Summary
Forniamo un metodo per identificare i modulatori della traspirazione fogliare mediante lo screening su larga scala di una libreria composta.
Abstract
L'adattamento delle piante alle sollecitazioni biotiche e abiotiche è regolato da una varietà di fattori, tra i quali la regolazione dell'apertura stomatica in risposta al deficit idrico o agli agenti patogeni svolge un ruolo cruciale. L'identificazione di piccole molecole che regolano il movimento stomatale può quindi contribuire a comprendere la base fisiologica con cui le piante si adattano al loro ambiente. Gli approcci di screening su larga scala che sono stati utilizzati per identificare i regolatori del movimento stomatale hanno potenziali limitazioni: alcuni si basano fortemente sul percorso di segnalazione dell'ormone dell'acido asscisico (ABA), escludendo quindi i meccanismi indipendenti dall'ABA, mentre altri si basano sull'osservazione di effetti fisiologici indiretti e a lungo termine come la crescita e lo sviluppo delle piante. Il metodo di screening qui presentato consente il trattamento su larga scala di piante con una biblioteca di sostanze chimiche accoppiate con una quantificazione diretta della loro traspirazione mediante imaging termico. Poiché l'evaporazione dell'acqua attraverso la traspirazione si traduce nel raffreddamento della superficie delle foglie, l'imaging termico fornisce un approccio non invasivo per studiare i cambiamenti nella conduttanza stomatale nel tempo. In questo protocollo, le piantine Helianthus annuus vengono coltivate idroponically e quindi trattate mediante alimentazione della radice, in cui la radice primaria viene tagliata e immersa nella sostanza chimica testata. L'imaging termico seguito dall'analisi statistica delle variazioni di temperatura cotiledonaria nel tempo consente l'identificazione di molecole bioattive che modulano l'apertura stomatale. I nostri esperimenti proof-of-concept dimostrano che una sostanza chimica può essere trasportata dalla radice tagliata al cotileno della piantina di girasole entro 10 minuti. Inoltre, quando le piante vengono trattate con ABA come un controllo positivo, un aumento della temperatura superficiale delle foglie può essere rilevato in pochi minuti. Il nostro metodo consente così l'identificazione efficiente e rapida di nuove molecole che regolano l'apertura stomatale.
Introduction
La tolleranza allo stress nelle piante è un tratto poligenico influenzato da una varietà di caratteristiche molecolari, cellulari, di sviluppo e fisiologiche e meccanismi1. Le piante in un ambiente fluttuante devono modulare continuamente i loro movimenti stomatali per bilanciare la domanda fotosintetica di carbonio pur mantenendo acqua sufficiente e impedendo l'invasione degli agenti patogeni2; tuttavia, i meccanismi con cui vengono prese queste "decisioni" di compromesso sono poco compresi3. L'introduzione di molecole bioattive nelle piante può modulare la loro fisiologia e aiutare a sondare nuovi meccanismi di regolazione.
Lo screening su larga scala di piccole molecole è una strategia efficace utilizzata nella scoperta di farmaci anti-cancro e nei saggi farmacologici per testare gli effetti fisiologici di centinaia-migliaia di molecole in un breve periodo di tempo4,5. Nella biologia vegetale, lo screening ad alto rendimento ha dimostrato la sua efficacia, ad esempio nell'identificazione della molecola sintetica pyrabactin6, così come nella scoperta del recettore a lungo ricercato dell'acido asscissico (ABA)7,8. Da allora, agonisti e antagonisti dei recettori ABA, e piccole molecole in grado di modulare l'espressione dei geni reporter ABA-inducibili sono stati identificati9,10, 11,12,13,14,15. Gli approcci di screening ad alta velocità attualmente disponibili per identificare piccoli composti che possono modulare l'apertura stomatica hanno alcuni inconvenienti: (i) i protocolli che ruotano intorno alla via di segnalazione delle sementi possono impedire l'identificazione di nuovi meccanismi indipendenti dall'ABA e (ii) strategie in vivo utilizzate per l'identificazione di piccole molecole bioattive si basano principalmente sui loro effetti fisiologici sulla germinazione delle sementi o sulla crescita delle sementi, e non sulla regolazione del sepira toro della pianta.
Inoltre, mentre ci sono molti modi per trattare le piante con molecole bioattive, la maggior parte di esse non sono adatte per uno studio su larga scala del movimento stomatale. In breve, le tre tecniche più comuni sono l'applicazione del fogliame spruzzando o immersione, il trattamento del sistema radicale e l'irrigazione delle radici. L'applicazione foliare non è compatibile con le metodologie più comuni e rapide per misurare l'apertura stomatale poiché la presenza di goccioline sulla superficie fogliare interferisce con la raccolta di dati su larga scala. I principali limiti dell'irrigazione delle radici sono i grandi requisiti di volume del campione, la potenziale ritenzione dei composti da parte di elementi nella rizosfera e la dipendenza dall'assorbimento attivo della radice.
Qui, presentiamo un metodo su larga scala per identificare nuovi composti che regolano la traspirazione delle piante che non implica necessariamente meccanismi di risposta alla siccità ABA o noti e consente un trattamento efficiente e affidabile delle piante. In questo sistema, le piante di Helianthus annuus vengono trattate utilizzando un approccio di alimentazione delle radici che consiste nel tagliare la radice primaria delle piantine coltivate idroponicamente e immergere il sito di taglio nella soluzione campione. Una volta trattata, l'effetto di ogni composto sulla traspirazione delle piante viene misurato utilizzando una termocamera a infrarossi. Poiché un fattore determinante della temperatura superficiale della foglia è il tasso di evaporazione dalla foglia, i dati di imaging termico possono essere direttamente correlati alla conduttanza stomatale. Il cambiamento relativo della temperatura del fogliare dopo il trattamento chimico fornisce quindi un mezzo diretto per quantificare la traspirazione dell'impianto.
H. annuus è una delle cinque più grandi colture di semi oleosi nel mondo16 e le scoperte fatte direttamente su questa pianta possono facilitare i futuri trasferimenti di tecnologia. Inoltre, le piantine H. annuus hanno cotiledoni grandi e piatte, così come una spessa radice primaria, che era ideale per lo sviluppo di questo protocollo. Tuttavia, questo metodo può essere facilmente adattato ad altre piante e una varietà di composti.
Questo protocollo può essere utilizzato per identificare efficacemente le molecole in grado di innescare la chiusura stomatale o promuovere l'apertura stomatale, che ha importanti implicazioni per la comprensione dei segnali che regolano la conduttanza stomatale e l'adattamento delle piante all'ambiente Sottolinea.
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Protocol
1. Coltivare le piante
- Aggiungere uno strato di vermiculite fine di 4 cm ai vassoi di piantare standard da 10 x 20 pollici (254 mm x 501 mm) senza fori.
- Collocare i supporti dei semi (vedi Tabella dei materiali)a 2 cm di distanza nei vassoi dell'impianto.
- Riempire i supporti di semi con la vermiculite.
- Posizionare un seme di girasole con la sua estremità appuntita verso il basso in ogni supporto di semi, spingendo verso il basso in modo che metà del seme rimanga esposto.
NOTA: Un seme di girasole è asimmetrico e l'estremità appuntita da cui emergerà il radicolo dovrebbe puntare verso il basso. Un corretto posizionamento dei semi è importante in quanto il riorientamento della radice e dello stelo non è possibile all'interno dei supporti dei semi. L'estremità arrotondata del seme dovrebbe estendersi oltre la parte superiore del supporto del seme. - Una volta che i semi sono in posizione, coprirli con un ulteriore strato di vermiculite fine di 2 cm di spessore. Acqua nebbiosa dall'alto. La superficie dovrebbe rimanere bagnata dopo un'ora. In tal caso, coprire i vassoi con i coperchi.
- Coltivare piante in una camera di crescita o in una serra. Le condizioni consigliate sono un'intensità di luce di 140 fotoni mol-m -2s-1 e un fotoperiodo di 16 h luce a 22 o C e 9 h scuro a 20 gradi per 5 giorni.
NOTA: L'irrigazione non dovrebbe essere necessaria a meno che la superficie non diventi visibilmente asciutta.
2. Set up del sistema idroponico
- Trovare un contenitore di dimensioni adeguate adatto per la coltivazione iponica di piante. Le dimensioni del contenitore devono essere adattate allo spazio disponibile nella camera di crescita o nella serra. Si raccomanda una profondità minima di 15 cm.
- Riempire il contenitore con acqua distillata e aggiungere fertilizzante idroponico generale come indicato dal produttore. La soluzione idroponica risultante deve essere aerata e in costante movimento, che può essere raggiunto utilizzando pompe per aria e acqua.
- Preparare i galleggianti idroponica.
- Tagliare un foglio di schiuma di polistirolo espanso di 2 cm di spessore (vedi Tabella dei materiali)alle dimensioni del contenitore. Il foglio dovrebbe coprire la maggior parte della superficie del contenitore al fine di limitare la crescita delle alghe. Uno strumento per la combustione del legno è efficace per il taglio della schiuma di polistirolo ed è abbastanza versatile per questo protocollo.
AVVISO: I fumi o il vapore rilasciato durante il taglio a caldo della schiuma di polistirolo sono gravi rischi per la salute. Utilizzare una protezione respiratoria adeguata. Gli utenti possono anche soddisfare i requisiti di ventilazione tagliando la schiuma sotto un cofano fumato. - Fare fori (1-2 cm di diametro) nel foglio di schiuma di polistirolo utilizzando uno strumento di combustione del legno. La distanza tra i centri di due fori può essere regolata in base alle esigenze dell'esperimento. Tuttavia, si raccomanda una distanza minima di 2,5 cm.
- Tagliare un foglio di schiuma di polistirolo espanso di 2 cm di spessore (vedi Tabella dei materiali)alle dimensioni del contenitore. Il foglio dovrebbe coprire la maggior parte della superficie del contenitore al fine di limitare la crescita delle alghe. Uno strumento per la combustione del legno è efficace per il taglio della schiuma di polistirolo ed è abbastanza versatile per questo protocollo.
3. Trasferimento delle piantine all'idroponica e crescita delle piante
- Estrarre delicatamente le vecchie piantine di 5 giorni dalla vermicolite e trasferirle immediatamente in un contenitore riempito con acqua per 30 min. Questo passaggio rimuoverà la vermiculite in eccesso e ammorbidirà le restanti pericarps. La radice primaria emergente dovrebbe essere visibile.
- Rimuovere le pareti del pericarp a mano se necessario per ottimizzare la futura espansione dei cotiledoni.
- Trasferire le piantine all'interno dei supporti di semi al galleggiante di schiuma di polistirolo. Far crescere le piante con un'intensità di luce di 140 di fotoni mol-m -2s-1, un'umidità relativa del 65% e un fotoperiodo di 16 h luce a 22 e 9 h scuro a 20 s per 2 giorni.
4. Preparazione prima del trattamento
NOTA: Questa procedura consente di testare 20 sostanze chimiche da una piccola libreria composta in triplice copia, con 100 M ABA in 10 mM MES-KOH (pH - 6,2) e 10 mM MES-KOH (pH - 6,2) contenenti rispettivamente 1% (v/v) di zolfo dimetilo (DMSO) come controlli positivi e negativi.
- Assicurarsi che ci siano abbastanza piante pronte per il trattamento. Le piante pronte per il trattamento dovrebbero essere abbastanza mature da avere cotyledons completamente spiegate, ma abbastanza giovani che la proliferazione delle radici laterali sia minima. Per fare uno screening standard, sono necessari 69 impianti di questo tipo.
- Togliere la piastra da 96 pozzi contenente i piccoli composti dal congelatore -80 gradi centigradi. Scongelare a temperatura ambiente.
- Preparare un buffer MES-KOH da 10 mL regolato a un pH di 6,2 con 1 M KOH.
- Microtubi da 2 mL senza etichetta. Preparare almeno sei tubi per il trattamento di controllo negativo (10 mM MES-KOH (pH - 6,2) contenenti 1% (v/v) DMSO). Utilizzare tre tubi per il trattamento ABA (100 ABA M in 10 mM MES-KOH pH - 6,2), controllo positivo). Utilizzare i restanti 60 tubi per analizzare l'effetto delle 20 sostanze chimiche in triplice copia.
- Trasferire 10 l di ciascuna sostanza chimica (10 mM in DMSO) in ciascuno dei tre tubi etichettati in modo appropriato. Tubo 10-L di 10 m ABA disciolto in DMSO in tre tubi e 10 L di DMSO nei sei tubi di controllo.
AVVISO: Per natura, alcuni composti possono causare gravi effetti sulla salute e gli utenti devono adottare misure protettive appropriate. - Aggiungete 990 l l di 10 mM MES-KOH (pH - 6,2) a ciascuno dei 69 tubi. Distribuisci il buffer MES con abbastanza forza da mescolare la sostanza chimica con il tampone MES, ma fai molta attenzione a non usare tanta forza che le sostanze chimiche e il buffer MES schizzano fuori dal tubo. In alternativa, vortice a bassa velocità.
5. Impostare la termocamera
- Montare la termocamera su un supporto di copia. Collegare tutti i cavi a un computer portatile.
NOTA: La registrazione viene effettuata in condizioni di temperatura (da 20 a 25 gradi centigradi), umidità (dal 50% al 70%) e la qualità della luce (da 110 a 140 fotonimolm -2s-1) simili a quelli utilizzati per coltivare le piante. - Accendere la fotocamera, quindi il portatile e aprire il software di analisi dell'imaging termico.
NOTA: le istruzioni successive per la registrazione si applicano a un software specifico utilizzato (vedere Tabella dei materiali). - Regolare le impostazioni di registrazione.
- Passa il mouse sopra il pulsante rosso di registrazione nella parte superiore della finestra centrale. Apparirà un menu a discesa. Fare clic sull'icona della chiave inglese Impostazioni di registrazione.
- Selezionare la modalità e le opzioni di registrazione appropriate. È possibile utilizzare l'opzione di registrazione periodicamente, con un fotogramma acquisito al minuto e un arresto manuale. Prendere nota della destinazione del file in cui il software salverà il video. Chiudere la finestra Impostazioni record.
6. Preparazione e trattamento dell'impianto
- Posizionare i tubi senza tappo contenenti le sostanze chimiche in rack di tubi. In alternativa, un foglio di schiuma di polistirolo può essere tagliato e infilato con uno strumento di combustione a legna come descritto nel passaggio 2.3 per creare un rack di tubi personalizzato. Il diametro di ogni foro dovrebbe essere molto vicino al diametro esterno dei tubi senza tappo al fine di tenerli saldamente.
NOTA: Il campo visivo della telecamera è un fattore limitante che deve essere preso in considerazione quando si decide come i tubi cap-less saranno tenuti in posizione. - Distribuire uniformemente i tubi di controllo positivi e negativi, nonché i tubi sperimentali nei rack per tenere conto della distorsione17correlata alla posizione.
- Preparare i seguenti materiali accanto alle piante coltivate idroponicamente: forbici microdissection, un piatto poco profondo con acqua, delicate salviette per compiti, i tubi a 69 capi senza tappo contenenti le diverse sostanze chimiche.
- Ripetere i seguenti passaggi per ogni impianto da trattare. Il germoglio di girasole rimarrà sempre nel supporto del seme.
- Sollevare con cura il supporto del seme e immergere rapidamente la radice nel piatto poco profondo contenente acqua.
- Tagliare la radice primaria sott'acqua per evitare la cavitazione. Il taglio deve avvenire 0,8-1 cm sotto l'estremità più basale del supporto del seme.
- Insetto la pianta appena tagliata in uno dei tubi contenenti le sostanze chimiche.
- Se ci sono gocce d'acqua sui cotiledoni, tamponare delicatamente con una delicata pulizia compito.
NOTA: Questi quattro passaggi devono essere eseguiti il più rapidamente possibile (10 min o meno) per evitare incoerenze nello studio della cinetica.
- Spostare le piante sotto la termocamera e assicurarsi che tutte le piante siano nel campo visivo della fotocamera. Regolare l'altezza della fotocamera e la posizione dei rack in base alle esigenze.
7. Registrazione
- Concentrare la fotocamera sulla superficie dei cotiledoni premendo Ctrl
- Passa il mouse sopra il pulsante rosso e fai clic sull'opzione Registra un filmato. Si dovrebbe aprire una nuova finestra che conferma la registrazione.
- Interrompere la registrazione 1-2 ore dopo.
NOTA: il protocollo può essere messo in pausa qui.
8. Raccolta dei dati
- Vai a File . Proprietà Open . Cercare il file corretto . SEQ e aprirlo.
- Interrompere la riproduzione del filmato.
- Sul lato sinistro della finestra principale, fare clic sull'icona Aggiungi un ROI del cursore di misurazione (3x3 pixel). ROI è l'acronimo di Region of Interest.
- Passa il mouse sopra il centro di un cotiledone della prima pianta e fai clic con il pulsante sinistro del mouse una volta. Il cursore 1 è ora in posizione. Etichettare il secondo cotiledon del primo impianto ripetendo la procedura. L'ordine delle etichette deve essere indicato.
- Ripetere la procedura. Tutte le piante devono essere etichettate con due cursori.
- Fare clic sull'icona Modifica ROI. Nella finestra principale, fai clic con il pulsante sinistro del mouse e tieni premuto nell'angolo in alto a sinistra e scorri verso l'angolo in basso a destra per selezionare tutti i ROI.
- Passare il mouse sull'icona visualizzatore statistico e selezionare Grafico temporale. Si aprirà una nuova finestra.
- Eseguire il film. Un grafico si riempirà con i dati.
- In questa finestra, fare clic sulla doppia freccia nell'angolo in alto a destra per aprire un nuovo menu.
- Fare clic sull'icona Salva. Salvare come valori X e Y nel grafico (.csv). Chiudere il software una volta esportati i dati.
9. Analisi dei dati
- Aprire il file CSV utilizzando un software di analisi dei dati (ad esempio, Microsoft Excel). Si noti che le tre prime colonne (da A a C) forniscono informazioni sul numero di fotogramma, l'ora assoluta e il tempo relativo. Le colonne rimanenti forniscono la temperatura di ogni ROI nel tempo.
- Decidere la natura dello strumento statistico da utilizzare; questa decisione dipende da diversi fattori, tra cui la progettazione sperimentale.
NOTA: Nel nostro esempio, un punteggio standard, o punteggio z, viene calcolato per ogni campione in base alla media della popolazione e alla deviazione standard della popolazione. Per ogni campione, viene quindi calcolato un valore p dal punteggio z. Questo metodo consente di confermare i controlli positivi e negativi, nonché l'identificazione di nuovi composti da testare ulteriormente.
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Representative Results
Un esperimento con la tintura rossa Erythrosine B (0,8 kDa) dimostra la capacità delle sostanze chimiche di essere visibilmente assorbite attraverso una radice tagliata nei cotiledoni di una piantina di girasole entro 10 minuti (Figura 1).
Quando le piante vengono trattate con ABA, viene rilevato un aumento della temperatura delle foglie nei cotiledoni di girasole in pochi minuti. Questo aumento della temperatura delle foglie è associato a una diminuzione dell'apertura stomatale e della conduttanza stomatale. L'aumento della temperatura fogliare si osserva 15 min dopo il trattamento con 10 M ABA (valore-p - 0,02) e 20 min con 5 M ABA (valore p - 0,003) (Figura 2). Nel complesso, questi risultati mostrano che le misurazioni della temperatura delle foglie mediante imaging termico sono un buon proxy per misurare l'apertura stomatale e la conduttanza.
La figura 3 mostra un esperimento di prova del concetto utilizzando un sottoinsieme di 20 sostanze chimiche della raccolta NatProd con controlli positivi (100 ABA) e negativi. In questo esperimento rappresentativo, un trattamento statistico basato sul punteggio standard consente l'identificazione di sostanze chimiche che promuovono la chiusura stomatale o, mentre il saggio dovrebbe essere ottimizzato per quello scopo specifico, le sostanze chimiche che promuovono l'apertura stomatale. Nell'esempio dato, una visualizzazione della mappa di calore dei punteggi standard consente la rapida identificazione delle sostanze chimiche #02 e #16 come potenziali candidati.
Figura 4 riepiloga i passaggi importanti del flusso di lavoro.
Figura 1: Efficacia dell'approccio di alimentazione della radice di taglio. (A) Una piantina alimentata per 1 h con erithrosina B in 10 mM MES-KOH (pH - 6,2) è visibilmente rossa (immagine a destra) rispetto al controllo (immagine a sinistra). Le immagini sono state scattate dopo l'alimentazione della radice tagliata seguita da un'incubazione notturna in etanolo assoluto per rimuovere i pigmenti vegetali naturali. Barretta 10 mm. (B) Accumulo di eritorosina B in cotiledoni nel tempo. L'eritromia B può essere rilevata dalla spettrofotometria in estratti vegetali da cotyledonti 8 min (valore p - 0,032) dopo il trasferimento di piantine di girasole di radice tagliata al colorante. Le barre di errore indicano SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Relazioni tra temperatura delle foglie, apertura stomatale e conduttanza per mostrare la sensibilità del progetto sperimentale. (A) Immagine rappresentativa che mostra le differenze nella temperatura delle foglie tra 100 M di piantine di girasole trattate da ABA e non trattate (Controllo) dopo 30 min visualizzate dall'imaging termico. (B) Sinistra: le piante trattate con 100 M ABA per 30 min mostrano un aumento della temperatura rispetto agli impianti di controllo (indica il valore p < 0,01), n Destra: le misure dell'apertura stomatale sulle bucce epidermiche delle stesse piante mostrano una diminuzione dell'apertura stomatale (larghezza/lunghezza) (il valore z indica il valore p < 0,01, n - 3, il numero di stomata per pianta - 162). (C) La conduttanza delle foglie misurata con un porometro fogliare e accoppiata con le misurazioni della temperatura foglia mostra che esiste una forte correlazione (coefficiente di Pearson - -0,89, n - 6) tra la temperatura superficiale della foglia e la conduttanza stomatale. Le piante trattate con 100 ABA per 30 min mostrano un aumento della temperatura e una diminuzione della conduttanza rispetto agli impianti di controllo (n . 6). (D) Lo studio di risposta alla dose mostra una riduzione della temperatura delle foglie nelle piante trattate con concentrazioni di ABA a partire da 5 m dopo 20 min di trattamento (valore di p : 0,0037, n . 3). Le barre di errore indicano SEM. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Risultati rappresentativi dello screening di 20 composti chimici. (A) Mappa di calore dei punteggi z che riflettono le risposte delle piante a 20 composti testati in triplicati. Il rosso scuro e il blu scuro indicano rispettivamente il livello di confidenza >99% per la chiusura e l'apertura stomatale. Sei piante sono state trattate con DMSO (controllo), tre sono state trattate con 100 ABA, e altre piante sono state trattate con 100 M di prodotti chimici in triplice copia. Le piante che rispondono al composto 16 (C-16) mostrano una chiusura stomatale simile a quella osservata nelle piante trattate con ABA. Due piante su tre trattate con composto 02 (C-02) mostrano un aumento significativo dell'apertura stomatale. (B) Cinetica della risposta delle piante ai composti 02 e 16. Variazioni medie della temperatura nel tempo sono mostrate per le piante che rispondono al trattamento di controllo (n - 6), 100 M ABA (n ) o 100 M di ogni composto (n . Le barre di errore indicano SEM. Le variazioni della temperatura sono costantemente significativi dal punto di vista statistico dopo 10 min di trattamento Con ABA (valore p - 0,026, n - 3), 15 min di trattamento con C-16 (valore-p : 0,030, n - 3) e 71 min di C-02 (valore-p - 0,044, n ) rispetto al controllo. Le fluttuazioni condivise da tutti i campioni sono rumore di fondo a causa del controllo dinamico della temperatura ambiente nella camera di crescita. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Riepilogo del flusso di lavoro di screening. Si noti che le immagini rappresentano passaggi importanti e sono indipendenti l'una dall'altra. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Il numero di composti che possono essere testati in un dato giorno dipende principalmente (i) dallo spazio a controllo ambientale disponibile per far crescere le piante e per eseguire lo schermo, nonché dal numero (ii) del numero di individui che possono essere coinvolti nel passaggio 6 del protocollo. Raccomandiamo l'uso di tre repliche sperimentali per consolidare l'interpretazione dei risultati dopo il trattamento statistico. In una giornata tipo, da uno a due individui possono vagliare 60 composti in triplicati senza difficoltà testando ad esempio [60 sostanze chimiche - 6 controlli negativi (DMSO) - 3 controlli positivi (ABA) al mattino, a mezzogiorno e nel pomeriggio.
Questo metodo si basa su piantine sane con cotyledons completamente sviluppati. Poiché l'imaging avviene dall'alto, una piantina ideale dovrebbe mostrare un angolo di 90 gradi tra l'ipocotil e la lama di cotiledonario al fine di raccogliere quante più informazioni possibili. Questo angolo è regolato principalmente dalla luce e dovrebbe quindi essere ottimizzato regolando le condizioni di crescita. I nostri risultati mostrano che ci vogliono circa 10 minuti per una sostanza chimica per raggiungere i cotiledoni e qualche minuto in più per rispondere a una sostanza chimica come ABA. Questa osservazione rende il passaggio 6.4 il passaggio più tempestivo del protocollo. È quindi fondamentale trattare tutte le piante in un dato saggio in meno di 15 min per evitare discrepanze tra le risposte dell'impianto. Tra i fattori esterni che influenzano passivamente le misurazioni della temperatura dei fogliami, è probabile che la ventilazione introduca pregiudizi correlati alla posizione o una significativa variabilità tra le repliche. Gli utenti devono prestare attenzione controllando i flussi di ventilazione e limitare i pregiudizi relativi alla posizione distribuendo in modo casuale i campioni prima della registrazione. Per tenere conto di altri fattori potenziali, la registrazione deve essere effettuata a temperature, umidità e condizioni di luce simili a quelle utilizzate per far crescere le piante, poiché eventuali cambiamenti in queste condizioni possono influenzare la chiusura degli stomi e/o la temperatura fogliare. Infine, un composto in grado di modulare la chiusura stomatale dovrebbe essere valutato per la sua tossicità. Questo vale in particolare se il composto innesca la chiusura stomatale, come è noto per essere una conseguenza indiretta di stress intenso sperimentato dalla pianta.
Fornendo un metodo di somministrazione efficace di molecole bioattive e un metodo per misurare direttamente la traspirazione vegetale, questo protocollo affronta alcuni degli inconvenienti associati agli attuali approcci di screening, come accennato nell'introduzione. Il nostro protocollo non è esclusivo per le piantine di girasole e può essere applicato alla maggior parte dei dicots con un angolo ipocotilo a cotyledon di 90 gradi. L'imaging termico dei cotiledoni Arabidopsis è efficace18,19 e il nostro protocollo potrebbe quindi essere adattato alle piantine con cotiledoni simili a piccoli. Inoltre, l'imaging a fluorescenza clorofilla potrebbe essere utilizzato per misurare le prestazioni fotosintetiche in combinazione. Anche se meno efficaci in termini di tempo, le misurazioni dell'accumulo guidato dalla traspirazione in cotiledoni di Eritrorosina B aggiunte a ciascuna sostanza chimica potrebbero essere potenzialmente utilizzate per valutare i tassi di traspirazione se non è disponibile una termocamera. In tutto, questo metodo di screening su larga scala valuta in modo efficiente la risposta fogliare vegetale alle molecole bioattive ed è facilmente adattabile a una varietà di applicazioni.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Il lavoro è stato sostenuto da Pomona College Start-up Funds e Hirsch Research Initiation Grants Fund (a FJ) così come dal Pomona College Molecular Biology Program attraverso lo Stellar Summer Research Assistant Program (al KG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1020 plastic growing trays without drain holes | Standard 10 x 20 inch trays | ||
| 2.0 mL microtubes, capless | Genesee Scientific | 22-283NC | |
| Abscisic acid (ABA) | Sigma-Aldrich | A1049 | |
| Air pump | Active Aqua | AAPA7.8L | 2 Outlets, 3W, 7.8 L/min |
| Airstones | |||
| Chemical compound library | MicroSource Discovery | Natural Product Collection | |
| Creative Versa-Tool (wood burning tool) | Nasco | 9724549 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO), plant cell culture tested | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Dwarf Sunspot Sunflower seeds | Outsidepride.com | ||
| Erythrosin B | Sigma-Aldrich | 200964 | |
| Hydroponics fertilizer set (FloraBloom, FloraGrow, FloraMicro) | General Hydroponics | GL51GH1421.31.11 | |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| Laptop | Dell | ||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| Microdissection scissors | |||
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| ResearchIR Software | FLIR | ||
| R-Tech Rigid Polystyrene Foam Board | Insulfoam | ||
| Seedholders | Araponics | N/A | |
| Super Tub (plastic utility tub) | Maccourt | ST3608 | 36 x 24 x 8 inch tub used for hydroponics |
| T450sc LWIR (Long-Wave Infrared) Handheld Thermal Imaging Camera | FLIR | FLIR-T62101 | Comes with required charging cable and USB cable needed to connect to laptop |
| Vermiculite | |||
| Water filter | SunSun | HW-304B Pro Canister Filter |
References
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