헬리안투스 아누스의 대규모 열화상 스크리닝에 의한 새로운 식물 증발 규제 기관 식별
Summary
우리는 화합물 라이브러리의 대규모 스크리닝에 의한 엽간 증발의 변조기를 식별하는 방법을 제공한다.
Abstract
생물학적 및 비생물적 응력에 대한 식물 적응은 다양한 요인에 의해 지배되며, 그 중에서도 물 결핍이나 병원균에 대한 반응으로 구내 조리개 조절이 중요한 역할을 합니다. 따라서 구내 운동을 조절하는 작은 분자를 식별하는 것은 식물이 환경에 적응하는 생리적 기초를 이해하는 데 기여할 수 있습니다. 구내 운동의 조절기를 확인하기 위하여 이용된 대규모 검열 접근은 잠재적인 한계가 있습니다: 몇몇은 abscisic acid (ABA) 호르몬 신호 통로에 크게 의존합니다, 그러므로 ABA 독립적인 기계장치를 제외하, 그 외는 식물 성장 및 발달과 같은 간접, 장기 생리적인 효력의 관측에 의존합니다. 여기에 제시된 스크리닝 방법은 열 화상 진찰에 의한 그들의 증발의 직접적인 정량화와 결합된 화학제품의 도서관을 가진 식물의 대규모 처리를 허용합니다. 열 화상 진찰은 잎 표면 냉각을 통해 물의 증발이 결과적이기 때문에, 시간이 지남에 따라 구내 전도도의 변화를 조사하는 비침습적 접근 방식을 제공합니다. 이 프로토콜에서, Helianthus annuus 묘목은 수경 재배 한 다음 뿌리 공급에 의해 처리되며, 1 차 뿌리가 절단되어 테스트중인 화학 물질로 담근다. 열 화상 진찰은 시간 지남에 따라 cotyledonary 온도 변화의 통계적인 분석에 선행하여 구내 조리개를 변조하는 생리 활성 분자의 식별을 허용합니다. 우리의 개념 증명 실험은 화학 물질이 10 분 이내에 해바라기 모종의 자백에 절단 뿌리에서 수행 될 수 있음을 보여줍니다. 또한 식물을 ABA로 양수 제어로 처리하면 잎 표면 온도의 증가가 몇 분 내에 감지될 수 있습니다. 따라서 당사의 방법은 구내 조리개를 조절하는 신규 분자의 효율적이고 신속한 식별을 가능하게 합니다.
Introduction
식물의 응력 내성은 다양한 분자, 세포, 발달 및 생리적 특징 및 메커니즘에 의해 영향을 받는 다원성 특성1. 변동하는 환경에서 식물은 충분한 물을 유지하고 병원균 침입을 방지하면서 탄소에 대한 광합성 수요의 균형을 맞추기 위해 구내 운동을 지속적으로 조절해야합니다2; 그러나 이러한 트레이드 오프 “결정”이 이루어지는 메커니즘은 제대로이해되지 않습니다 3. 식물에 생리 활성 분자를 도입하면 생리학을 조절하고 새로운 조절 메커니즘을 조사하는 데 도움이 될 수 있습니다.
소분자의 대규모 스크리닝은 단기간에 수백 에서 수천 개의 분자의 생리적 효과를 시험하기 위해 항암 약물 발견 및 약리학적 분석에 사용되는 효과적인전략이다 4,5. 식물 생물학에서, 고처리량 스크리닝은 합성 분자 피라박틴6의식별뿐만 아니라 아시산(ABA)7,8의장기간 요구되는 수용체의 발견에 그 효과를 보여주었다. 그 이후, ABA 수용체의 작용제 및 길항제, 및 ABA 유도성 리포터 유전자의 발현을 조절할 수 있는 소분자는9,10,11, 12,13, 14,15로확인되었다. 구내 조리개를 조절할 수 있는 작은 화합물을 식별하기 위해 현재 사용할 수 있는 고처리량 스크리닝 접근법에는 몇 가지 단점이 있습니다: (i) ABA 신호 전달 경로를 중심으로 회전하는 프로토콜은 새로운 ABA 독립적 메커니즘의 식별을 방지할 수 있습니다. 및 (ii) 생체 활성 소분자의 식별에 사용되는 생체 내 전략은 주로 종자 발아 또는 묘목 성장에 대한 생리적 영향에 의존하며, 식물 증발의 조절에 의존하지 않습니다.
또한 생리 활성 분자로 식물을 치료하는 여러 가지 방법이 있지만 대부분은 구내 인적 이동에 대한 대규모 연구에 적합하지 않습니다. 간단히 말해서, 가장 일반적인 세 가지 기술은 분무 또는 침지, 뿌리 시스템의 치료 및 뿌리 관개에 의한 잎 응용 프로그램입니다. Foliar 응용 프로그램은 리프 표면에 액적의 존재가 대규모 데이터 수집을 방해하기 때문에 구내 조리개를 측정하는 가장 일반적이고 빠른 방법론과 호환되지 않습니다. 루트 관개의 주요 제한 사항은 큰 샘플 부피 요구 사항, 뿌리 구체의 요소에 의한 화합물의 잠재적 보존 및 활성 루트 섭취량에 대한 의존도입니다.
여기에서, 우리는 반드시 ABA- 또는 알려진 가뭄 반응 메커니즘을 포함하지 않는 식물 증발을 조절하고 식물의 효율적이고 신뢰할 수있는 치료를 허용하는 새로운 화합물을 식별하는 대규모 방법을 제시한다. 이 시스템에서 Helianthus annuus 식물은 수경 재배 된 모종의 기본 뿌리를 절단하고 절단 부위를 샘플 용액에 담그는 것으로 구성된 뿌리 공급 방식을 사용하여 처리됩니다. 일단 처리되면, 식물의 증발에 대한 각 화합물의 효과는 적외선 열 화상 카메라를 사용하여 측정됩니다. 잎 표면 온도의 주요 결정요인은 잎에서 증발하는 속도이기 때문에 열화상 데이터는 구내 전도도와 직접 상관관계가 있을 수 있습니다. 화학 처리 후 엽엽 온도의 상대적 변화는 따라서 식물 의 증발을 정량화하는 직접적인 수단을 제공한다.
H. annuus는 세계에서 5 대 오일 시드 작물 중 하나입니다16 이 식물에 직접 만든 발견 기술의 미래 전송을 용이 하 게 수 있습니다. 또한, H. annuus 묘목은 크고 평평한 코틸레톤뿐만 아니라이 프로토콜의 개발에 이상적 이었다 두꺼운 기본 뿌리를 가지고있다. 그러나, 이 방법은 다른 식물 및 다양한 화합물에 용이하게 적응될 수 있다.
이 프로토콜은 구내 폐쇄를 유발하거나 구내 개구부를 촉진할 수 있는 분자를 효과적으로 식별하는 데 사용할 수 있으며, 이는 구내 전도도 및 식물 적응을 환경에 조절하는 신호를 이해하는 데 큰 영향을 미칩니다. 스트레스.
Protocol
Representative Results
Discussion
주어진 날에 시험될 수 있는 화합물의 수는 대부분 (i) 식물을 성장시키고 스크린을 수행할 수 있는 환경 제어 공간에 의존하며, (ii) 프로토콜의 6단계에 관여할 수 있는 개인의 수에 의존한다. 통계적 치료 후 결과의 해석을 통합하기 위해 세 가지 실험 복제를 사용하는 것이 좋습니다. 일반적인 하루에, 1 ~2 개인 을 스크리니브 수 있습니다 60 예를 들어 테스트 하 여 어려움 없이 삼중 화합물 [60 화…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 포모나 대학 창업 기금과 허쉬 연구 개시 보조금 기금 (FJ에)뿐만 아니라 스텔라 여름 연구 보조 프로그램 (KG)을 통해 포모나 대학 분자 생물학 프로그램에 의해 지원되었다.
Materials
| 1020 plastic growing trays without drain holes | Standard 10 x 20 inch trays | ||
| 2.0 mL microtubes, capless | Genesee Scientific | 22-283NC | |
| Abscisic acid (ABA) | Sigma-Aldrich | A1049 | |
| Air pump | Active Aqua | AAPA7.8L | 2 Outlets, 3W, 7.8 L/min |
| Airstones | |||
| Chemical compound library | MicroSource Discovery | Natural Product Collection | |
| Creative Versa-Tool (wood burning tool) | Nasco | 9724549 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO), plant cell culture tested | Sigma-Aldrich | D4540 | |
| Dwarf Sunspot Sunflower seeds | Outsidepride.com | ||
| Erythrosin B | Sigma-Aldrich | 200964 | |
| Hydroponics fertilizer set (FloraBloom, FloraGrow, FloraMicro) | General Hydroponics | GL51GH1421.31.11 | |
| Kimwipes Delicate Task Wipers | Kimberly-Clark Professional | 34155 | |
| Laptop | Dell | ||
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | M2933 | |
| Microdissection scissors | |||
| Microsoft Excel | Microsoft | ||
| Potassium hydroxide (KOH) | Sigma-Aldrich | P5958 | |
| ResearchIR Software | FLIR | ||
| R-Tech Rigid Polystyrene Foam Board | Insulfoam | ||
| Seedholders | Araponics | N/A | |
| Super Tub (plastic utility tub) | Maccourt | ST3608 | 36 x 24 x 8 inch tub used for hydroponics |
| T450sc LWIR (Long-Wave Infrared) Handheld Thermal Imaging Camera | FLIR | FLIR-T62101 | Comes with required charging cable and USB cable needed to connect to laptop |
| Vermiculite | |||
| Water filter | SunSun | HW-304B Pro Canister Filter |
References
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