॉडी की अंतिम सांद्रता CD45 1:50, CD34 1:20, KDR 1:50, CD184 1:20, CD133 1:50 थे।
  8. 1,800 x ग्रामपर सेंट्रलाइज, 2 मिन के लिए 4 डिग्री सेल्सियस और सुपरनेटेंट को त्यागदें। 1x पीबीएस (पीएच = 7.4), 2 एमई ईडीटीए के 500 माइक्रोन में रिसस्पेंड।
  9. प्रवाह साइटोमेट्री विश्लेषण करें। पृष्ठभूमि धुंधला स्थापित करने के लिए आइसोटाइप-मिलान नियंत्रण एंटीबॉडी का उपयोग करें। फिर, एफएससी/एसएससी प्लॉट में फैले लिम्फोसाइट्स का चयन करें, अवशिष्ट ग्रैनुलोसाइट्स, सेलुलर मलबे और अन्य कणों को बाहर करने की कोशिश कर रहे हैं, जो आमतौर पर निचले, बाएं-भूखंड में वितरित किए जाते हैं। इस तरह के वितरण को 100 फीसद माना जाता है।
  10. सामान्य इम्यूनोफेनोटाइप सीडी45+ और सीडी 34+वाली कोशिकाओं की उच्च संख्या वाले गेट का उपयोग करें। डबल पॉजिटिव इम्यूनोफेनोटाइप के लिए, पहले CD45+, CD34+की पहचान करने वाले गेट का उपयोग करें, जिसमें केडीआर (VEGFR-2)++ , CD133+या CD184+के अलावा। एमपीसी उपआबादी को उनके विशिष्ट सेल सतह मार्कर द्वारा पहचानें। गेटेड घटनाओं के प्रतिशत के रूप में रिपोर्ट करें।
  11. एमपीसी की मुख्य उपआबादी की पहचान करें। वर्तमान अध्ययन में मुख्य इम्यूनोफेनोटाइप सीडी 45+सीडी34+सीडी 133+, सीडी45+सीडी34+सीडी184+, सीडी45+सीडी34+सीडी133+सीडी184+, CD45 + CD34+CD34+KDR+CD133 + , और CD45 + CD34 + CD133 + और CD45 + CD34 + CD133+और CD45+CD34+CDDR+181.
    नोट: सेल सतह मार्कर इस्तेमाल किया CD45 (लिंफोसाइट्स), CD34 (एंडोथेलियल और/या वैस्कुलर सेल), केडीआर (VEGFR-2, एंडोथेलियल सेल की झिल्ली मार्कर), CD133 (एंडोथेलियल प्रोजेनिटर सेल), और CD184 (हेमेटोपोइटिक स्टेम सेल और एंडोथेलियल सेल) थे ।

3. प्लाज्मा घुलनशील बायोमार्कर का निर्धारण

  1. एसआईआईसीएएम-1 और एमएमपी-9(चित्रा 3,ऊपरी पंक्ति) की एकाग्रता निर्धारित करने के लिए एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोरबेंट परख (एलिसा) का उपयोग करें।
    1. 3,000 x ग्राम,5 मिन के लिए कमरे का तापमान और प्लाज्मा इकट्ठा करने पर रक्त के नमूने को केंद्रित करें।
    2. मानकों, नमूना ट्यूबों, और नियंत्रण ट्यूबों लेबल। एलिसा किट में दिए गए वॉशिंग बफर के साथ 2x धोकर परख की थाली में प्री-कोटेड कुओं को समतुल्य करें।
    3. मानकों, नमूनों, और कुओं को नियंत्रण हस्तांतरण। 90 मिन के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सील और इनक्यूबेट करें।
      नोट: कुओं को पूरी तरह से सूखने न दें।
    4. सामग्री को त्यागें और बायोटिन का पता लगाने एंटीबॉडी जोड़ें। सील और 60 00 00 के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर इनक्यूबेट।
    5. सामग्री को त्यागें और 3x धो लें। पट्टिका को सील करें और स्ट्रेपेवीडीन कार्य समाधान के साथ क्रमिक रूप से इनक्यूबेट करें और इसके बाद 30 मिन, प्रकाश-संरक्षित के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर टेट्रामेथाथिलबेंजिडीन सब्सट्रेट करें। ऊष्मायनों के बीच 3x धोएं। जब रंग विकसित होता है, तो स्टॉप समाधान जोड़ें, और माइक्रोप्लेट एलिसा रीडर में ऑप्टिकल घनत्व अवशोषण पढ़ें।
  2. ट्यूमर परिगलन कारक अल्फा (TNFα) और interleukin 1 बीटा (आईएल-1ο)(चित्रा 3,निचली पंक्ति) की एकाग्रता निर्धारित करने के लिए एक इम्यूनो चुंबकीय मल्टीप्लेक्सिंग परख का उपयोग करें ।
    1. मानकों, नमूना ट्यूबों, और नियंत्रण ट्यूबों लेबल।
    2. भंवर चुंबकीय मोती शीशियों के लिए 30 एस. मनका निलंबन उचित आकार ट्यूबों के लिए हस्तांतरण, और फिर मल्टीप्लेक्सपर प्लेट में कुओं के लिए । आवधिक भंवर मोतियों की वर्षा से बचता है।
    3. हाथ से आयोजित चुंबकीय प्लेट वॉशर को सुरक्षित रूप से डालें। मोतियों के लिए 2 मिन रुको प्रत्येक अच्छी तरह से नीचे जमा करने के लिए और जल्दी से दोनों हाथ से आयोजित चुंबकीय प्लेट वॉशर और प्लेट विधानसभा उलटा, एक सिंक या अपशिष्ट कंटेनर पर । कुओं के अंदर मोतियों को बनाए रखने के लिए हाथ से आयोजित चुंबकीय प्लेट वॉशर का उपयोग करना याद रखें।
    4. प्रत्येक कुएं में धोने बफर के 150 μL जोड़ें और 30 s इंतजार करने के लिए मोतियों नीचे पर जमा करने के लिए अनुमति देते हैं । चरण 3.2.3 के रूप में सामग्री को त्यागें। फिर, सार्वभौमिक परख बफर (किट में प्रदान की गई) के 25 μL जोड़ें तैयार मानकों, नमूनों, और नियंत्रण के 25 μL के बाद ।
    5. 500 आरपीएम पर लगातार मिलाते हुए कमरे के तापमान पर कम से कम 60 न्यूनतम के लिए प्लेट और इनक्यूबेट को सील करें। वैकल्पिक रूप से, यदि संभव हो तो 500 आरपीएम पर लगातार मिलाते हुए, 4 डिग्री सेल्सियस, प्रकाश-संरक्षित पर रात भर इनक्यूबेट करें।
    6. वॉश बफर के 150 माइक्रोन जोड़कर 2x धोएं और 30 एस इंतजार करें। हाथ से आयोजित मैग्नेटिक प्लेट वॉशर डालकर सामग्री को त्यागें। एक सिंक या अपशिष्ट कंटेनर पर 2 मिन और उलटा रुको।
    7. पता लगाने एंटीबॉडी मिश्रण के 25 μL के साथ क्रमिक रूप से इनक्यूबेट के साथ 30 00 आरपीएम पर लगातार मिलाते हुए, 30 न्यूनतम, सील और प्रकाश संरक्षित के लिए कमरे के तापमान पर स्ट्रेप्टाविडिन-पीई समाधान के 25 μL के बाद। ऊष्मायनों के बीच 2x धोएं, जैसा कि चरण 3.2.6 में वर्णित है।
    8. रीडिंग प्राप्त करें। रीडिंग बफर के 120 माइक्रोन जोड़ें। 500 आरपीएम पर लगातार मिलाते हुए कमरे के तापमान पर प्लेट और इनक्यूबेट 5 न्यूनतम को सील करें। एक मल्टीप्लेक्सपरी परख रीडर पर पठन-पाठन चलाते हैं। प्रत्येक एनालेट के अनुसार पढ़ने के मापदंडों को समायोजित करें।

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Representative Results

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कोरोनरी, वेनस सिनस और परिधीय रक्त 52 रोगियों से एकत्र किए गए थे जो कोरोनरी एंजियोग्राफी(चित्रा 1)से गुजरे थे और उच्च रक्तचाप और डिस्लिपिडेमिया की उच्च व्यापकता दिखाई गई थी। नैदानिक अनुवर्ती में, 11 (21.1%) MACEs कोरोनरी एंजियोग्राफी के 6 महीने बाद हुआ: मौत (n = 1), एंजाइना अस्पताल उपस्थिति की आवश्यकता होती है (n = 6), मायोकार्डियल इंफेक्शन (n = 2), और/या दिल की विफलता के सबूत (n = 4) ।

अधिकांश एमपीसी की बेसलाइन कोरोनरी एकाग्रता उन रोगियों में काफी कम थी जिन्होंने एमपीसी उपआबादी CD34+CD133+ और CD45+CD34+CD133+CD184+में भारी कमी के साथ एमएसीएस(चित्रा 4)विकसित किया । इसी तरह, मैकईएस विकसित करने वाले रोगियों में एसआईकैम-1 और लोअर एमएमपी-9(टेबल 1)की कोरोनरी मात्रा में वृद्धि बेसलाइन थी।

कोरोनरी एमपीसी (उपआबादी CD45+CD34+CD133+ और CD45+CD34+CD133+CD184+) और एसआईकैम-1 (उनके औसत मूल्यों द्वारा विरोधाभासित) ने गदा मुक्त अस्तित्व(चित्रा 5)के लिए शकुन क्षमता का प्रदर्शन किया।

हमने विभिन्न परिस्थितियों में घुलनशील बायोमार्कर की गतिशीलता को और अधिक चित्रित किया, क्योंकि कोरोनरी रक्त निर्धारण के बारे में बहुत कम जानकारी है। ट्यूमर परिगलन कारक अल्फा (TNFα) की अभिव्यक्ति माप के समय (पूर्व या बाद एंजियोप्लास्टी) और इंट्रावैस्कुलर अल्ट्रासाउंड(चित्रा 6)का उपयोग कर एक ही कोरोनरी धमनी में विभिन्न ल्यूमेन क्षेत्रों की तुलना के आधार पर कोरोनरी नमूनाके स्थान के अनुसार विविधताओं को दिखाया ।

Figure 1
चित्रा 1: कोरोनरी एंजियोग्राफी और रक्त संग्रह। छवि एक रेडियल दृष्टिकोण का उपयोग कर दिल कैथेटराइजेशन से पता चलता है, हीमोडायडायनामिक्स कमरे में एक फ्लोरोस्कोपी गाइड के तहत प्रदर्शन किया । कार्डियोलॉजी विशेषज्ञ एंजियोग्राफी के दौरान कोरोनरी जहाजों का मूल्यांकन करते हैं और गुब्बारे एंजियोप्लास्टी से ठीक पहले दिल कैथेटर के माध्यम से निकटतम स्थान से कोरोनरी रक्त एकत्र करते हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: रक्त नमूना तैयार ी और एमपीसी प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा दृढ़ संकल्प। (ए)रक्त केंद्रीकरण (नीला तीर = लिम्फोसाइट बैंड) के बाद घनत्व ढाल। (ख)लिम्फोसाइट चरण का संग्रह। (ग)1x पीबीएस के साथ वॉश । (D)सेंट्रलिफायरेशन। (ई)परीक्षण ट्यूब के तल पर गोली गठन। (एफ)न्यूबॉयर सेल निलंबन भार। (जी)लिम्फोसाइट सेल प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके गणना करता है। (ज)प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा कोशिका उपआबादी का निर्धारण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: इम्यूनोअस रक्त में घुलनशील मध्यस्थों का निर्धारण करने के लिए कहते हैं। ऊपरी पंक्ति: एंजाइम से जुड़े इम्यूनोसोरबेंट परख (एलिसा) । छवि से पता चलता है कि कैसे नक्शा नमूनों (नोटबुक) से जानकारी सॉफ्टवेयर को स्थानांतरित करने के लिए नमूना तैयार करने के बाद रीडिंग शुरू किया गया था, एंटीबॉडी ऊष्मायन, और वॉश । यह पीले रंग के विकास को भी दिखाता है, या तो मानक कुओं (पट्टिका में बाएं कॉलम) में या परीक्षण नमूनों (पट्टिका में सही कॉलम) में। निचली पंक्ति: इम्यूनो-मैग्नेटिक मल्टीप्लेक्सिंग परख। नमूना तैयार करने, चुंबकीय मनका-एंटीबॉडी ऊष्मायन, और वॉश के बाद, नमूना जानकारी उचित इम्यूनो-मैग्नेटिक मल्टीप्लेक्सिंग परख सिस्टम रीडर सॉफ्टवेयर में स्थानांतरित कर दी गई थी, और स्क्रीन में एक विशिष्ट मानक वक्र दिखाया गया है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: कोरोनरी परिसंचारी मोनोन्यूक्लियर जनक कोशिकाओं (एमपीसी) । यह आंकड़ा बेसलाइन% एमपीसी उपआबादी को दर्शाता है। (क)प्रवाह साइटोमेट्री से प्रतिनिधि रीडिंग। (ख)फ्लो साइटोमेट्री के साथ% एमपीसी उपआबादी का परिमाणीकरण, एमईएस (*) = महत्वपूर्ण अंतर की प्रस्तुति के अनुसार साजिश रची गई, जिसमें पी एंड एलटी; 0.05 था। इस आंकड़े को सुआरेज-क्यूनिका एट अल10से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: कोरोनरी परिसंचारी सेलुलर (एमपीसी), घुलनशील बायोमार्कर और पूर्वानुमान । यह आंकड़ा बेसलाइन कोरोनरी रक्त मात्रा(ए)% एमपीसी उपआबादी को प्रवाह साइटोमेट्री द्वारा निर्धारित करता है औरएलिसाद्वारा निर्धारित एसआईकैम-1 की प्लाज्मा एकाग्रता से पता चलता है, दोनों ने 6 महीने के अनुवर्ती के दौरान एमएसीएस की प्रस्तुति के अनुसार साजिश रची। ब्लू लाइन प्रत्येक बायोमार्कर के लिए जोखिम मूल्यों वाले व्यक्तियों की संख्या को इंगित करती है, जैसे कि कम% एमपीसी या उच्च एसआईकैम-1। SICAM-1 = घुलनशील अंतरकोशिकीय आसंजन अणु 1। इस आंकड़े को सुआरेज-क्यूनका, एट अल10से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 6
चित्रा 6: कोरोनरी परिसंचारी घुलनशील बायोमार्कर की परिवर्तनशीलता का निर्धारण करने की स्थिति। यह आंकड़ा माप के समय के अनुसार ट्यूमर परिक्रोसिस फैक्टर अल्फा (TNFα) की इंट्राकोरोनरी एकाग्रता में परिवर्तन दिखाता है(ए:प्री-एंजियोप्लास्टी या बी:पोस्ट-एंजियोप्लास्टी) के साथ-साथ कोरोनरी सैंपलिंग का स्थान (इंट्रावैस्कुलर अल्ट्रासाउंड द्वारा मापा जाने वाला 3.5 मिमी कटऑफ में दो कोरोनरी ल्यूमेन व्यास के बीच तुलना)। (*) = पी एंड एलटी; बायोमार्कर के 0.05 अंतर ने प्री-बनाम पोस्ट-एंजियोप्लास्टी प्राप्त की, और कोरोनरी ल्यूमेन व्यास के स्थानों पर नमूना लेने का अंतर ‧3.5 मिमी बनाम और जीटी;3.5 मिमी। इस आंकड़े को सुआरेज-क्यूनिका एट अल11से संशोधित किया गया है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Table 1
तालिका 1: बेसलाइन रक्त घुलनशील बायोमार्कर। (*) कोरोनरी ब्लड बनाम परिधीय परिसंचरण से पी एंड एलटी; ०.०५ अंतर बायोमार्कर को इंगित करता है । (**) एमएएस के साथ एमएसे बनाम बिना पी एंड एलटी; 0.05 को इंगित करता है; एक पूंछ वाले स्वतंत्र टी-टेस्ट । संक्षिप्त रूप: एसआईकेएम-1 = घुलनशील अंतरकोशिकीय आसंजन अणु 1; आईएल-10 = इंटरल्यूकिन 1 बीटा; एमएमपी-9 = मैट्रिक्स मेटलोप्रोटीनेस 9।

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Discussion

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प्रभावित कोरोनरी धमनी से रक्त संग्रह मुश्किल हो सकता है। कभी-कभी, कोरोनरी धमनी बमुश्किल सुलभ होती है। इस मामले में, वेनस सिनस से नमूना एक विकल्प हो सकता है। हमने कोरोनरी धमनी बनाम वेनस सिनस में परिसंचारी बायोमार्कर की तुलना करते हुए सत्यापन परीक्षण किए, जिसमें कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं था। हालांकि, परिसंचारी बायोमार्कर के प्रदर्शन को केवल कोरोनरी सैंपलिंग के लिए मान्य किया गया था। इसलिए, वेनस सिनस से प्राप्त बायोमार्कर के प्रदर्शन का पता लगाया जाना बाकी है।

रक्त संग्रह के बाद पहले 3 घंटे के भीतर एमपीसी के लिए नमूनों को संसाधित करना सबसे अच्छा है। इसलिए कार्डियोलॉजी टीम और लैब शोधकर्ताओं के बीच अच्छा संचार स्थापित किया जाना चाहिए। एमपीसी अलगाव के दौरान, एमपीसी पैलेट को धोते समय घनत्व ढाल तैयारी के दौरान रक्त के नमूने जमा करते समय देखभाल की जानी चाहिए। अंत में, सुविधा के लिए, हम हमेशा कोशिकाओं को साइटोमेट्री ट्यूब में स्थानांतरित करते हैं, प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ते हैं, कोशिकाओं को 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर ठीक और स्टोर करते हैं, और दिन के बाद प्रवाह साइटोमेट्री पढ़ते हैं। एमपीसी परिसंचारी की बायोमार्कर भूमिका के बारे में, जनक कोशिकाओं12के बीच सबसे चिकित्सकीय उपयोगी इम्यूनोफेनोटाइप को मानकीकृत करने के लिए महत्वपूर्ण प्रयास किए गए हैं, लेकिन अध्ययन की एक सीमा यह तथ्य हो सकती है कि परिसंचारी जनक कोशिकाओं की विशिष्ट उपआबादी सीएडी या अन्य संवहनी रोगों के भीतर सभी नैदानिक परिदृश्यों के लिए पूरी तरह से विशेषता नहीं है। इसलिए, प्रत्येक अध्ययन में विभिन्न परिसंचारी जनक कोशिका उप-जनसंख्या का पता लगाया जाना चाहिए।

घुलनशील मार्कर के निर्धारण के दौरान एलिसा और मल्टीप्लेक्सिंग परखों के लिए कुछ सामान्य सिफारिशों में मल्टीचैनल पिपेट का उपयोग, साइड दीवारों को छुए बिना प्रत्येक कुएं के नीचे समाधान जमा करना, और सूखने से बचना शामिल है परख के दौरान कुओं। हमेशा प्लेट में नमूना वितरण की जांच करें, विशेष रूप से मल्टीप्लेक्सिंग परख के लिए, लगातार भंवर द्वारा चुंबकीय मोतियों की वर्षा से बचने के लिए। इसके अलावा, कुओं के अंदर चुंबकीय मोतियों को बनाए रखने के लिए हाथ से आयोजित चुंबकीय प्लेट वॉशर में नीचे की प्लेट डालना सुनिश्चित करें, अन्यथा वॉश के दौरान नमूने खो जाएंगे।

हमने पाया कि कोरोनरी परिसंचारी एमपीसी, मुख्य रूप से हेमेटोपोइटिक मूल के लोगों के साथ-साथ एसआईकैम-1 और एमएमपी-9, एमईएस की भविष्यवाणी और पूर्वानुमान के लिए उत्कृष्ट बायोमार्कर थे। यह धारणा के अनुरूप है कि भड़काऊ प्रतिक्रिया और/या संवहनी क्षति मध्यस्थएमपीसी जुटाने और भर्ती के लिए होमिंग संकेतों को प्रोत्साहित करते हैं, स्थानीय ऊतक मरम्मत को बढ़ावा देते हैं4। तदनुसार, हमें कई सेटिंग्स में इन बायोमार्कर में भिन्नता मिली। एंजियोप्लास्टी और/या कोरोनरी नमूने के स्थान के संबंध में परिवर्तन एंजियोप्लास्टी के दौरान एथेरोमा पट्टिका पर प्रभाव के प्रभाव से समझाया जा सकता है, पट्टिका के आकार, और घुलनशील मध्यस्थों की रिहाई कोरोनरी प्रवाह11में पट्टिका के भीतर तनहा । बढ़ी हुई आईएल -10 पट्टिका और नैदानिक जटिलताओं13के विकास में लगातार शामिल रही है ।

हमारी जानकारी के लिए, यह पहला अध्ययन है जो कोरोनरी एंजियोप्लास्टी को प्रस्तुत सीएडी के साथ एक आबादी में संवहनी परिसंचारी एमपीसी और संवहनी चोट के घुलनशील मध्यस्थों और मरम्मत की भूमिका का मूल्यांकन करता है। एंजियोप्लास्टी से संबंधित परिवर्तनों का लक्षण वर्णन, कोरोनरी नमूने का स्थान, और कोरोनरी बनाम परिधीय नमूने की तुलना। हमें लगता है कि कोरोनरी एंजियोग्राफी करने वाले किसी भी अस्पताल में विधि को आसानी से स्थापित किया जा सकता है । हालांकि, एक सीमा यह है कि हमने मुख्य रूप से आपातकालीन कक्ष विभाग से जारी पुरानी स्थिर एंजाइना वाले रोगियों में इस पद्धति को लागू किया।

सीएडी में एमएसे भविष्यवाणी या पूर्वानुमान के लिए उपयोग किए जाने वाले वर्तमान पारंपरिक तरीकों में मध्यम भविष्य कहनेवाला क्षमता होती है। सीएडी और एंजियोप्लास्टी के बाद होने वाली मरम्मत और उत्थान के लिए जिम्मेदार पैथोफिजियोलॉजी तंत्र के आधार पर उपन्यास बायोमार्कर खोजने में रुचि की बढ़ती गई है। ऐसे बायोमार्कर ने पारंपरिक तरीकों3,4,5, 14,15की तुलना में समान या बेहतर भविष्य कहनेवाला प्रदर्शन दिखाया है । इस प्रकार, हमें लगता है कि मैकके लिए जोखिम की भविष्यवाणी में एमपीसी और घुलनशील मध्यस्थों घूम कोरोनरी की भूमिका भविष्य के संभावित अध्ययनों में और अधिक पता लगाया जाएगा ।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

लेखक संस्थागत कार्यक्रम E015 के समर्थन का शुक्रिया अदा करते हैं; और फोडो सेक्टोरल फॉसिस-कोनेसाइट, SALUD-2014-1-233947 ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BSA Roche 10735086001 Bovine Serum Albumin (BSA) as a buffering agent, stabilizer, standard and for blending.
Calibration Beads Miltenyi Biotec / MACS #130-093-607 MACQuant calibration beads are supplied in aqueous solution containing 0.05% sodium azide. 3.5 ml for up to 100 tests
CD133/1 (AC133)-PE Milteny Biotec / MACS #130-080-801 Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer
CD184 (CXCR4)-PE-VIO770 Miltenyi Biotec / MACS #130-103-798 Monoclonal, Isotype recombinant human IgG1, conjugated
CD309 (VEGFR-2/KDR)-APC Miltenyi Biotec / MACS #130-093-601 Antibody conjugated to R-Phycoerythrin in PBS/EDTA buffer
CD34-FITC Miltenyi Biotec / MACS #130-081-001 The monoclonal antibody clone AC136 detecs a class III epitope of the CD34
CD45- VioBlue Miltenyi Biotec / MACS #130-092-880 Monoclonal CD45 Antibody, human conjugated
Conical Tubes Thermo SCIENTIFIC #339651 15ml conical centrifuge tubes
Cytometry Tubes FALCON Corning Brand #352052 5 mL Polystyrene Round-Bottom Tube. 12x75 style. Sterile.
EDTA BIO-RAD #161-0729 Heavy metals, (as Pb) <10ppm, Fe <0.01%, As <1ppm, Insolubles <0.005%
Improved Neubauer Without brand Without catalog number Hemocytometer for cell counting. (range 0.1000mm, 0.0025mm2)
K2 EDTA Blood Collection Tubes BD Vacutainer #367863 Lilac plastic vacutainer tube (K2E) 10.8mg, 6 mL.
Lymphoprep Stemcell Technologies 01-63-12-002-A Sterile and checked on the presence of endotoxins. Density: 1.077±0.001g/mL
Paraformaldehyde SIGMA-ALDRICH #SZBF0920V Fixation of biological samples, (powder, 95%)
Pipette Transfer 1,3mL CRM Globe PF1016, PF1015 The transfer pipette is a tool that facilitates liquid transfer with greater accuracy.
Test Tubes KIMBLE CHASE 45060 13100 Heat-resistant test tubes. SIZE/CAP 13 x 100 mm

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References

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कोरोनरी एंजियोप्लास्टी के बाद कार्डियोवैस्कुलर प्रोग्नोसिस में कोरोनरी प्रोजेनिटर सेल और घुलनशील बायोमार्कर
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Suárez-Cuenca, J. A., Robledo-Nolasco, R., Alcántara-Meléndez, M. A., Díaz-Hernandez, L. J., Vera-Gómez, E., Hernández-Patricio, A., Sánchez-Díaz, K. S., Gutiérrez-Buendía, J. A., Contreras-Ramos, A., Ruíz-Hernández, A. S., Pérez-Cabeza de Vaca, R., Mondragón-Terán, P. Coronary Progenitor Cells and Soluble Biomarkers in Cardiovascular Prognosis after Coronary Angioplasty. J. Vis. Exp. (155), e60504, doi:10.3791/60504 (2020).More

Suárez-Cuenca, J. A., Robledo-Nolasco, R., Alcántara-Meléndez, M. A., Díaz-Hernandez, L. J., Vera-Gómez, E., Hernández-Patricio, A., Sánchez-Díaz, K. S., Gutiérrez-Buendía, J. A., Contreras-Ramos, A., Ruíz-Hernández, A. S., Pérez-Cabeza de Vaca, R., Mondragón-Terán, P. Coronary Progenitor Cells and Soluble Biomarkers in Cardiovascular Prognosis after Coronary Angioplasty. J. Vis. Exp. (155), e60504, doi:10.3791/60504 (2020).

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