ヘリアンサス・アンヌウスにおける大規模な熱画像スクリーニングによる植物蒸散の新規レギュレーターの同定
Summary
化合物ライブラリーの大規模スクリーニングにより、葉面蒸散起のモジュレーターを同定する方法を提供する。
Abstract
植物の生物的ストレスとアバイオティクスのストレスへの適応は、水の不足や病原体に応答して口孔の調節が重要な役割を果たす要因の様々なによって支配されています。したがって、口球運動を調節する小分子を同定することは、植物が環境に適応する生理学的基礎を理解するのに役立ちます。ストマタル運動の調節因子を同定するために使用されてきた大規模なスクリーニングアプローチには潜在的な限界があり、アブシジン酸(ABA)ホルモンシグナル伝達経路に大きく依存する人もいれば、ABAに依存するメカニズムを除くものもあれば、植物の成長や発達などの間接的で長期的な生理学的影響の観察に依存するものもあります。ここで提示されたスクリーニング方法は、熱イメージングによるそれらの蒸散の直接定量化と組み合わせた化学物質のライブラリーを有する植物の大規模な処理を可能にする。蒸散を通して水を蒸発させると、葉表面の冷却が生じるため、熱画像化は、時間の経過に伴う口内伝導の変化を調査するための非侵襲的なアプローチを提供します。このプロトコルでは、Helianthus annuus苗は水耕栽培され、根の供給によって処理され、そこで一次根が切断され、試験される化学物質に浸される。熱イメージングの後に、時間の経過に伴うコチレドン温度変化の統計解析により、口間開口を調節する生理活性分子の同定が可能になります。私たちの概念実証実験は、化学物質がカットルートからヒマワリ苗のコタイルドンまで10分以内に運ぶことができることを実証しています。また、植物をABAで正の対照として処理すると、数分で葉表面温度の上昇を検出できます。したがって、我々の方法は、口孔開口を調節する新規分子の効率的かつ迅速な同定を可能にする。
Introduction
植物におけるストレス耐性は、様々な分子、細胞、発達および生理学的特徴およびメカニズムの影響を受ける多原性形質である1.変動する環境の植物は、十分な水を維持し、病原体の侵入を防ぎながら、炭素の光合成需要のバランスをとるために、口球の動きを継続的に調節する必要があります。しかし、これらのトレードオフの「決定」がなされるメカニズムは、十分に理解されていません3.植物に生理活性分子を導入することは、生理学を調節し、調節の新しいメカニズムを探る上で役立ちます。
この小分子の大規模スクリーニングは、抗がん創薬および薬理学的アッセイにおいて、短時間で数百~数千の分子の生理学的効果を試験する有効な戦略である4,5。植物生物学において、ハイスループットスクリーニングは、例えば合成分子ピラバクチン6の同定に効果を示しており、また、アブシジン酸(ABA)7、8の長年の受容体の発見を示している。それ以来、ABA受容体のアゴニストおよびアンタゴニスト、およびABA誘導性レポーター遺伝子の発現を調節することができる小分子が9、10、11、12、13、14、15と同定されている。口蓋開口を調節できる小さな化合物を同定するために現在利用可能なハイスループットスクリーニングアプローチには、いくつかの欠点があります:(i)ABAシグナル伝達経路を中心に回転するプロトコルは、新しいABA独立メカニズムの同定を妨げる可能性があり、(ii)生理活性小分子の同定に使用される生体外戦略は、主に種子発芽または播種の成長に対する生理学的影響に依存する。
さらに、植物を生理活性分子で治療する方法はたくさんありますが、そのほとんどは口動の大規模な研究にはあまり適していません。簡潔に言えば、最も一般的な3つの技術は、噴霧または浸漬による葉面塗布、根系の治療、および根灌漑である。葉面の塗布は、葉面に液滴が存在すると大規模なデータ収集を妨げるため、口開度を測定する最も一般的で迅速な方法論とは互換性がありません。根灌漑の主な制限は、大きなサンプル量の要件、根圏の元素による化合物の潜在的な保持、およびアクティブなルート取り込みへの依存です。
ここでは、ABAや既知の干ばつ反応メカニズムを必ずしも伴わない新しい化合物を同定し、植物の効率的で信頼性の高い処理を可能にする大規模な方法を提示します。このシステムでは、Helianthus annuus植物は、水耕栽培された苗の主要な根を切断し、切断部位をサンプル溶液に浸す根を切断する根送りアプローチを使用して処理される。一度処理すると、植物の蒸散に対する各化合物の効果は、赤外線熱画像カメラを使用して測定される。葉面温度の主要な決定要因は葉からの蒸発速度であるため、熱画像データはストマタルコンダクタンスに直接相関させることができます。化学的処理後の葉面温度の相対的な変化は、このように植物の蒸散を定量化するための直接的な手段を提供する。
H.annuusは世界16の5つの最大の油糧種子作物の一つであり、この植物に直接行われた発見は、技術の将来の移転を容易にする可能性があります。さらに、H.アニュウス苗は、大きく平らなコチレドン、ならびにこのプロトコルの開発に理想的であった厚い一次根を有する。しかしながら、この方法は、他の植物および種々の化合物に容易に適合させることができる。
このプロトコルは、ストマタル閉包を引き起こす分子、またはストマタル開口部を促進することができる分子を効果的に同定するために使用することができ、これはストマタルコンダクタンスを調節する信号を理解し、環境への植物適応を理解するための大きな意味を持つ応力。
Protocol
Representative Results
Discussion
所定の日にテストできる化合物の数は、主に(i)植物を成長させ、画面を実行するために利用可能な環境制御スペース、ならびに(ii)プロトコルのステップ6に関与することができる個体の数に依存する。統計的治療後の結果の解釈を統合するために、3つの実験反復を使用することをお勧めします。典型的な日には、1〜2人の個体が、例えば[60化学物質+6陰性(DMSO)コントロール+3陽性(ABA)コントロ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、ポモナ・カレッジのスタートアップ・ファンドとヒルシュ・リサーチ・イニシネーション・グラント・ファンド(FJへ)、ポモナ・カレッジ分子生物学プログラム(恒星サマー・リサーチ・アシスタント・プログラム)によって支援されました。
Materials
| 1020 plastic growing trays without drain holes | Standard 10 x 20 inch trays | ||
| 2.0 mL microtubes, capless | Genesee Scientific | 22-283NC | |
| Abscisic acid (ABA) | Sigma-Aldrich | A1049 | |
| Air pump | Active Aqua | AAPA7.8L | 2 Outlets, 3W, 7.8 L/min |
| Airstones | |||
| Chemical compound library | MicroSource Discovery | Natural Product Collection | |
| Creative Versa-Tool (wood burning tool) | Nasco | 9724549 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO), plant cell culture tested | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Dwarf Sunspot Sunflower seeds | Outsidepride.com | ||
| Erythrosin B | Sigma-Aldrich | 200964 | |
| Hydroponics fertilizer set (FloraBloom, FloraGrow, FloraMicro) | General Hydroponics | GL51GH1421.31.11 | |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| Laptop | Dell | ||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| Microdissection scissors | |||
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| ResearchIR Software | FLIR | ||
| R-Tech Rigid Polystyrene Foam Board | Insulfoam | ||
| Seedholders | Araponics | N/A | |
| Super Tub (plastic utility tub) | Maccourt | ST3608 | 36 x 24 x 8 inch tub used for hydroponics |
| T450sc LWIR (Long-Wave Infrared) Handheld Thermal Imaging Camera | FLIR | FLIR-T62101 | Comes with required charging cable and USB cable needed to connect to laptop |
| Vermiculite | |||
| Water filter | SunSun | HW-304B Pro Canister Filter |
References
- Basu, S., Ramegowda, V., Kumar, A., Pereira, A. Plant adaptation to drought stress. F1000Research. 5, (2016).
- McLachlan, D. H., Kopischke, M., Robatzek, S. Gate control: guard cell regulation by microbial stress. The New Phytologist. 203 (4), 1049-1063 (2014).
- Leung, J., Bazihizina, N., Mancuso, S., Valon, C. Revisiting the Plant’s Dilemma. Molecular Plant. 9 (1), 7-9 (2016).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).
- Wigglesworth, M. J., Murray, D. C., Blackett, C. J., Kossenjans, M., Nissink, J. W. Increasing the delivery of next generation therapeutics from high throughput screening libraries. Current Opinion in Chemical Biology. 26, 104-110 (2015).
- Zhao, Y., et al. Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated. Nature Chemical Biology. 3 (11), 716-721 (2007).
- Park, S. Y., et al. Abscisic acid inhibits type 2C protein phosphatases via the PYR/PYL family of START proteins. Science. 324 (5930), 1068-1071 (2009).
- Ma, Y., et al. Regulators of PP2C phosphatase activity function as abscisic acid sensors. Science. 324 (5930), 1064-1068 (2009).
- Cao, M., et al. An ABA-mimicking ligand that reduces water loss and promotes drought resistance in plants. Cell Research. 23 (8), 1043-1054 (2013).
- Okamoto, M., et al. Activation of dimeric ABA receptors elicits guard cell closure, ABA-regulated gene expression, and drought tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 12132-12137 (2013).
- Rodriguez, P. L., Lozano-Juste, J. Unnatural agrochemical ligands for engineered abscisic acid receptors. Trends in Plant Science. 20 (6), 330-332 (2015).
- Kim, T. H., et al. Chemical genetics reveals negative regulation of abscisic acid signaling by a plant immune response pathway. Current Biology. 21 (11), 990-997 (2011).
- Ito, T., et al. Novel Abscisic Acid Antagonists Identified with Chemical Array Screening. ChemBioChem. 16 (17), 2471-2478 (2015).
- Ye, Y., et al. A Novel Chemical Inhibitor of ABA Signaling Targets All ABA Receptors. Plant Physiology. 173 (4), 2356-2369 (2017).
- Takeuchi, J., et al. Designed abscisic acid analogs as antagonists of PYL-PP2C receptor interactions. Nature Chemical Biology. 10 (6), 477-482 (2014).
- Rauf, S., et al. Progress in modification of sunflower oil to expand its industrial value. Journal of the Science of Food and Agriculture. 97 (7), 1997-2006 (2017).
- Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions. Briefings in Bioinformatics. 16 (6), 974-986 (2015).
- Costa, J. M., Grant, O. M., Chaves, M. M. Thermography to explore plant-environment interactions. Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3937-3949 (2013).
- Merlot, S., et al. Use of infrared thermal imaging to isolate Arabidopsis mutants defective in stomatal regulation. The Plant Journal. 30 (5), 601-609 (2002).
