Summary
نحن نقدم طريقة لتحديد المغيرات من نتح الأوراق من خلال فحص واسع النطاق لمكتبة مركبة.
Abstract
يخضع تكيف النباتات مع الضغوط الحيوية واللاأحيائية لمجموعة متنوعة من العوامل، من بينها تنظيم فتحة الفم استجابة لعجز المياه أو مسببات الأمراض يلعب دوراً حاسماً. وبالتالي فإن تحديد الجزيئات الصغيرة التي تنظم حركة الفم يمكن أن يسهم في فهم الأساس الفسيولوجي الذي تتكيف به النباتات مع بيئتها. وتنطوي نُهج الفحص واسعة النطاق التي استُخدمت لتحديد منظمي حركة الفم على قيود محتملة: فبعضها يعتمد اعتماداً كبيراً على مسار الإشارات الهرمونية لحمض الاستئصال( ABA) ، وبالتالي يستبعد الآليات المستقلة عن ABA ، في حين يعتمد البعض الآخر على مراقبة الآثار الفسيولوجية غير المباشرة طويلة الأجل مثل نمو النبات وتطوره. تسمح طريقة الفحص المعروضة هنا بالمعالجة الواسعة النطاق للنباتات مع مكتبة من المواد الكيميائية إلى جانب القياس الكمي المباشر لنتحانها عن طريق التصوير الحراري. وبما أن تبخر الماء من خلال النتح يؤدي إلى تبريد سطح الورقة، فإن التصوير الحراري يوفر نهجًا غير جراحي للتحقيق في التغيرات في التوصيل اتوماتيالي بمرور الوقت. في هذا البروتوكول ، تزرع شتلات Helianthus annuus هيدروبولونيثم ثم تعامل بتغذية الجذر ، حيث يتم قطع الجذر الأساسي وغمسه في المادة الكيميائية التي يتم اختبارها. التصوير الحراري تليها التحليل الإحصائي للتغيرات في درجة الحرارة cotyledonary مع مرور الوقت يسمح لتحديد جزيئات النشطة بيولوجيا تحوير فتحة الفم. وتبين تجاربنا لإثبات مفهوم أن مادة كيميائية يمكن حملها من جذر القطع إلى كوتيليدون من شتلة عباد الشمس في غضون 10 دقائق. بالإضافة إلى ذلك ، عندما يتم التعامل مع النباتات مع ABA كتحكم إيجابي ، يمكن اكتشاف زيادة في درجة حرارة سطح الورقة في غضون دقائق. وهكذا تسمح طريقتنا بتحديد كفاءة وسرعة الجزيئات الجديدة التي تنظم فتحة الفتحة.
Introduction
تحمل الإجهاد في النباتات هو سمة متعددة الجينات تتأثر بمجموعة متنوعة من الميزات الجزيئية والخلوية والتنموية والفسيولوجية والآليات1. تحتاج النباتات في بيئة متقلبة إلى تعديل حركاتها الستومائية باستمرار لتحقيق التوازن بين الطلب الضوئي على الكربون مع الحفاظ على كمية كافية من المياه ومنع غزو مسببات الأمراض2؛ ومع ذلك، فإن الآليات التي يتم بها اتخاذ هذه "القرارات" المفاضلة غير مفهومة بشكل جيد3. إدخال جزيئات النشطة بيولوجيا في النباتات يمكن أن تعدل علم وظائف الأعضاء وتساعد في التحقيق آليات جديدة للتنظيم.
الفحص على نطاق واسع من الجزيئات الصغيرة هي استراتيجية فعالة تستخدم في اكتشاف المخدرات المضادة للسرطان والمواد الدوائية للاختبارات لاختبار الآثار الفسيولوجية من مئات إلى آلاف الجزيئات في فترة قصيرة من الزمن4،5. في بيولوجيا النبات، وقد أظهرت فحص عالية الإنتاجية فعاليتها على سبيل المثال في تحديد الجزيء الاصطناعي pyrabactin6،فضلا عن اكتشاف مستقبلات طويلة سعى من حمض الاستئصال (ABA)7،8. ومنذ ذلك الحين ، تم تحديد ناهضات وخصوم مستقبلات ABA ، والجزيئات الصغيرة القادرة على تعديل تعبير جينات المراسلة القابلة للاختزال في ABA9،10،11،12،13،14،15. نهج الفرز عالية الإنتاجية المتاحة حاليا لتحديد المركبات الصغيرة التي يمكن أن تعدل فتحة الفم لها بعض العيوب: (1) البروتوكولات التي تدور حول مسار الإشارات ABA قد تمنع تحديد آليات ABA مستقلة جديدة، و (2) في استراتيجيات الجسم الحي المستخدمة لتحديد الجزيئات الصغيرة النشطة بيولوجيا تعتمد في المقام الأول على آثارها الفسيولوجية على إنبات البذور أو نمو الشتلات، وليس على تنظيم نتح النبات في حد ذاته.
بالإضافة إلى ذلك ، في حين أن هناك العديد من الطرق لعلاج النباتات ذات الجزيئات النشطة بيولوجيا ، فإن معظمها ليست مناسبة تمامًا لدراسة واسعة النطاق لحركة الفم. باختصار ، فإن التقنيات الثلاث الأكثر شيوعًا هي تطبيق الأوراق عن طريق الرش أو الغمس ، وعلاج نظام الجذر ، وري الجذر. تطبيق أوراق لا يتوافق مع المنهجيات الأكثر شيوعا وسرعة لقياس الفتحة الستومات منذ وجود قطرات على سطح ورقة تتداخل مع جمع البيانات على نطاق واسع. القيود الرئيسية للري الجذري هي متطلبات حجم العينة الكبيرة ، والاحتفاظ المحتمل للمركبات بالعناصر في الغلاف الرهيزووسفير ، والاعتماد على التناول النشط للجذر.
هنا ، نقدم طريقة واسعة النطاق لتحديد المركبات الجديدة التي تنظم نتح النباتات التي لا تنطوي بالضرورة على آليات ABA - أو معروفة تستجيب للجفاف وتتيح معالجة فعالة وموثوقة للنباتات. في هذا النظام، يتم التعامل مع النباتات الأنوس Helianthus باستخدام نهج تغذية الجذر الذي يتكون من قطع الجذر الأساسي للشتلات التي تزرع هيدروبوغرافيا وغمس موقع قطع في محلول العينة. بمجرد المعالجة ، يتم قياس تأثير كل مركب على نتح النباتات باستخدام كاميرا التصوير الحراري بالأشعة تحت الحمراء. وبما أن أحد المحددات الرئيسية لدرجة حرارة سطح الورقة هو معدل التبخر من الورقة، يمكن ربط بيانات التصوير الحراري مباشرة بالتوصيل اتوماتيالي. وبالتالي فإن التغير النسبي في درجة حرارة الأوراق بعد المعالجة الكيميائية يوفر وسيلة مباشرة لقياس نتح النبات.
H. annuus هي واحدة من أكبر خمسة محاصيل البذور الزيتية في العالم16 والاكتشافات التي تتم مباشرة على هذا النبات قد تسهل نقل التكنولوجيا في المستقبل. بالإضافة إلى ذلك ، فإن شتلات H. annuus لها كوتيلدونكبيرة ومسطحة ، بالإضافة إلى جذر أساسي سميك ، والذي كان مثاليًا لتطوير هذا البروتوكول. ومع ذلك ، يمكن تكييف هذه الطريقة بسهولة مع النباتات الأخرى ومجموعة متنوعة من المركبات.
يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد الجزيئات القادرة على تشغيل إغلاق الفم أو تعزيز فتح الفم ، مما له آثار كبيرة على فهم الإشارات التي تنظم التوصيل اتوماسي وتكييف النبات مع البيئة تؤكد.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. زراعة النباتات
- أضف طبقة سمكها 4 سم من الفيرميكوليت الناعم إلى المعيار 10 في x 20 في (254 مم × 501 مم) صواني النباتات بدون ثقوب.
- ضع أصحاب البذور (انظر جدول المواد)2 سم في صواني النبات.
- ملء حاملي البذور مع الفيرميكوليت.
- وضع بذور عباد الشمس مع نهايتها مدببة إلى أسفل في كل حامل البذور، ودفع أسفل حتى نصف البذور لا تزال مكشوفة.
ملاحظة: بذور عباد الشمس غير متناظرة ونهاية مدببة من حيث سوف تظهر شعاع يجب أن نقطة إلى أسفل. وضع البذور السليم مهم لأن إعادة توجيه الجذر والجذعية غير ممكنة داخل حاملي البذور. يجب أن تمتد النهاية المستديرة للبذرة بعد الجزء العلوي من حامل البذور. - بمجرد أن تكون البذور في مكانها ، قم بتغطيتها بطبقة إضافية سمكها 2 سم من الفيرميكوليت الناعم. الماء عن طريق الضباب من الأعلى. يجب أن يبقى السطح مبللًا بعد ساعة. إذا كان هذا هو الحال، قم بتغطية الصواني بالأغطية.
- زراعة النباتات في غرفة النمو أو الدفيئة. الظروف الموصى بها هي كثافة الضوء من 140 ميكرومول فوتونس·م-2 -2·s-1 وفترة ضوئية من 16 ساعة ضوء في 22 درجة مئوية و 9 ح الظلام في 20 درجة مئوية لمدة 5 أيام.
ملاحظة: لا ينبغي أن يكون السقي ضروريًا ما لم يصبح السطح جافًا بشكل واضح.
2. إعداد نظام الزراعة المائية
- العثور على حاوية الحجم المناسب مناسبة لزراعة النباتات hydroponically. وينبغي تكييف حجم الحاوية مع المساحة المتاحة في غرفة النمو أو الدفيئة. يوصى بوعمق أدنى قدره 15 سم.
- ملء الحاوية بالماء المقطر وإضافة الأسمدة المائية العامة كما هو مبين من قبل الشركة المصنعة. وينبغي أن يكون الحل المائية الناتجة التهوية وفي حركة مستمرة، والتي يمكن تحقيقها باستخدام مضخات الهواء والماء.
- إعداد العوامات المائية.
- قطع ورقة من 2 سم سميكة رغوة البوليسترين الموسع (انظر جدول المواد)إلى أبعاد الحاوية. يجب أن تغطي الورقة معظم سطح الحاوية من أجل الحد من نمو الطحالب. أداة حرق الخشب فعالة لقطع رغوة البوليسترين وتنوعا بما فيه الكفاية لهذا البروتوكول.
تنبيه: الأبخرة أو البخار الذي يتم إطلاقه أثناء القطع الساخن لرغوة البوليسترين هي مخاطر صحية خطيرة. استخدام الحماية التنفسية المناسبة. يمكن للمستخدمين أيضا تلبية متطلبات التهوية عن طريق قطع الرغوة تحت غطاء الدخان. - جعل ثقوب (1-2 سم في القطر) في ورقة رغوة البوليسترين باستخدام أداة حرق الخشب. يمكن تعديل المسافة بين مراكز اثنين من الثقوب لاحتياجات التجربة. ومع ذلك، يوصى بمسافة دنيا تبلغ 2.5 سم.
- قطع ورقة من 2 سم سميكة رغوة البوليسترين الموسع (انظر جدول المواد)إلى أبعاد الحاوية. يجب أن تغطي الورقة معظم سطح الحاوية من أجل الحد من نمو الطحالب. أداة حرق الخشب فعالة لقطع رغوة البوليسترين وتنوعا بما فيه الكفاية لهذا البروتوكول.
3. نقل الشتلات إلى الزراعة المائية ونمو النبات
- سحب بلطف الشتلات 5 أيام من الفيرميكوليت ونقلها على الفور إلى حاوية مليئة بالماء لمدة 30 دقيقة. هذه الخطوة سوف إزالة الفيرميكوليت الزائد وتليين pericarps المتبقية. وينبغي أن يكون الجذر الأولي الناشئ مرئيا.
- إزالة الجدران pericarp باليد إذا لزم الأمر من أجل تحسين التوسع في المستقبل من cotyledons.
- نقل الشتلات داخل أصحاب البذور إلى رغوة البوليسترين العوامة. تنمو النباتات مع كثافة الضوء من 140 ميكرومول الفوتونس ·م-2·s-1،رطوبة نسبية من 65٪ وفترة ضوئية من 16 ساعة ضوء في 22 درجة مئوية و 9 ح الظلام في 20 درجة مئوية لمدة 2 أيام.
4. التحضير قبل العلاج
ملاحظة: هذا الإجراء هو لاختبار 20 مادة كيميائية من مكتبة مجمع ة صغيرة في ثلاثية، مع 100 ميكرومتر ABA في 10 mM MES-KOH (درجة الحموضة = 6.2) و 10 mM MES-KOH (درجة الحموضة = 6.2) التي تحتوي على 1٪ (v/v) ثنائي ميثيل sulfoxide (DMSO) كضوابط إيجابية وسلبية، على التوالي.
- تأكد من وجود ما يكفي من النباتات جاهزة للعلاج. النباتات جاهزة للعلاج ينبغي أن تكون ناضجة بما فيه الكفاية ليكون قد تكشفت تماما cotyledons، ولكن الشباب بما فيه الكفاية أن الانتشار الجذري الجانبي هو الحد الأدنى. ولإجراء فحص قياسي، هناك حاجة إلى 69 من هذه النباتات.
- قم بإزالة لوحة 96-well التي تحتوي على المركبات الصغيرة من الفريزر -80 درجة مئوية. إذابة في درجة حرارة الغرفة.
- إعداد 80 مل من 10 m M MES-KOH المخزن المؤقت المعدلة إلى درجة الحموضة من 6.2 مع 1 M KOH.
- تسمية غطاء أقل 2 مل ميكروأنابيب. إعداد ما لا يقل عن ستة أنابيب لعلاج السيطرة السلبية (10 mM MES-KOH (درجة الحموضة = 6.2) التي تحتوي على 1٪ (v/v) DMSO). استخدام ثلاثة أنابيب لعلاج ABA (100 ميكرومتر ABA في 10 m M MES-KOH pH = 6.2) ، والتحكم الإيجابي). استخدام الأنابيب 60 المتبقية لتحليل تأثير 20 المواد الكيميائية في ثلاثة توائم.
- نقل 10 ميكرولتر من كل مادة كيميائية (10 مم في DMSO) إلى كل من الأنابيب الثلاثة المسماة بشكل مناسب. Pipet 10 μL من 10 mM ABA المذابة في DMSO في ثلاثة أنابيب و 10 ميكرولتر من DMSO في أنابيب التحكم الستة.
تنبيه: بحكم الطبيعة، قد تسبب بعض المركبات آثارًا صحية خطيرة ويجب على المستخدمين اتخاذ تدابير وقائية مناسبة. - أضف 990 ميكرولتر من 10 مم MES-KOH (درجة الحموضة = 6.2) إلى كل من الأنابيب 69. الاستغناء عن العازلة MES مع ما يكفي من القوة لخلط المادة الكيميائية مع المخزن المؤقت MES ولكن كن حذراً جداً عدم استخدام الكثير من القوة التي المواد الكيميائية وMES العازلة بخ من الأنبوب. بدلا من ذلك، دوامة في سرعة منخفضة.
5. إعداد كاميرا التصوير الحراري
- قم بتركيب كاميرا التصوير الحراري على حامل نسخة. قم بتوصيل جميع الكابلات بجهاز كمبيوتر محمول.
ملاحظة: يتم التسجيل في ظروف من درجة الحرارة (20 درجة مئوية إلى 25 درجة مئوية)، والرطوبة (50٪ إلى 70٪) وجودة الضوء (110 إلى 140 ميكرومول فوتونس·م-2·s-1)مماثلة لتلك المستخدمة لزراعة النباتات. - قم بتشغيل الكاميرا ثم قم بفتح برنامج تحليل التصوير الحراري.
ملاحظة: تنطبق الإرشادات اللاحقة للتسجيل على برنامج معين يستخدم (انظر جدول المواد). - ضبط إعدادات التسجيل.
- الماوس فوق الزر الأحمر القياسي في الجزء العلوي من النافذة المركزية. ستظهر قائمة منسدلة. انقر على رمز وجع سجل الإعدادات.
- حدد وضع السجل والخيارات المناسبة. يمكن استخدام خيار السجل بشكل دوري، مع التقاط إطار واحد في الدقيقة وإيقاف يدوي. لاحظ وجهة الملف حيث سيقوم البرنامج بحفظ الفيديو. إغلاق إطار إعدادات السجل.
6. إعداد النبات وعلاجه
- ضع الأنابيب الأقل غطاء تحتوي على المواد الكيميائية في رفوف الأنبوب. بدلا من ذلك، يمكن قطع ورقة رغوة البوليسترين ومطعون مع أداة حرق الخشب كما هو موضح في الخطوة 2.3 لجعل رف أنبوب مخصص. يجب أن يكون قطر كل حفرة قريبة جدا من القطر الخارجي للأنابيب بلا غطاء من أجل عقد لهم بحزم.
ملاحظة: مجال رؤية الكاميرا هو عامل الحد الذي ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار عند اتخاذ قرار بشأن كيفية عقد أنابيب أقل غطاء في مكان. - توزيع أنابيب التحكم الإيجابية والسلبية بالتساوي وكذلك الأنابيب التجريبية في الرفوف لحساب التحيز المرتبط بالمنصب17.
- إعداد المواد التالية بجانب النباتات نمت hydroponically: مقص microdissection، طبق ضحل مع الماء، مناديل مهمة حساسة، و69 أنابيب غطاء أقل تحتوي على المواد الكيميائية المختلفة.
- كرر الخطوات التالية لكل مصنع ليتم علاجه. سوف تبقى براعم عباد الشمس دائما في حامل البذور.
- ارفع بعناية حامل البذور وغمس الجذر بسرعة في الطبق الضحل الذي يحتوي على الماء.
- قطع الجذر الأساسي تحت الماء لمنع التجويف. يجب أن يحدث القطع 0.8-1 سم تحت الطرف الأكثر القاعدية من حامل البذور.
- أدخل النبات الطازج في أحد الأنابيب التي تحتوي على المواد الكيميائية.
- إذا كان هناك أي قطرات من الماء على cotyledons، الداب بلطف لهم الجافة مع مسح مهمة حساسة.
ملاحظة: يجب أن يتم هذه الخطوات الأربع في أسرع وقت ممكن (10 دقيقة أو أقل) لمنع التناقضات في دراسة الحركية.
- نقل النباتات تحت كاميرا التصوير الحراري والتأكد من أن جميع النباتات هي ضمن مجال الرؤية للكاميرا. ضبط ارتفاع الكاميرا ووضع الرفوف حسب الضرورة.
7- التسجيل
- تركيز الكاميرا على سطح cotyledons عن طريق الضغط على Ctrl + البديل + A.
- الماوس فوق الزر الأحمر وانقر على خيار تسجيل فيلم. يجب فتح نافذة جديدة تؤكد التسجيل.
- إيقاف التسجيل 1-2 ساعات في وقت لاحق.
ملاحظة: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتاً هنا.
8 - جمع البيانات
- الانتقال إلى ملف | فتح | استعراض للحصول على الصحيح . SEQ الملف وفتحه.
- توقف عن تشغيل الفيلم
- على الجانب الأيسر من النافذة الرئيسية، انقر على إضافة رمز عائد الاستثمار لمؤشر القياس (3x3 بكسل). العائد على الاستثمار يرمز إلى منطقة الاهتمام.
- الماوس فوق مركز كوتيلدون من أول مصنع وانقر على اليسار مرة واحدة. المؤشر 1 الآن في مكانه. تسمية كوتيلدون الثاني من النبات الأول عن طريق تكرار الإجراء. يجب ملاحظة ترتيب التسميات.
- كرر الإجراء. يجب أن تكون جميع النباتات المسمى مع اثنين من المؤشرات.
- انقر على رمز تحرير ROIs. في النافذة الرئيسية، انقر على اليسار مع الاستمرار في الزاوية اليسرى العليا ومرر إلى الزاوية اليمنى السفلى لتحديد جميع ROIs.
- الماوس فوق رمز عارض الإحصائيات وحدد المؤامرة الزمنية. سيتم فتح نافذة جديدة.
- تشغيل الفيلم. سيتم ملء رسم بياني بالبيانات.
- في هذه النافذة، انقر على السهم المزدوج في الزاوية اليمنى العليا لفتح قائمة جديدة.
- انقر على أيقونة الحفظ. حفظ قيم X و Y في المؤامرة (.csv). أغلق البرنامج بمجرد تصدير البيانات.
9 - تحليل البيانات
- افتح ملف .csv باستخدام برنامج تحليل البيانات (على سبيل المثال، Microsoft Excel). لاحظ أن الأعمدة الثلاثة الأولى (من A إلى C) توفر معلومات حول رقم الإطار والوقت المطلق والوقت النسبي. الأعمدة المتبقية تعطي درجة حرارة كل عائد استثمار مع مرور الوقت.
- اتخاذ قرار بشأن طبيعة الأداة الإحصائية التي ستستخدم؛ هذا القرار يعتمد على عوامل مختلفة بما في ذلك التصميم التجريبي.
ملاحظة: في المثال، يتم حساب درجة قياسية، أو درجة z، لكل عينة استنادًا إلى متوسط عدد السكان والانحراف المعياري للسكان. لكل عينة، ثم يتم حساب قيمة p من درجة z. تسمح هذه الطريقة بتأكيد الضوابط الإيجابية والسلبية بالإضافة إلى تحديد المركبات الجديدة التي سيتم اختبارها بشكل أكبر.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تجربة باستخدام صبغة حمراء Erythrosine B (0.8 كيلو دا) يدل على قدرة المواد الكيميائية ليتم استيعابها بشكل واضح من خلال قطع الجذر في cotyledons من شتلة عباد الشمس في غضون 10 دقائق(الشكل 1).
عندما يتم التعامل مع النباتات مع ABA، يتم الكشف عن زيادة في درجة حرارة ورقة في cotyledons عباد الشمس في غضون دقائق. وترتبط هذه الزيادة في درجة حرارة الأوراق بانخفاض في فتحة الفم والتوصيل اتوماتال. لوحظ ارتفاع درجة حرارة الأوراق 15 دقيقة بعد العلاج مع 10 ميكرومتر ABA (p-value = 0.02) و 20 دقيقة مع 5 ميكرومتر ABA (p-value = 0.003)(الشكل 2). وعموما، تبين هذه النتائج أن قياسات درجة حرارة الأوراق عن طريق التصوير الحراري هو وكيل جيد لقياس فتحة الفم والتوصيل.
ويبين الشكل 3 دليلاً على تجربة المفهوم باستخدام مجموعة فرعية من 20 مادة كيميائية من مجموعة ناتبرود مع عناصر تحكم إيجابية (100 ميكرومتر ABA) وضوابط سلبية. وفي هذه التجربة التمثيلية، تتيح المعالجة الإحصائية القائمة على النقاط القياسية تحديد المواد الكيميائية التي تعزز إغلاق الفم، أو، في حين ينبغي تحسين إجراء التقييم لهذا الغرض المحدد، المواد الكيميائية التي تعزز فتح الفم. وفي المثال المعطى، يسمح تصور الخريطة الحرارية للدرجات القياسية بالتعرف السريع على المواد الكيميائية #02 #16 كمرشحين محتملين.
يلخص الشكل 4 الخطوات الهامة لسير العمل.
الشكل 1: فعالية نهج تغذية الجذر المقطوع. (أ)شتلة تتغذى على 1 ساعة مع Erythrosine B في 10 m M MES-KOH (درجة الحموضة = 6.2) هو أحمر واضح (الصورة اليمنى) بالمقارنة مع عنصر التحكم (الصورة اليسرى). تم التقاط الصور بعد تغذية الجذر المقطوعة تليها حضانة بين عشية وضحاها في الإيثانول المطلق لإزالة أصباغ النباتات الطبيعية. شريط = 10 ملم(B)تراكم الإريثروسين B في كوتيلدونس مع مرور الوقت. يمكن الكشف عن الإريثروسين B عن طريق التحليل الطيفي في مقتطفات نباتية من كوتيلدون8 دقيقة (ف قيمة = 0.032) بعد نقل قطع جذر شتلات عباد الشمس إلى الصبغة. تشير أشرطة الخطأ إلى SEM. * تشير إلى قيمة p < 0.05 (n = 3). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: العلاقات بين درجة حرارة الورقة والفتحة الستوماتية والتوصيل لإظهار حساسية التصميم التجريبي. (أ)صورة تمثيلية تظهر الاختلافات في درجة حرارة الأوراق بين 100 ميكرومتر ABA المعالجة (+ABA) وغير المعالجة (التحكم) شتلات عباد الشمس بعد 30 دقيقة تصور عن طريق التصوير الحراري. (ب)إلى اليسار: النباتات المعالجة بـ 100 ميكرومتر ABA لمدة 30 دقيقة تظهر درجة حرارة متزايدة مقارنة بنباتات التحكم (* تشير إلى قيمة p< 0.01)، n = 3). إلى اليمين: تظهر قياسات فتحة الفم على قشور البشرة من نفس النباتات انخفاضاً في فتحة الفم (العرض/الطول) (* يشير إلى قيمة p< 0.01، n = 3، عدد المطامع لكل نبتة × 162). (ج)التوصيل ورقة تقاس مع ورقة porometer ويقترن قياسات درجة حرارة ورقة تبين أن هناك علاقة قوية (معامل بيرسون = -0.89، ن = 6) بين درجة حرارة سطح الورقة والتوصيل اتوماتال. النباتات المعالجة مع 100 ميكرومتر ABA لمدة 30 دقيقة تظهر زيادة في درجة الحرارة وانخفاض التوصيل مقارنة بمحطات التحكم (n = 6). (د)تظهر دراسة استجابة الجرعة انخفاض درجة حرارة الأوراق في النباتات المعالجة بتركيزات ABA منخفضة تصل إلى 5 ميكرومتر بعد 20 دقيقة من العلاج (p-value = 0.0037، n = 3). تشير أشرطة الخطأ إلى SEM. الرجاء النقر هنا لعرض إصدار أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: نتائج تمثيلية من فحص 20 مركبا كيميائيا. (أ)خريطة الحرارة لدرجات Z التي تعكس استجابات النباتات لـ 20 مركبًا تم اختبارها في ثلاثية. يشير اللون الأحمر الداكن والأزرق الداكن إلى مستوى الثقة بنسبة > 99٪ لإغلاق الفم والافتتاح، على التوالي. وعولجت ستة نباتات بمادة DMSO (المراقبة)، وعولجت ثلاثة بـ 100 ميكرومتر من الـ ABA، وعولجت نباتات أخرى بـ 100 ميكرومتر من المواد الكيميائية في ثلاثية. النباتات التي تستجيب للمركب 16 (C # 16) تظهر إغلاق الفم مماثلة لتلك التي لوحظت في النباتات المعالجة ABA. اثنين من النباتات من أصل ثلاثة تعامل مع مركب 02 (C # 02) تظهر زيادة كبيرة في فتح الفم. (ب)حركية استجابة النباتات للمركبات 02 و 16. ويظهر متوسط التغيرات في درجة الحرارة مع مرور الوقت للنباتات التي تستجيب لالمعالجة بالتحكم (n = 6)، 100 ميكرومتر ABA (n = 3) أو 100 ميكرومتر لكل مركب (n = 3). تشير أشرطة الخطأ إلى SEM. التغيرات في درجة الحرارة ذات دلالة إحصائية ثابتة بعد 10 دقيقة من علاج ABA (p-value = 0.026، n = 3)، 15 دقيقة من العلاج بـ C #16 (قيمة p = 0.030، n = 3) و 71 دقيقة من C #02 (p-value = 0.044، n = 3) مقارنة بالتحكم. التقلبات المشتركة من قبل جميع العينات هو الضوضاء الخلفية بسبب السيطرة الديناميكية من درجة الحرارة المحيطة في غرفة النمو. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: ملخص سير عمل الفحص. لاحظ أن الصور تمثل خطوات هامة ومستقلة عن بعضها البعض. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
يعتمد عدد المركبات التي يمكن اختبارها في يوم معين في الغالب على (1) المساحة الخاضعة للرقابة البيئية المتاحة لزراعة النباتات وأداء الشاشة ، وكذلك (2) عدد الأفراد الذين يمكن أن يشاركوا في الخطوة 6 من البروتوكول. نوصي باستخدام ثلاثة نسخ تجريبية لتدعيم تفسير النتائج بعد المعالجة الإحصائية. في يوم نموذجي، يمكن لفرد واحد إلى شخصين فحص 60 مركبًا في ثلاثيات دون صعوبة عن طريق اختبار على سبيل المثال [60 مادة كيميائية + 6 عناصر تحكم سلبية (DMSO) + 3 عناصر تحكم إيجابية (ABA)] في الصباح ومنتصف النهار وبعد الظهر.
تعتمد هذه الطريقة على الشتلات الصحية مع الكوتيلدونات المطورة بالكامل. كما يحدث التصوير من فوق، يجب أن تظهر الشتلات المثالي زاوية 90 درجة بين هيبوثيل وشفرة كوتيلدونري من أجل جمع أكبر قدر ممكن من المعلومات. يتم تنظيم هذه الزاوية بشكل رئيسي بواسطة الضوء وبالتالي يجب تحسينها عن طريق ضبط ظروف النمو. تظهر نتائجنا أن الأمر يستغرق حوالي 10 دقائق لمادة كيميائية للوصول إلى الكوتيلون وبضع دقائق أخرى للرد على مادة كيميائية مثل ABA. هذه الملاحظة تجعل الخطوة 6.4 الخطوة الأكثر حساسية للوقت في البروتوكول. ولذلك فمن الأهمية بمكان لعلاج جميع النباتات في إجراء معين في أقل من 15 دقيقة لتجنب التناقضات بين استجابات النبات. ومن بين العوامل الخارجية التي تؤثر سلباً على قياسات درجة حرارة الأوراق، من المرجح أن تهوية إدخال التحيزات المتعلقة بالمواقع أو تباين كبير بين اليكررات. وينبغي للمستخدمين توخي الحذر من خلال التحكم في تدفقات التهوية والحد من التحيزات المتصلة بالمواقع عن طريق توزيع العينات عشوائياً قبل التسجيل. ولحساب العوامل المحتملة الأخرى، ينبغي أن يتم التسجيل تحت درجة حرارة ورطوبة وظروف إضاءة مماثلة لتلك المستخدمة لزراعة النباتات لأن أي تغييرات في هذه الظروف قد تؤثر على إغلاق المطامع و / أو درجة حرارة الأوراق. وأخيراً، ينبغي تقييم مركب قادر على تعديل إغلاق الستومات لسميته. هذا ينطبق بشكل خاص إذا كان المركب يؤدي إلى إغلاق الفم ، كما هو معروف أن يكون نتيجة غير مباشرة للإجهاد الشديد الذي يعاني منه النبات.
ومن خلال توفير طريقة تسليم فعالة للجزيئات النشطة بيولوجياً وطريقة لقياس نتح النبات مباشرة، يتناول هذا البروتوكول بعض العيوب المرتبطة بنُهج الفحص الحالية، كما ورد في المقدمة. بروتوكولنا ليست حصرية لشتلات عباد الشمس ويمكن تطبيقها على معظم dicots مع نقص الكبوريل لزاوية كوتيلدون من 90 درجة. التصوير الحراري من adaptyledons Arabidopsis فعالة18،19 ، وبالتالي يمكن تكييف ها البروتوكول لدينا لشتلات مع cotyledons صغيرة مماثلة. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن استخدام التصوير الفلوري الكلوروفيل لقياس الأداء الضوئي في تركيبة. وفي حين أن قياسات التراكم الذي يحركه النتح في كوتيلدونس من الإريثروسين باء المضافة إلى كل مادة كيميائية أقل فعالية من حيث الوقت، فمن المحتمل أن تستخدم لتقييم معدلات النتح إذا لم تكن كاميرا التصوير الحراري متاحة. وإجمالاً، تقيّم طريقة الفحص واسعة النطاق هذه بكفاءة استجابة الصحيفة النباتية للجزيئات النشطة بيولوجياً، وهي قابلة للتكيف بسهولة مع مجموعة متنوعة من التطبيقات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدى صاحبي البلاغ ما يكشفان عنه.
Acknowledgments
تم دعم العمل من قبل صناديق بدء كلية بومونا وصندوق منح بدء الأبحاث في هيرش (إلى FJ) بالإضافة إلى برنامج البيولوجيا الجزيئية في كلية بومونا من خلال برنامج مساعد مساعد الأبحاث الصيفية (إلى KG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1020 plastic growing trays without drain holes | Standard 10 x 20 inch trays | ||
| 2.0 mL microtubes, capless | Genesee Scientific | 22-283NC | |
| Abscisic acid (ABA) | Sigma-Aldrich | A1049 | |
| Air pump | Active Aqua | AAPA7.8L | 2 Outlets, 3W, 7.8 L/min |
| Airstones | |||
| Chemical compound library | MicroSource Discovery | Natural Product Collection | |
| Creative Versa-Tool (wood burning tool) | Nasco | 9724549 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO), plant cell culture tested | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Dwarf Sunspot Sunflower seeds | Outsidepride.com | ||
| Erythrosin B | Sigma-Aldrich | 200964 | |
| Hydroponics fertilizer set (FloraBloom, FloraGrow, FloraMicro) | General Hydroponics | GL51GH1421.31.11 | |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| Laptop | Dell | ||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| Microdissection scissors | |||
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| ResearchIR Software | FLIR | ||
| R-Tech Rigid Polystyrene Foam Board | Insulfoam | ||
| Seedholders | Araponics | N/A | |
| Super Tub (plastic utility tub) | Maccourt | ST3608 | 36 x 24 x 8 inch tub used for hydroponics |
| T450sc LWIR (Long-Wave Infrared) Handheld Thermal Imaging Camera | FLIR | FLIR-T62101 | Comes with required charging cable and USB cable needed to connect to laptop |
| Vermiculite | |||
| Water filter | SunSun | HW-304B Pro Canister Filter |
References
- Basu, S., Ramegowda, V., Kumar, A., Pereira, A. Plant adaptation to drought stress. F1000Research. 5, (2016).
- McLachlan, D. H., Kopischke, M., Robatzek, S. Gate control: guard cell regulation by microbial stress. The New Phytologist. 203 (4), 1049-1063 (2014).
- Leung, J., Bazihizina, N., Mancuso, S., Valon, C. Revisiting the Plant's Dilemma. Molecular Plant. 9 (1), 7-9 (2016).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).
- Wigglesworth, M. J., Murray, D. C., Blackett, C. J., Kossenjans, M., Nissink, J. W. Increasing the delivery of next generation therapeutics from high throughput screening libraries. Current Opinion in Chemical Biology. 26, 104-110 (2015).
- Zhao, Y., et al. Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated. Nature Chemical Biology. 3 (11), 716-721 (2007).
- Park, S. Y., et al. Abscisic acid inhibits type 2C protein phosphatases via the PYR/PYL family of START proteins. Science. 324 (5930), 1068-1071 (2009).
- Ma, Y., et al. Regulators of PP2C phosphatase activity function as abscisic acid sensors. Science. 324 (5930), 1064-1068 (2009).
- Cao, M., et al. An ABA-mimicking ligand that reduces water loss and promotes drought resistance in plants. Cell Research. 23 (8), 1043-1054 (2013).
- Okamoto, M., et al. Activation of dimeric ABA receptors elicits guard cell closure, ABA-regulated gene expression, and drought tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 12132-12137 (2013).
- Rodriguez, P. L., Lozano-Juste, J. Unnatural agrochemical ligands for engineered abscisic acid receptors. Trends in Plant Science. 20 (6), 330-332 (2015).
- Kim, T. H., et al. Chemical genetics reveals negative regulation of abscisic acid signaling by a plant immune response pathway. Current Biology. 21 (11), 990-997 (2011).
- Ito, T., et al. Novel Abscisic Acid Antagonists Identified with Chemical Array Screening. ChemBioChem. 16 (17), 2471-2478 (2015).
- Ye, Y., et al. A Novel Chemical Inhibitor of ABA Signaling Targets All ABA Receptors. Plant Physiology. 173 (4), 2356-2369 (2017).
- Takeuchi, J., et al. Designed abscisic acid analogs as antagonists of PYL-PP2C receptor interactions. Nature Chemical Biology. 10 (6), 477-482 (2014).
- Rauf, S., et al. Progress in modification of sunflower oil to expand its industrial value. Journal of the Science of Food and Agriculture. 97 (7), 1997-2006 (2017).
- Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions. Briefings in Bioinformatics. 16 (6), 974-986 (2015).
- Costa, J. M., Grant, O. M., Chaves, M. M. Thermography to explore plant-environment interactions. Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3937-3949 (2013).
- Merlot, S., et al. Use of infrared thermal imaging to isolate Arabidopsis mutants defective in stomatal regulation. The Plant Journal. 30 (5), 601-609 (2002).
