Summary
Wij bieden een methode voor het identificeren van modulatoren van bladtranspiratie door grootschalige screening van een samengestelde bibliotheek.
Abstract
De aanpassing van planten aan biotische en abiotische spanningen wordt beheerst door een verscheidenheid aan factoren, waaronder de regulering van het stomatale diafragma in reactie op watertekort of ziekteverwekkers een cruciale rol speelt. Het identificeren van kleine moleculen die de stomatale beweging reguleren, kan daarom bijdragen aan het begrijpen van de fysiologische basis waarmee planten zich aanpassen aan hun omgeving. Grootschalige screeningbenaderingen die zijn gebruikt om regelgevers van stomabeweging te identificeren, hebben potentiële beperkingen: sommige zijn sterk afhankelijk van het hormoonsignaleringstraject (ABA) van absciszuur (ABA), waardoor aba-onafhankelijke mechanismen worden uitgesloten, terwijl anderen afhankelijk zijn van de observatie van indirecte, langdurige fysiologische effecten zoals plantengroei en -ontwikkeling. De hier gepresenteerde screeningmethode maakt de grootschalige behandeling van planten met een bibliotheek van chemische stoffen in combinatie met een directe kwantificering van hun transpiratie door thermische beeldvorming mogelijk. Aangezien verdamping van water door transpiratie resulteert in bladoppervlakkoeling, biedt thermische beeldvorming een niet-invasieve benadering om veranderingen in stomalaatgeleiding in de loop van de tijd te onderzoeken. In dit protocol worden Helianthus annuuszaailingen hydroponisch gekweekt en vervolgens behandeld door wortelvoeding, waarbij de primaire wortel wordt gesneden en ondergedompeld in de chemische stof die wordt getest. Thermische beeldvorming gevolgd door statistische analyse van cotyledonaire temperatuurveranderingen in de tijd maakt het mogelijk voor de identificatie van bioactieve moleculen moduleren stomatale diafragma. Onze proof-of-concept experimenten tonen aan dat een chemische stof kan worden uitgevoerd van de snijwortel naar de cotyledon van de zonnebloem zaailing binnen 10 minuten. Bovendien kan, wanneer planten met ABA worden behandeld als een positieve controle, binnen enkele minuten een stijging van de temperatuur van het bladoppervlak worden gedetecteerd. Onze methode maakt het dus mogelijk om nieuwe moleculen die het stomatale diafragma reguleren efficiënt en snel te identificeren.
Introduction
Stresstolerantie bij planten is een polygene eigenschap beïnvloed door een verscheidenheid aan moleculaire, cellulaire, ontwikkelings- en fysiologische kenmerken en mechanismen1. Planten in een fluctuerende omgeving moeten hun stomatale bewegingen voortdurend moduleren om de fotosynthetische vraag naar koolstof in evenwicht te brengen, met behoud van voldoende water en het voorkomen van invasie van ziekteverwekkers2; de mechanismen waarmee deze "beslissingen" worden genomen, zijn echter slecht begrepen3. Invoering van bioactieve moleculen in planten kan moduleren hun fysiologie en helpen bij het indringende nieuwe mechanismen van regulering.
De grootschalige screening van kleine moleculen is een effectieve strategie die wordt gebruikt bij de ontdekking van geneesmiddelen tegen kanker en farmacologische testen om de fysiologische effecten van honderden tot duizenden moleculen in een korte periode van tijd te testen4,5. In de plantenbiologie heeft de screening met hoge doorvoer zijn effectiviteit aangetoond, bijvoorbeeld bij de identificatie van het synthetische molecuul pyrabactine6, evenals de ontdekking van de langgezochte receptor van absciszuur (ABA)7,8. Sindsdien zijn agonisten en antagonisten van ABA-receptoren, en kleine moleculen die in staat zijn om de expressie van ABA-inducible reporter genen te moduleren, geïdentificeerd9,10,11,12,13,14,15. High-throughput screening benaderingen die momenteel beschikbaar zijn om kleine verbindingen die kunnen moduleren stomatale diafragma te identificeren hebben een aantal nadelen: (i) protocollen draaien rond de ABA signalering traject kan voorkomen dat de identificatie van nieuwe ABA-onafhankelijke mechanismen, en (ii) in vivo strategieën die worden gebruikt voor de identificatie van bioactieve kleine moleculen zijn voornamelijk afhankelijk van hun fysiologische effecten op zaadkieming of zaailing groei, en niet op de regulering van plantaardige transpiratie per se.
Bovendien, terwijl er vele manieren om planten te behandelen met bioactieve moleculen, de meeste van hen zijn niet goed geschikt voor een grootschalige studie van stomatale beweging. Kortom, de drie meest voorkomende technieken zijn bladtoepassing door spuiten of dompelen, behandeling van het wortelstelsel, en wortelirrigatie. Bladtoepassing is niet compatibel met de meest voorkomende en snelle methoden om stomatale diafragma te meten, omdat de aanwezigheid van druppels op het bladoppervlak de grootschalige gegevensverzameling verstoort. De belangrijkste beperkingen van wortelirrigatie zijn de grote monstervolumevereisten, het potentieel vasthouden van de verbindingen door elementen in de rhizosfeer en de afhankelijkheid van actieve wortelopname.
Hier presenteren we een grootschalige methode om nieuwe verbindingen te identificeren die de transpiratie van planten reguleren, waarbij niet noodzakelijkerwijs ABA- of bekende droogteresponsieve mechanismen nodig zijn en een efficiënte en betrouwbare behandeling van planten mogelijk maakt. In dit systeem worden Helianthus annuusplanten behandeld met behulp van een wortelvoedingsbenadering die bestaat uit het snijden van de primaire wortel van zaailingen die hydroponisch worden geteeld en het onderdompelen van de snijplaats in de monsteroplossing dompelen. Eenmaal behandeld, wordt het effect van elke verbinding op de transpiratie van planten gemeten met behulp van een infrarood warmtebeeldcamera. Aangezien een belangrijke determinant van bladoppervlaktetemperatuur de snelheid van verdamping van het blad is, kunnen thermische beeldgegevens direct worden gecorreleerd aan stomaalgeleiding. De relatieve verandering in bladtemperatuur na chemische behandeling biedt dus een direct middel om de plantaardige transpiratie te kwantificeren.
H. annuus is een van de vijf grootste oliehoudende gewassen in de wereld16 en ontdekkingen rechtstreeks op deze plant kan vergemakkelijken toekomstige overdracht van technologie. Daarnaast hebben H. annuuszaailingen grote en platte cotyledons, evenals een dikke primaire wortel, die ideaal was voor de ontwikkeling van dit protocol. Deze methode kan echter gemakkelijk worden aangepast aan andere planten en een verscheidenheid aan verbindingen.
Dit protocol kan worden gebruikt om moleculen effectief te identificeren die stomatsluiting kunnen veroorzaken of stomatalopenen kunnen bevorderen, wat grote gevolgen heeft voor het begrijpen van de signalen die de geleiding van stomaen en de aanpassing van planten aan het milieu reguleren Benadrukt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Teelt van de planten
- Voeg een 4 cm dikke laag fijne vermiculiet toe aan standaard 10 inch x 20 inch (254 mm x 501 mm) plantenbakken zonder gaten.
- Plaats de zaadhouders (zie Materialentabel) 2 cm uit elkaar in de plantenbakken.
- Vul zaadhouders met vermiculiet.
- Plaats een zonnebloemzaad met zijn puntige uiteinde naar beneden in elke zaadhouder, duwen naar beneden, zodat de helft van het zaad blijft blootgesteld.
OPMERKING: Een zonnebloemzaad is asymmetrisch en het puntige uiteinde van waaruit de radicle zal ontstaan moet naar beneden wijzen. Een goede zaadplaatsing is belangrijk omdat de heroriëntatie van wortel en stengel niet mogelijk is binnen de zaadhouders. Het afgeronde uiteinde van het zaad moet zich uitstrekken langs de bovenkant van de zaadhouder. - Zodra de zaden op hun plaats zijn, bedek ze met een extra 2 cm dikke laag fijne vermiculiet. Water door nevelen van bovenaf. Het oppervlak moet na een uur nat blijven. Als dat het geval is, bedek de trays met deksels.
- Kweek planten in een groeikamer of een kas. Aanbevolen omstandigheden zijn een lichtintensiteit van 140 μmol fotonen·m-2·s-1 en een fotoperiode van 16 uur licht bij 22 °C en 9 uur donker bij 20 °C gedurende 5 dagen.
LET OP: Water geven mag niet nodig zijn, tenzij het oppervlak zichtbaar droog wordt.
2. Opstelling van het hydrocultuursysteem
- Zoek een geschikte grootte container geschikt voor het kweken van planten hydroponically. De grootte van de container moet worden aangepast aan de beschikbare ruimte in de groeikamer of kas. Een minimale diepte van 15 cm wordt aanbevolen.
- Vul de container met gedestilleerd water en voeg algemene hydrocultuur meststof zoals aangegeven door de fabrikant. De resulterende hydrocultuur oplossing moet worden belucht en in constante beweging, die kan worden bereikt met behulp van lucht-en waterpompen.
- Bereid de hydrocultuurdrijvers voor.
- Snijd een vel van 2 cm dik geëxpandeerd polystyreenschuim (zie Materiaaltabel)in de afmetingen van de container. Het blad moet het grootste deel van het oppervlak van de container bedekken om de groei van algen te beperken. Een houtverbrandingsgereedschap is effectief voor het snijden van piepschuim en is veelzijdig genoeg voor dit protocol.
LET OP: Dampen of damp die vrijkomen bij het heet snijden van piepschuim zijn ernstige gevaren voor de gezondheid. Gebruik een goede bescherming tegen de luchtwegen. Gebruikers kunnen ook voldoen aan de ventilatie-eisen door het snijden van het schuim onder een rookkap. - Maak gaten (1-2 cm in diameter) in de polystyreen schuimplaat met behulp van een houtbrandgereedschap. De afstand tussen de centra van twee gaten kan worden aangepast aan de behoeften van het experiment. Een minimale afstand van 2,5 cm wordt echter aanbevolen.
- Snijd een vel van 2 cm dik geëxpandeerd polystyreenschuim (zie Materiaaltabel)in de afmetingen van de container. Het blad moet het grootste deel van het oppervlak van de container bedekken om de groei van algen te beperken. Een houtverbrandingsgereedschap is effectief voor het snijden van piepschuim en is veelzijdig genoeg voor dit protocol.
3. Overdracht van zaailingen naar hydrocultuur en plantengroei
- Trek voorzichtig 5-daagse oude zaailingen uit de vermiculiet en breng onmiddellijk over naar een container gevuld met water gedurende 30 min. Deze stap zal overtollige vermiculiet verwijderen en de resterende pericarps verzachten. De opkomende primaire wortel moet zichtbaar zijn.
- Verwijder de pericarp wanden met de hand indien nodig om de toekomstige uitbreiding van de cotyledons te optimaliseren.
- Breng de zaailingen binnen de zaadhouders over op de schuimdrijver van polystyreen. Laat de planten groeien met een lichtintensiteit van 140 μmol fotonen·m-2·s-1, een relatieve luchtvochtigheid van 65% en een fotoperiode van 16 uur licht bij 22 °C en 9 uur donker bij 20 °C gedurende 2 dagen.
4. Voorbereiding voorafgaand aan de behandeling
OPMERKING: Deze procedure is voor het testen van 20 chemische stoffen uit een kleine samengestelde bibliotheek in drievoud, met 100 μM ABA in 10 mM MES-KOH (pH = 6,2) en 10 mM MES-KOH (pH = 6.2) met respectievelijk 1% (v/v) dimethylsulfoxide (DMSO) als positieve en negatieve controles.
- Zorg ervoor dat er genoeg planten klaar zijn voor behandeling. Planten klaar voor behandeling moet volwassen genoeg zijn om volledig ontvouwde cotyledons hebben, maar jong genoeg dat laterale wortel proliferatie minimaal is. Om een standaard screening te doen, zijn 69 van dergelijke planten nodig.
- Haal de 96-putplaat met de kleine verbindingen uit de vriezer -80 °C. Ontdooi bij kamertemperatuur.
- Bereid 80 mL van 10 mM MES-KOH buffer aangepast aan een pH van 6,2 met 1 M KOH.
- Label cap-less 2 mL microtubes. Bereid ten minste zes buizen voor op de negatieve controlebehandeling (10 mM MES-KOH (pH = 6,2) met 1% (v/v) DMSO). Gebruik drie buizen voor aba-behandeling (100 μM ABA in 10 mM MES-KOH pH = 6,2), positieve controle). Gebruik de resterende 60 buizen om het effect van de 20 chemische stoffen in drievoud te analyseren.
- Breng 10 μL van elke chemische stof (10 mM in DMSO) over in elk van de drie op de juiste wijze gelabelde buizen. Pipet 10 μL van 10 mM ABA opgelost in DMSO in drie buizen en 10 μL DMSO in de zes regelbuizen.
LET OP: Van nature kunnen sommige verbindingen ernstige gezondheidseffecten veroorzaken en moeten gebruikers passende beschermende maatregelen nemen. - Voeg 990 μL van 10 mM MES-KOH (pH = 6.2) toe aan elk van de 69 buizen. Doe de MES-buffer met voldoende kracht af om de chemische stof te mengen met de MES-buffer, maar wees heel voorzichtig om niet zoveel kracht te gebruiken dat de chemicaliën en MES-buffer uit de buis spuiten. Als alternatief, vortex op lage snelheid.
5. Het opzetten van de warmtebeeldcamera
- Monteer de warmtebeeldcamera op een kopieerstandaard. Sluit alle kabels aan op een laptop.
OPMERKING: De opname gebeurt onder temperatuuromstandigheden (20 °C tot 25 °C), vochtigheid (50% tot 70%) en lichtkwaliteit (110 tot 140 μmol fotonen·m-2·s-1)vergelijkbaar met die welke worden gebruikt om de planten te kweken. - Zet de camera aan en open de software voor warmtebeeldanalyse.
OPMERKING: De latere instructies voor de opname zijn van toepassing op een specifieke gebruikte software (zie Tabel met materialen). - Pas de opname-instellingen aan.
- Muis over de record rode knop aan de bovenkant van het centrale venster. Er verschijnt een vervolgkeuzemenu. Klik op het sleutelpictogram Recordinstellingen.
- Selecteer de juiste recordmodus en -opties. De optie Record periodiek, met een frame vastgelegd per minuut en een handmatige stop kan worden gebruikt. Let op de bestandsbestemming waar de software de video opslaat. Sluit het venster Instellingen opnemen.
6. Installatievoorbereiding en -behandeling
- Plaats de cap-less buizen met de chemicaliën in buisrekken. Als alternatief kan een polystyreen schuimplaat worden gesneden en gepord met een houtverbrandingsgereedschap zoals beschreven in stap 2.3 om een op maat gemaakt buizenrek te maken. De diameter van elk gat moet zeer dicht bij de uitwendige diameter van de capless buizen om ze stevig te houden.
OPMERKING: Het gezichtsveld van de camera is een beperkende factor waarmee rekening moet worden gehouden bij de beslissing over hoe de cap-less buizen op hun plaats worden gehouden. - Gelijkmatig verdelen van de positieve en negatieve controle buizen evenals de experimentele buizen in de rekken om rekening te houden met positie-gerelateerde bias17.
- Bereid de volgende materialen naast de gekweekte planten hydroponically: microdissectie schaar, een ondiepe schotel met water, delicate taak doekjes, de 69 cap-less buizen met de verschillende chemische stoffen.
- Herhaal de volgende stappen om elke plant te behandelen. De zonnebloemspruit blijft altijd in de zaadhouder.
- Til voorzichtig de zaadhouder op en dompel de wortel snel in de ondiepe schaal met water.
- Snijd de primaire wortel onder water om cavitatie te voorkomen. De snede moet 0,8-1 cm onder het meest basale uiteinde van de zaadhouder voorkomen.
- Zet de vers gesneden plant in een van de buizen met de chemicaliën.
- Als er druppels water op de cotyledons, voorzichtig dep ze droog met een delicate taak afvegen.
OPMERKING: Deze vier stappen moeten zo snel mogelijk (10 min of minder) worden uitgevoerd om inconsistenties in de kinetiekstudie te voorkomen.
- Verplaats de planten onder de warmtebeeldcamera en zorg ervoor dat alle planten zich binnen het gezichtsveld van de camera bevinden. Pas de camerahoogte en de positie van de rekken zo nodig aan.
7. Opname
- Richt de camera op het oppervlak van de cotyledons door op Ctrl + Alt + A tedrukken.
- Muis over de rode knop en klik op de optie Een film opnemen. Er moet een nieuw venster worden geopend dat de opname bevestigt.
- Stop de opname 1-2 uur later.
LET OP: Het protocol kan hier worden onderbroken.
8. Verzamelen van gegevens
- Ga naar Bestand | Open | Blader naar de juiste . SEQ-bestand en open het.
- Stop met het afspelen van de film.
- Klik aan de linkerkant van het hoofdvenster op het pictogram ROI (3x3 pixels) toevoegen van een metingscursor-ROI (3x3 pixels). ROI staat voor Regio van Belang.
- Muis over het midden van een cotyledon van de eerste plant en links-klik een keer. De cursor 1 is nu op zijn plaats. Label de tweede cotyledon van de eerste plant door de procedure te herhalen. De volgorde van de etiketten moet worden opgemerkt.
- Herhaal de procedure. Alle planten moeten worden gelabeld met twee cursors.
- Klik op het pictogram ROI's bewerken. Klik in het hoofdvenster links en houd linksboven ingedrukt en schuif naar de rechterbenedenhoek om alle ROI's te selecteren.
- Muis over het pictogram Statistische viewer en selecteer Tijdelijke plot. Er gaat een nieuw venster open.
- De film draaien. Een grafiek wordt gevuld met de gegevens.
- Klik in dit venster op de dubbele pijl in de rechterbovenhoek om een nieuw menu te openen.
- Klik op het pictogram Opslaan. Opslaan als X- en Y-waarden in de plot (.csv). Sluit de software zodra gegevens zijn geëxporteerd.
9. Gegevensanalyse
- Open het CSV-bestand met behulp van een gegevensanalysesoftware (bijvoorbeeld Microsoft Excel). Houd er rekening mee dat de drie eerste kolommen (A tot c) informatie geven over het framenummer, de absolute tijd en de relatieve tijd. De resterende kolommen geven de temperatuur van elke ROI in de tijd.
- Beslissen over de aard van het te gebruiken statistische instrument; deze beslissing hangt af van verschillende factoren, waaronder het experimentele ontwerp.
OPMERKING: In ons voorbeeld wordt voor elke steekproef een standaardscore of z-score berekend op basis van populatiegemiddelde en standaarddeviatie van de populatie. Voor elk monster wordt vervolgens een p-waarde berekend op basis van de z-score. Deze methode maakt het mogelijk de bevestiging van de positieve en negatieve controles en de identificatie van nieuwe verbindingen verder te testen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Een experiment met behulp van de rode kleurstof Erythrosine B (0,8 kDa) toont het vermogen aan van chemische stoffen om zichtbaar te worden geabsorbeerd door middel van een gesneden wortel in de cotyledons van een zonnebloem zaailing binnen 10 minuten (figuur 1).
Wanneer planten worden behandeld met ABA, wordt een stijging van de bladtemperatuur gedetecteerd in zonnebloemcotyledons binnen enkele minuten. Deze stijging van de bladtemperatuur wordt geassocieerd met een afname van de stomatale diafragma en stomasale geleiding. Verhoogde bladtemperatuur wordt waargenomen 15 min na behandeling met 10 μM ABA (p-waarde = 0,02) en 20 min met 5 μM ABA (p-waarde = 0,003) (Figuur 2). Over het algemeen tonen deze resultaten aan dat metingen van bladtemperatuur door thermische beeldvorming een goede proxy zijn voor het meten van stomatale diafragma en geleiding.
Figuur 3 toont een proof of concept experiment met behulp van een subset van 20 chemische stoffen uit de NatProd Collection met positieve (100 μM ABA) en negatieve controles. In dit representatieve experiment maakt een op standaardscore gebaseerde statistische behandeling de identificatie mogelijk van chemische stoffen die de sluiting van de stomator bevorderen of, terwijl de test voor dat specifieke doel moet worden geoptimaliseerd, chemische stoffen die de stomatale opening bevorderen. In het gegeven voorbeeld maakt een warmtekaartvisualisatie van de standaardscores de snelle identificatie van chemische #02 en #16 als potentiële kandidaten mogelijk.
Figuur 4 geeft een overzicht van de belangrijke stappen van de werkstroom.
Figuur 1: Effectiviteit van de cut root feeding aanpak. (A) Een zaailing gevoed voor 1 uur met Erythrosine B in 10 mM MES-KOH (pH = 6.2) is zichtbaar rood (rechterbeeld) in vergelijking met de controle (linker afbeelding). De beelden werden genomen na de gesneden wortelvoeding gevolgd door een nachtelijke incubatie in absolute ethanol om de natuurlijke plantenpigmenten te verwijderen. Bar = 10 mm. (B) Accumulatie van Erythrosine B in cotyledons na verloop van tijd. Erythrosine B kan worden gedetecteerd door spectrofotometrie in plantenextracten uit cotyledons 8 min (p-waarde = 0,032) na de overdracht van gesneden zonnebloemzaailingen naar de kleurstof. Foutbalken geven SEM aan. * geeft p-waarde < 0,05 (n = 3) aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 2: Relaties tussen bladtemperatuur, stomaopening en geleiding om de gevoeligheid van het experimentele ontwerp weer te geven. (A) Representatief beeld met verschillen in bladtemperatuur tussen 100 μM ABA-behandeld (+ABA) en niet-behandelde (Control) zonnebloemzaailingen na 30 minuten gevisualiseerd door thermische beeldvorming. (B) Links: planten die gedurende 30 minuten met 100 μM ABA worden behandeld, vertonen een verhoogde temperatuur in vergelijking met controle-installaties (* geeft p-waarde < 0,01), n = 3). Rechts: metingen van stomatale diafragma op opperhuidschillen van dezelfde planten vertonen een afname van het stomatgetal (breedte/lengte) (* geeft p-waarde < 0,01, n = 3, aantal stomata per plant ∙ 162) aan. (C) Bladgeleiding gemeten met een bladporometer en in combinatie met bladtemperatuurmetingen tonen aan dat er een sterke correlatie is (Pearsons coëfficiënt = -0,89, n = 6) tussen de temperatuur van het bladoppervlak en de geleiding van de stomatale voeding. Planten die gedurende 30 min met 100 μM ABA worden behandeld, vertonen een verhoogde temperatuur en een verminderde geleiding in vergelijking met controle-installaties (n = 6). (D) Dosisresponsstudie toont een verminderde bladtemperatuur aan in planten die met ABA-concentraties worden behandeld met een gemiddelde van 5 μM na 20 min behandeling (p-waarde = 0,0037, n = 3). Foutbalken geven SEM aan. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Representatieve resultaten van de screening van 20 chemische verbindingen. (A) Heatmap van Z-scores die plantenreacties op 20 verbindingen weerspiegelen die in drievouden zijn getest. Donkerrood en donkerblauw geven een betrouwbaarheidsniveau aan van >99% voor respectievelijk stomatale sluiting en opening. Zes planten werden behandeld met DMSO (controle), drie werden behandeld met 100 μM ABA en andere planten werden behandeld met 100 μM chemische stof in drievoud. Planten die reageren op verbinding 16 (C#16) vertonen een stomatale sluiting die vergelijkbaar is met die van met ABA behandelde planten. Twee op de drie planten die met samengestelde 02 (C#02) worden behandeld, vertonen een aanzienlijke toename van de stomatiële opening. b) Kinetiek van de respons van planten op verbindingen 02 en 16. Gemiddelde temperatuurveranderingen in de loop van de tijd worden weergegeven voor planten die reageren op de controlebehandeling (n = 6), 100 μM ABA (n = 3) of 100 μM van elke verbinding (n = 3). Foutbalken geven SEM aan. Veranderingen in temperatuur zijn consistent statistisch significant na 10 min ABA-behandeling (p-waarde = 0,026, n = 3), 15 min behandeling met C#16 (p-waarde = 0,030, n = 3) en 71 min C#02 (p-waarde = 0,044, n = 3) vergeleken met controle. Fluctuaties gedeeld door alle monsters is achtergrondgeluid als gevolg van de dynamische controle van de omgevingstemperatuur in de groeikamer. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 4: Samenvatting van de screeningworkflow. Houd er rekening mee dat de afbeeldingen belangrijke stappen vertegenwoordigen en onafhankelijk van elkaar zijn. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het aantal verbindingen dat op een bepaalde dag kan worden getest, hangt meestal af van (i) de milieugecontroleerde ruimte die beschikbaar is om de planten te laten groeien en het scherm uit te voeren, evenals (ii) het aantal personen dat betrokken kan worden bij stap 6 van het protocol. Wij raden het gebruik van drie experimentele replicaties aan om de interpretatie van de resultaten na statistische behandeling te consolideren. In een typische dag kunnen één tot twee personen zonder problemen 60 verbindingen in drievoudscreenen door bijvoorbeeld [60 chemicaliën + 6 negatieve (DMSO) controles + 3 positieve (ABA) controles] in de ochtend, middag en middag te testen.
Deze methode is gebaseerd op gezonde zaailingen met volledig ontwikkelde cotyledons. Aangezien de beeldvorming van bovenaf optreedt, moet een ideale zaailing een hoek van 90° tussen het hypocotyl en het cotyledonaire blad laten zien om zoveel mogelijk informatie te verzamelen. Deze hoek wordt voornamelijk geregeld door licht en moet daarom worden geoptimaliseerd door het aanpassen van de groeiomstandigheden. Onze resultaten tonen aan dat het ongeveer 10 minuten duurt voordat een chemische stof de cotyledons bereikt en nog een paar minuten om te reageren op een chemische stof zoals ABA. Deze observatie maakt stap 6.4 de meest tijdgevoelige stap in het protocol. Het is daarom van cruciaal belang om alle planten in een bepaalde test in minder dan 15 min te behandelen om discrepanties tussen de plantenreacties te voorkomen. Onder de externe factoren die passief van invloed zijn op de temperatuurmetingen van het blad, zal ventilatie waarschijnlijk positiegerelateerde vooroordelen of significante variabiliteit tussen de repliceringen introduceren. Gebruikers moeten voorzichtig zijn door ventilatiestromen te regelen en positiegerelateerde vooroordelen te beperken door de monsters willekeurig te verspreiden voordat ze worden opgenomen. Om rekening te houden met andere mogelijke factoren, moet de registratie worden uitgevoerd onder vergelijkbare temperatuur, vochtigheid en lichtomstandigheden als die welke worden gebruikt om de planten te laten groeien, aangezien eventuele veranderingen in deze omstandigheden de sluiting en/of bladtemperatuur van invloed kunnen zijn. Ten slotte moet een verbinding die in staat is de sluiting van de stomatnale te moduleren, worden beoordeeld op de toxiciteit ervan. Dit geldt met name als de verbinding leidt tot stomatale sluiting, zoals het bekend staat als een indirect gevolg van intense stress ervaren door de plant.
Door een effectieve leveringsmethode van bioactieve moleculen en een methode te bieden om de transpiratie van planten rechtstreeks te meten, behandelt dit protocol enkele van de nadelen die verbonden zijn aan de huidige screeningsbenaderingen, zoals vermeld in de inleiding. Ons protocol is niet exclusief voor zonnebloemzaailingen en kan worden toegepast op de meeste dicots met een hypocotyl tot cotyledon hoek van 90°. Thermische beeldvorming van Arabidopse cotyledons is effectief18,19 en ons protocol kan daarom worden aangepast aan zaailingen met eveneens kleine cotyledons. Bovendien kan chlorofylfluorescentiebeeldvorming worden gebruikt om fotosynthetische prestaties in combinatie te meten. Hoewel minder tijdeffectief, metingen van de transpiratie-gedreven accumulatie in cotyledons van Erythrosine B toegevoegd aan elke chemische stof kan potentieel worden gebruikt om transpiratie snelheden te evalueren als een thermische beeldcamera niet beschikbaar is. Al met al evalueert deze grootschalige screeningmethode de reactie van plantenop bioactieve moleculen efficiënt en is deze gemakkelijk aan te passen aan verschillende toepassingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Het werk werd ondersteund door Pomona College Start-up Fondsen en Hirsch Research Initiatie Grants Fund (aan FJ) evenals de Pomona College Moleculaire Biologie Programma door middel van de Stellar Summer Research Assistant Program (naar KG).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1020 plastic growing trays without drain holes | Standard 10 x 20 inch trays | ||
| 2.0 mL microtubes, capless | Genesee Scientific | 22-283NC | |
| Abscisic acid (ABA) | Sigma-Aldrich | A1049 | |
| Air pump | Active Aqua | AAPA7.8L | 2 Outlets, 3W, 7.8 L/min |
| Airstones | |||
| Chemical compound library | MicroSource Discovery | Natural Product Collection | |
| Creative Versa-Tool (wood burning tool) | Nasco | 9724549 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO), plant cell culture tested | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Dwarf Sunspot Sunflower seeds | Outsidepride.com | ||
| Erythrosin B | Sigma-Aldrich | 200964 | |
| Hydroponics fertilizer set (FloraBloom, FloraGrow, FloraMicro) | General Hydroponics | GL51GH1421.31.11 | |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| Laptop | Dell | ||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| Microdissection scissors | |||
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| ResearchIR Software | FLIR | ||
| R-Tech Rigid Polystyrene Foam Board | Insulfoam | ||
| Seedholders | Araponics | N/A | |
| Super Tub (plastic utility tub) | Maccourt | ST3608 | 36 x 24 x 8 inch tub used for hydroponics |
| T450sc LWIR (Long-Wave Infrared) Handheld Thermal Imaging Camera | FLIR | FLIR-T62101 | Comes with required charging cable and USB cable needed to connect to laptop |
| Vermiculite | |||
| Water filter | SunSun | HW-304B Pro Canister Filter |
References
- Basu, S., Ramegowda, V., Kumar, A., Pereira, A. Plant adaptation to drought stress. F1000Research. 5, (2016).
- McLachlan, D. H., Kopischke, M., Robatzek, S. Gate control: guard cell regulation by microbial stress. The New Phytologist. 203 (4), 1049-1063 (2014).
- Leung, J., Bazihizina, N., Mancuso, S., Valon, C. Revisiting the Plant's Dilemma. Molecular Plant. 9 (1), 7-9 (2016).
- Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nature Reviews Drug Discovery. 10 (3), 188-195 (2011).
- Wigglesworth, M. J., Murray, D. C., Blackett, C. J., Kossenjans, M., Nissink, J. W. Increasing the delivery of next generation therapeutics from high throughput screening libraries. Current Opinion in Chemical Biology. 26, 104-110 (2015).
- Zhao, Y., et al. Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated. Nature Chemical Biology. 3 (11), 716-721 (2007).
- Park, S. Y., et al. Abscisic acid inhibits type 2C protein phosphatases via the PYR/PYL family of START proteins. Science. 324 (5930), 1068-1071 (2009).
- Ma, Y., et al. Regulators of PP2C phosphatase activity function as abscisic acid sensors. Science. 324 (5930), 1064-1068 (2009).
- Cao, M., et al. An ABA-mimicking ligand that reduces water loss and promotes drought resistance in plants. Cell Research. 23 (8), 1043-1054 (2013).
- Okamoto, M., et al. Activation of dimeric ABA receptors elicits guard cell closure, ABA-regulated gene expression, and drought tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (29), 12132-12137 (2013).
- Rodriguez, P. L., Lozano-Juste, J. Unnatural agrochemical ligands for engineered abscisic acid receptors. Trends in Plant Science. 20 (6), 330-332 (2015).
- Kim, T. H., et al. Chemical genetics reveals negative regulation of abscisic acid signaling by a plant immune response pathway. Current Biology. 21 (11), 990-997 (2011).
- Ito, T., et al. Novel Abscisic Acid Antagonists Identified with Chemical Array Screening. ChemBioChem. 16 (17), 2471-2478 (2015).
- Ye, Y., et al. A Novel Chemical Inhibitor of ABA Signaling Targets All ABA Receptors. Plant Physiology. 173 (4), 2356-2369 (2017).
- Takeuchi, J., et al. Designed abscisic acid analogs as antagonists of PYL-PP2C receptor interactions. Nature Chemical Biology. 10 (6), 477-482 (2014).
- Rauf, S., et al. Progress in modification of sunflower oil to expand its industrial value. Journal of the Science of Food and Agriculture. 97 (7), 1997-2006 (2017).
- Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions. Briefings in Bioinformatics. 16 (6), 974-986 (2015).
- Costa, J. M., Grant, O. M., Chaves, M. M. Thermography to explore plant-environment interactions. Journal of Experimental Botany. 64 (13), 3937-3949 (2013).
- Merlot, S., et al. Use of infrared thermal imaging to isolate Arabidopsis mutants defective in stomatal regulation. The Plant Journal. 30 (5), 601-609 (2002).
