Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biology

Identifiering av nya regulatorer av växttranspiration genom storskalig termisk avbildningsscreening i Helianthus Annuus

doi: 10.3791/60535 Published: January 30, 2020
* These authors contributed equally

Summary

Vi tillhandahåller en metod för att identifiera modulatorer av bladsompiration genom storskalig screening av ett sammansatt bibliotek.

Abstract

Växtanpassning till biotiska och abiotiska påfrestningar styrs av en rad olika faktorer, bland vilka regleringen av stomatal bländare som svar på vattenunderskott eller patogener spelar en avgörande roll. Identifiera små molekyler som reglerar stomatal rörelse kan därför bidra till att förstå den fysiologiska grund genom vilken växter anpassar sig till sin miljö. Storskaliga screeningmetoder som har använts för att identifiera regulatorer av stomatal rörelse har potentiella begränsningar: vissa är starkt beroende av abcscisic syra (ABA) hormon signalering väg, därför exklusive ABA-oberoende mekanismer, medan andra förlitar sig på observation av indirekta, långsiktiga fysiologiska effekter såsom växttillväxt och utveckling. Den screeningmetod som presenteras här möjliggör storskalig behandling av växter med ett bibliotek av kemikalier i kombination med en direkt kvantifiering av deras transpiration genom termisk avbildning. Eftersom avdunstning av vatten genom transpiration resulterar i bladytkylning, ger termisk avbildning en icke-invasiv metod för att undersöka förändringar i stomatal ledning över tiden. I detta protokoll odlas Helianthus annuus plantor hydroponiskt och behandlas sedan av rotmatning, där den primära roten skärs och doppas i kemikalien som testas. Termisk avbildning följt av statistisk analys av cotyledonary temperaturförändringar över tiden möjliggör identifiering av bioaktiva molekyler modulerande stomatal bländare. Våra proof-of-concept experiment visar att en kemikalie kan transporteras från den skurna roten till cotyledon av solros plantan inom 10 minuter. Dessutom, när växter behandlas med ABA som en positiv kontroll, kan en ökning av bladytans temperatur detekteras inom några minuter. Vår metod möjliggör därmed en effektiv och snabb identifiering av nya molekyler som reglerar stomatal bländare.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Stresstolerans i växter är ett polygent drag som påverkas av en mängd olika molekylära, cellulära, utvecklings- och fysiologiska egenskaper och mekanismer1. Växter i en fluktuerande miljö måste kontinuerligt modulera sina stomatalrörelser för att balansera den fotosyntetiska efterfrågan på kol samtidigt som tillräckligt med vatten upprätthålls och förhindrapatogeninvasion2. De mekanismer genom vilka dessa avvägningsbeslut fattas är dock dåligtförstådda 3. Att införa bioaktiva molekyler i växter kan modulera deras fysiologi och hjälpa till att sondera nya regleringsmekanismer.

Den storskaliga screening av små molekyler är en effektiv strategi som används i anti-cancer drog upptäckt och farmakologiska analyser för att testa de fysiologiska effekterna av hundratals till tusentals molekyler på kort tid4,5. I växtbiologi, hög genomströmning screening har visat sin effektivitet till exempel i identifieringen av den syntetiska molekylen pyrabactin6, liksom upptäckten av den länge eftertraktade receptorn av abscisic syra (ABA)7,8. Sedan dess har agonister och antagonister av ABA-receptorer och små molekyler som kan modulera uttrycket av ABA-inducerar reporter gener har identifierats9,10,11,12,13,14,15. Med screeningmetoder med hög genomströmning för att identifiera små föreningar som kan modulera stomatal bländare har vissa nackdelar: (i) protokoll som kretsar kring ABA-signalvägen kan förhindra identifiering av nya ABA-oberoende mekanismer, och (ii) in vivo strategier som används för identifiering av bioaktiva små molekyler är främst beroende av deras fysiologiska effekter på utsäde grobarhet eller planta tillväxt, och inte på reglering en av anläggningen sedvänjning per se.

Dessutom, medan det finns många sätt att behandla växter med bioaktiva molekyler, de flesta av dem är inte väl lämpade för en storskalig studie av stomatal rörelse. Kortfattat, de tre vanligaste teknikerna är bladanvändning genom sprutning eller doppning, behandling av rotsystemet och rotbevattning. Bladapplicering är inte kompatibel med de vanligaste och snabba metoderna för att mäta stomatal bländare eftersom förekomsten av droppar på lövytan stör storskalig datainsamling. De största begränsningarna av rotbevattning är de stora kravprovvolymen, den potentiella lagringen av föreningarna av element i rhizosfären och beroendet av aktivt rotupptag.

Här presenterar vi en storskalig metod för att identifiera nya föreningar som reglerar växttranspiration som inte nödvändigtvis innebär ABA- eller kända torka-lyhörda mekanismer och möjliggör effektiv och tillförlitlig behandling av växter. I detta system behandlas Helianthus annuus växter med hjälp av en rotutfodring strategi som består i att skära den primära roten av plantor odlas hydroponically och doppa den skurna platsen i provlösningen. När den har behandlats mäts effekten av varje förening på växters inpiration med hjälp av en infraröd värmekamera. Eftersom en viktig bestämningsgrad för bladytans temperatur är avdunstningshastigheten från bladet, kan värmeavbildningsdata direkt korreleras till stomatal ledning. Den relativa förändringen i bladtemperaturen efter kemisk behandling ger således ett direkt sätt att kvantifiera växtens piration.

H. annuus är en av de fem största oljeväxter i världen16 och upptäckter som görs direkt på denna anläggning kan underlätta framtida överföringar av teknik. Dessutom har H. annuus plantor stora och platta cotyledons, samt en tjock primär rot, som var idealisk för utvecklingen av detta protokoll. Emellertid, Denna metod kan lätt anpassas till andra växter och en mängd olika föreningar.

Detta protokoll kan användas för att effektivt identifiera molekyler som kan utlösa stomatal stängning eller främja stomatal öppning, vilket har stora konsekvenser för att förstå de signaler som reglerar stomatal ledning och växtanpassning till miljö Betonar.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Odling av växter

  1. Tillsätt ett 4 cm tjockt lager av fin vermikulit till standard 10 tum x 20 tum (254 mm x 501 mm) växtbrickor utan hål.
  2. Placera fröhållarena (se Materialförteckningen) 2 cm isär i växtbrickorna.
  3. Fyll fröhållare med vermikulit.
  4. Placera ett solrosfrö med sin spetsiga ände ner i varje fröhållare, trycka ner så hälften av fröet förblir exponerade.
    OBS: Ett solrosfrö är asymmetriskt och den spetsiga änden från vilken strålningen kommer att uppstå bör peka nedåt. Korrekt utsäde placering är viktigt eftersom omorientering av rot och stam är inte möjligt inom utsädeshållarna. Fröets rundade ände bör sträcka sig förbi utsädeshållarens överkant.
  5. När fröna är på plats, täck dem med ytterligare 2 cm tjocka lager av fin vermikulit. Vatten genom att dimma ovanifrån. Ytan ska vara blöt efter en timme. Om så är fallet, täck brickorna med lock.
  6. Odla växter i en tillväxtkammare eller ett växthus. Rekommenderade förhållanden är en ljusintensitet på 140 μmol fotoner·m-2·s-1 och en fotoperiod på 16 h ljus vid 22 °C och 9 h mörkt vid 20 °C i 5 dagar.
    Obs: Vattning bör inte vara nödvändigt om inte ytan blir synligt torr.

2. Ställa in hydroponiskt system

  1. Hitta en behållare på lämpligt sätt som lämpar sig för odlingsväxter hydroponiskt. Behållarens storlek bör anpassas till det utrymme som finns i tillväxtkammaren eller växthuset. Ett minimalt djup på 15 cm rekommenderas.
  2. Fyll behållaren med destillerat vatten och tillsätt allmänna hydroponics gödselmedel som anges av tillverkaren. Den resulterande hydroponiska lösningen bör luftas och i ständig rörelse, vilket kan uppnås genom att använda luft- och vattenpumpar.
  3. Förbered hydroponics floaters.
    1. Skär ett ark med 2 cm tjockt expanderat polystyrenskum (se Materialförteckningen)till behållarens mått. Arket bör täcka större delen av behållarens yta för att begränsa algtillväxten. Ett vedeldningsverktyg är effektivt för att skära polystyrenskum och är mångsidig nog för detta protokoll.
      VARNING: Ångor eller ånga som frigörs vid varm skärning av polystyrenskum är allvarliga hälsorisker. Använd korrekt andningsskydd. Förbrukaren kanna också tillfredsställa ventilationen behoven vid skärande skumunder en rök huva.
    2. Gör hål (1-2 cm i diameter) i polystyrenskumsheet med hjälp av ett vedelderat verktyg. Avståndet mellan mitten av två hål kan justeras till behoven i experimentet. Ett minimalt avstånd på 2,5 cm rekommenderas dock.

3. Överföring av plantor till hydroponics och växttillväxt

  1. Dra försiktigt ut 5 dagar gamla plantor från vermikulit och överför omedelbart till en behållare fylld med vatten i 30 min. Detta steg kommer att ta bort överskott vermikulit och mjuka upp de återstående pericarps. Den framväxande primära roten ska vara synlig.
  2. Ta bort pericarp väggarna för hand om det behövs för att optimera den framtida expansionen av cotyledons.
  3. Överför plantorna inom fröhållarena till polystyrenskumfloater. Väx växterna med en ljusintensitet på 140 μmol fotoner·m-2·s-1, en relativ luftfuktighet på 65% och en fotoperiod på 16 h ljus vid 22 °C och 9 h mörk vid 20 °C i 2 dagar.

4. Beredning före behandling

OBS: Detta förfarande är för att testa 20 kemikalier från ett litet sammansatt bibliotek i treexemplar, med 100 μM ABA i 10 mM MES-KOH (pH = 6.2) och 10 mM MES-KOH (pH = 6.2) som innehåller 1% (v/v) dimetylsulfoxid (DMSO) som positiva respektive negativa kontroller.

  1. Se till att det finns tillräckligt med växter redo för behandling. Växter redo för behandling bör vara mogna nog att ha fullt ut ovikta cotyledons, men unga nog att laterala rotspridning är minimal. För att göra en standardscreening behövs 69 sådana växter.
  2. Ta bort den 96-brunnsplatta som innehåller de små föreningarna från frysen -80 °C. Tina i rumstemperatur.
  3. Förbered 80 ml 10 mM MES-KOH buffert justeras till ett pH på 6,2 med 1 M KOH.
  4. Etikett cap-mindre 2 mL mikrorör. Förbered minst sex rör för den negativa kontrollbehandlingen (10 mM MES-KOH (pH = 6.2) innehållande 1 % (v/v) DMSO). Använd tre rör för ABA-behandling (100 μM ABA i 10 mM MES-KOH pH = 6,2), positiv kontroll). Använd de återstående 60 rören för att analysera effekten av de 20 kemikalierna i treexemplar.
  5. Överför 10 μL av varje kemikalie (10 mM i DMSO) till vart och ett av de tre lämpligt märkta rören. Rör 10 μL 10 mM ABA upplöst i DMSO i tre rör och 10 μl DMSO i de sex manöverrören.
    VARNING: Av naturen kan vissa föreningar orsaka allvarliga hälsoeffekter och användare måste vidta lämpliga skyddsåtgärder.
  6. Tillsätt 990 μL 10 mM MES-KOH (pH = 6.2) till var och en av de 69 rören. Avstå från MES buffert med tillräcklig kraft för att blanda kemikalien med MES buffert men var mycket noga med att inte använda så mycket kraft att kemikalier och MES buffert spruta ur röret. Alternativt, virvel i låg hastighet.

5. Ställ in värmekamera

  1. Montera värmekamera på ett kopieringsställ. Anslut alla kablar till en bärbar dator.
    OBS: Inspelningen sker under temperaturförhållanden (20 °C till 25 °C), luftfuktighet (50% till 70%) och ljuskvalitet (110 till 140 μmol fotoner·m-2·s-1) liknande dem som används för att odla växterna.
  2. Slå på kameran sedan den bärbara datorn och öppna värmebildsanalys programvara.
    De efterföljande anvisningarna för registrering gäller för en viss programvara som används (se Materialförteckning).
  3. Justera inspelningsinställningarna.
    1. Musen över den röda knappen högst upp i det centrala fönstret. En rullgardinsmeny visas. Klicka på skiftnyckelikonen Inspelningsinställningar.
    2. Välj lämpligt postläge och alternativ. Alternativet posta periodiskt, med en ram fångas per minut och ett manuellt stopp kan användas. Observera filmålet där programvaran sparar videon. Stäng fönstret Postinställningar.

6. Beredning och behandling av växter

  1. Placera de lockfria rören som innehåller kemikalierna i rörställ. Alternativt kan ett polystyrenskumplåt klippas och petas med ett vedelligt verktyg enligt beskrivningen i steg 2.3 för att göra ett anpassat rörställ. Diametern på varje hål bör vara mycket nära den yttre diametern på de kaplösa rören för att hålla dem stadigt.
    OBS: Kamerans synfält är en begränsande faktor som bör beaktas vid beslut om hur de cap-less rören kommer att hållas på plats.
  2. Jämnt fördela de positiva och negativa kontrollrören samt de experimentella rören i racken för att ta hänsyn till positionsrelaterad bias17.
  3. Förbered följande material bredvid de växter som odlas hydroponically: microdissection sax, en grund maträtt med vatten, delikat uppgift våtservetter, de 69 cap-mindre rör som innehåller de olika kemikalierna.
  4. Upprepa följande steg för varje växt som ska behandlas. Solrosgroden kommer alltid att finnas kvar i utsädeshållaren.
    1. Lyft försiktigt utsädeshållaren och doppa snabbt roten i den grunda skålen som innehåller vatten.
    2. Skär den primära roten under vattnet för att förhindra kavitation. Snittet ska ske 0,8-1 cm under utsädeshållarens mest basala ände.
    3. Infällda den nyligen skurna anläggningen i ett av rören som innehåller kemikalierna.
    4. Om det finns några droppar vatten på cotyledons, försiktigt badda dem torr med en delikat uppgift torka.
      OBS: Dessa fyra steg måste göras så snabbt som möjligt (10 min eller mindre) för att förhindra inkonsekvenser i kinetikstudien.
  5. Flytta växterna under värmekamera och se till att alla växter är inom synfältet på kameran. Justera kamerans höjd och rackposition efter behov.

7. Inspelning

  1. Fokusera kameran på ytan av cotyledons genom att trycka ctrl + Alt + A.
  2. Musen över den röda knappen och klicka på Spela in en film alternativet. Ett nytt fönster som bekräftar inspelningen ska öppnas.
  3. Stoppa inspelningen 1-2 timmar senare.
    Protokollet kan pausas här.

8. Insamling av uppgifter

  1. Gå till Arkiv | Öppna | Bläddra efter rätt . SEQ fil och öppna den.
  2. Sluta spela upp filmen.
  3. På vänster sida av huvudfönstret klickar du på lägg till en symbol för måttmarkörEN ROI (3x3 pixlar). ROI står för Region of Interest.
  4. Musen över mitten av en cotyledon av den första anläggningen och vänsterklick en gång. Markören 1 är nu på plats. Märk den andra kotyledonen av den första anläggningen genom att upprepa proceduren. Etiketternas ordning bör noteras.
  5. Upprepa proceduren. Alla växter bör märkas med två markörer.
  6. Klicka på ikonen Redigera ROI. I huvudfönstret, vänster klicka och håll i det övre vänstra hörnet och bläddra till det nedre högra hörnet för att markera alla ROIs.
  7. Musen över ikonen Statistikvisare och välj Temporal plot. Ett nytt fönster öppnas.
  8. Kör filmen. Ett diagram fylls med data.
  9. I det här fönstret klickar du på dubbelpilen i det övre högra hörnet för att öppna en ny meny.
  10. Klicka på ikonen Spara. Spara som X- och Y-värden i ritytan (.csv). Stäng programvaran när data har exporterats.

9. Dataanalys

  1. Öppna CSV-filen med hjälp av en dataanalysprogramvara (t.ex. Microsoft Excel). Observera att de tre första kolumnerna (A till C) innehåller information om ramnumret, den absoluta tiden och den relativa tiden. De återstående kolumnerna ger temperaturen för varje ROI över tiden.
  2. Besluta om vilken typ av statistikverktyg som ska användas. detta beslut beror på olika faktorer, inklusive den experimentella designen.
    Obs! I vårt exempel beräknas en standardpoäng, eller z-poäng, för varje prov baserat på populationsmedelvärde och populationsstandardavvikelse. För varje exempel beräknas ett p-värde sedan utifrån z-poängen. Denna metod gör det möjligt att bekräfta de positiva och negativa kontrollerna samt identifiering av nya föreningar som ska testas ytterligare.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ett experiment med hjälp av det röda färgämnet Erythrosine B (0,8 kDa) visar att kemikaliernas förmåga att absorberas synligt genom en skuren rot i en solrosplantas kotydrar inom 10 minuter (figur 1).

När växter behandlas med ABA, en ökning av bladtemperaturen detekteras i solros cotyledons inom några minuter. Denna ökning av bladtemperaturen är förknippad med en minskning av stomatal bländare och stomatal ledning. Ökad folfrihetstemperatur observeras 15 min efter behandling med 10 μM ABA (p-värde = 0,02) och 20 min med 5 μM ABA (p-värde = 0,003) (figur 2). Sammantaget visar dessa resultat att mätningar av bladtemperaturen genom termisk avbildning är en bra proxy för att mäta stomatal bländare och ledningsförmåga.

Figur 3 visar ett konceptexperiment med hjälp av en delmängd av 20 kemikalier från NatProd-samlingen med positiva (100 μM ABA) och negativa kontroller. I detta representativa experiment gör en standard-score-baserad statistisk behandling identifiering av kemikalier som främjar stomatal stängning eller, medan analysen bör optimeras för detta specifika ändamål, kemikalier som främjar stomatal öppning. I det givna exemplet möjliggör en värmekartvisualisering av standardpoängen en snabb identifiering av kemikalier #02 och #16 som potentiella kandidater.

Figur 4 sammanfattar de viktiga stegen i arbetsflödet.

Figure 1
Figur 1: Effektiviteten i den skurna rotmatningsmetoden. (A) En planta som matas i 1 h med Erythrosine B i 10 mM MES-KOH (pH = 6.2) är synligt röd (höger bild) jämfört med kontrollen (vänster bild). Bilderna togs efter den skurna roten utfodring följt av en övernattning inkubation i absolut etanol för att ta bort den naturliga växtpigment. Bar = 10 mm. (B) Ackumulering av erytrosin B i cotyledons över tiden. Erytrosin B kan detekteras genom spektrofotometri i växtextrakt från cotyledons 8 min (p-värde = 0,032) efter överföring av rotdämpande solrosplantor till färgämnet. Felstaplar anger SEM. * anger p-värde < 0,05 (n = 3). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Relationer mellan bladtemperatur, stomatal bländare och ledning för att visa känslighet för den experimentella designen. (A)Representativ bild som visar skillnader i bladtemperatur mellan 100 μM ABA-behandlade (+ABA) och icke-behandlade solrosplantor efter 30 min visualiserade genom termisk avbildning. (B) Vänster: växter som behandlats med 100 μM ABA i 30 minuter visar en ökad temperatur jämfört med kontrollanläggningar (* indikerar p-värde < 0,01), n = 3). Höger: mätningar av stomatal bländare på epidermal peeling från samma växter visar en minskning av stomatal bländare (bredd / längd) (* anger p-värde < 0,01, n = 3, antal stomata per anläggning ❯ 162). (C) Bladledning mätt med en bladporometer och tillsammans med mätningar av bladtemperatur visar att det finns ett starkt samband (Pearsons koefficient = -0,89, n = 6) mellan bladytans temperatur och stomatalledning. Växter som behandlats med 100 μM ABA i 30 min visar en ökad temperatur och minskad ledning jämfört med kontrollanläggningar (n = 6). (D) Dosresponsstudie visar minskad bladtemperatur i växter som behandlats med ABA-koncentrationer så låga som 5 μM efter 20 min behandling (p-värde = 0,0037, n = 3). Felstaplar anger SEM. Klicka här för att visa en större version av den här siffran.

Figure 3
Figur 3: Representativa resultat från screening av 20 kemiska föreningar. (A) Heatmap av Z-poäng som återspeglar växtsvar på 20 föreningar som testats i triplicater. Mörkröd och mörkblå indikerar konfidensnivån på >99 % för stomatalstängning respektive öppning. Sex växter behandlades med DMSO (kontroll), tre behandlades med 100 μM ABA, och andra växter behandlades med 100 μM kemiskt i treexemplar. Växter som svarar på sammansatta 16 (C # 16) visar en stomatal stängning liknande den som observerats i ABA-behandlade växter. Två växter av tre behandlade med sammansatta 02 (C # 02) visar en betydande ökning av stomatal öppning. (BKinetik en av svaren från växter på föreningar 02 och 16. Genomsnittliga temperaturförändringar över tid visas för växter som svarar på kontrollbehandling (n = 6), 100 μM ABA (n = 3) eller 100 μM av varje förening (n = 3). Felstaplar indikerar SEM. Temperaturförändringar är genomgående statistiskt signifikanta efter 10 min ABA-behandling (p-värde = 0,026, n = 3), 15 min behandling med C#16 (p-värde = 0,030, n = 3) och 71 min C#02 (p-värde = 0,044, n = 3) jämfört med kontroll. Fluktuationer som delas av alla prover är bakgrundsljud på grund av den dynamiska kontrollen av omgivningstemperaturen i tillväxtkammaren. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: Sammanfattning av screeningarbetsflödet. Observera att bilderna representerar viktiga steg och är oberoende av varandra. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Antalet föreningar som kan testas på en viss dag beror oftast på (i) det miljökontrollerade utrymme som finns tillgängligt för att odla växterna och att utföra skärmen, liksom (ii) antalet individer som kan delta i steg 6 i protokollet. Vi rekommenderar användning av tre experimentella replikat för att konsolidera tolkningen av resultaten efter statistisk behandling. I en typisk dag, en till två individer kan skärm 60 föreningar i triplicates utan svårighet genom att testa till exempel [60 kemikalier + 6 negativa (DMSO) kontroller + 3 positiva (ABA) kontroller] på morgonen, middag och eftermiddag.

Denna metod bygger på friska plantor med fullt utvecklade cotyledons. Eftersom avbildningen inträffar ovanifrån, bör en idealisk planta visa en vinkel på 90° mellan hypocotyl och cotyledonary bladet för att samla in så mycket information som möjligt. Denna vinkel regleras huvudsakligen med ljus och bör därför optimeras genom att justera odlingsförhållandena. Våra resultat visar att det tar cirka 10 min för en kemikalie att nå cotyledons och några minuter att svara på en kemikalie som ABA. Denna iakttagelse gör steg 6.4 det mest tidskänsliga steget i protokollet. Det är därför viktigt att behandla alla växter i en viss analys på mindre än 15 min för att undvika skillnader mellan anläggningens svar. Bland de yttre faktorer som passivt påverkar lygtemperaturmätningar, ventilation är sannolikt att införa positionsrelaterade fördomar eller betydande variationer bland replikat. Användare bör vara försiktiga genom att kontrollera ventilationsflöden och begränsa positionsrelaterade fördomar genom att slumpmässigt distribuera proverna före inspelning. För att ta hänsyn till andra potentiella faktorer bör registrering göras under liknande temperatur-, luftfuktighet och ljusförhållanden som de som används för att odla växterna, eftersom eventuella förändringar i dessa förhållanden kan påverka stomatastängning och/eller bladtemperatur. Slutligen bör en förening som kan modulera stomatal stängning utvärderas med avseende på dess toxicitet. Detta gäller särskilt om föreningen utlöser stomatal stängning, eftersom det är känt för att vara en indirekt följd av intensiv stress upplevs av anläggningen.

Genom att tillhandahålla en effektiv leveransmetod för bioaktiva molekyler och en metod för att direkt mäta växttranspiration, behandlar detta protokoll några av de nackdelar som är förknippade med aktuella screeningmetoder, som nämns i inledningen. Vårt protokoll är inte exklusivt för solrosplantor och kan tillämpas på de flesta dicots med en hypocotyl till cotyledon vinkel på 90 °. Termisk avbildning av Arabidopsis cotyledons är effektiv18,19 och vårt protokoll kan därför anpassas till plantor med liknande små cotyledons. Dessutom kan klorofyllfluorescensavbildning användas för att mäta fotosyntetisk prestanda i kombination. Medan mindre tidseffektiva, mätningar av den transpiration-driven ackumulering i cotyledons av Erythrosine B läggas till varje kemikalie kan potentiellt användas för att utvärdera transpiration priser om en värmekamera inte är tillgänglig. Sammantaget utvärderar denna storskaliga screeningmetod effektivt växtbladsvar på bioaktiva molekyler och är lätt anpassningsbar till en mängd olika applikationer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Arbetet stöddes av Pomona College Start-up Fonder och Hirsch Research Initiation Grants Fund (till FJ) samt Pomona College Molecular Biology Program genom Stellar Summer Research Assistant Program (till KG).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1020 plastic growing trays without drain holes Standard 10 x 20 inch trays
2.0 mL microtubes, capless Genesee Scientific 22-283NC
Abscisic acid (ABA) Sigma-Aldrich A1049
Air pump Active Aqua AAPA7.8L 2 Outlets, 3W, 7.8 L/min
Airstones
Chemical compound library MicroSource Discovery Natural Product Collection
Creative Versa-Tool (wood burning tool) Nasco 9724549
Dimethylsulfoxide (DMSO), plant cell culture tested Sigma-Aldrich D4540
Dwarf Sunspot Sunflower seeds Outsidepride.com
Erythrosin B Sigma-Aldrich 200964
Hydroponics fertilizer set (FloraBloom, FloraGrow, FloraMicro) General Hydroponics GL51GH1421.31.11
Kimwipes Delicate Task Wipers Kimberly-Clark Professional 34155
Laptop Dell
MES hydrate Sigma-Aldrich M2933
Microdissection scissors
Microsoft Excel Microsoft
Potassium hydroxide (KOH) Sigma-Aldrich P5958
ResearchIR Software FLIR
R-Tech Rigid Polystyrene Foam Board Insulfoam
Seedholders Araponics N/A
Super Tub (plastic utility tub) Maccourt ST3608 36 x 24 x 8 inch tub used for hydroponics
T450sc LWIR (Long-Wave Infrared) Handheld Thermal Imaging Camera FLIR FLIR-T62101 Comes with required charging cable and USB cable needed to connect to laptop
Vermiculite
Water filter SunSun HW-304B Pro Canister Filter

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Basu, S., Ramegowda, V., Kumar, A., Pereira, A. Plant adaptation to drought stress. F1000Research. 5, (2016).
  2. McLachlan, D. H., Kopischke, M., Robatzek, S. Gate control: guard cell regulation by microbial stress. The New Phytologist. 203, (4), 1049-1063 (2014).
  3. Leung, J., Bazihizina, N., Mancuso, S., Valon, C. Revisiting the Plant's Dilemma. Molecular Plant. 9, (1), 7-9 (2016).
  4. Macarron, R., et al. Impact of high-throughput screening in biomedical research. Nature Reviews Drug Discovery. 10, (3), 188-195 (2011).
  5. Wigglesworth, M. J., Murray, D. C., Blackett, C. J., Kossenjans, M., Nissink, J. W. Increasing the delivery of next generation therapeutics from high throughput screening libraries. Current Opinion in Chemical Biology. 26, 104-110 (2015).
  6. Zhao, Y., et al. Chemical genetic interrogation of natural variation uncovers a molecule that is glycoactivated. Nature Chemical Biology. 3, (11), 716-721 (2007).
  7. Park, S. Y., et al. Abscisic acid inhibits type 2C protein phosphatases via the PYR/PYL family of START proteins. Science. 324, (5930), 1068-1071 (2009).
  8. Ma, Y., et al. Regulators of PP2C phosphatase activity function as abscisic acid sensors. Science. 324, (5930), 1064-1068 (2009).
  9. Cao, M., et al. An ABA-mimicking ligand that reduces water loss and promotes drought resistance in plants. Cell Research. 23, (8), 1043-1054 (2013).
  10. Okamoto, M., et al. Activation of dimeric ABA receptors elicits guard cell closure, ABA-regulated gene expression, and drought tolerance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, (29), 12132-12137 (2013).
  11. Rodriguez, P. L., Lozano-Juste, J. Unnatural agrochemical ligands for engineered abscisic acid receptors. Trends in Plant Science. 20, (6), 330-332 (2015).
  12. Kim, T. H., et al. Chemical genetics reveals negative regulation of abscisic acid signaling by a plant immune response pathway. Current Biology. 21, (11), 990-997 (2011).
  13. Ito, T., et al. Novel Abscisic Acid Antagonists Identified with Chemical Array Screening. ChemBioChem. 16, (17), 2471-2478 (2015).
  14. Ye, Y., et al. A Novel Chemical Inhibitor of ABA Signaling Targets All ABA Receptors. Plant Physiology. 173, (4), 2356-2369 (2017).
  15. Takeuchi, J., et al. Designed abscisic acid analogs as antagonists of PYL-PP2C receptor interactions. Nature Chemical Biology. 10, (6), 477-482 (2014).
  16. Rauf, S., et al. Progress in modification of sunflower oil to expand its industrial value. Journal of the Science of Food and Agriculture. 97, (7), 1997-2006 (2017).
  17. Caraus, I., Alsuwailem, A. A., Nadon, R., Makarenkov, V. Detecting and overcoming systematic bias in high-throughput screening technologies: a comprehensive review of practical issues and methodological solutions. Briefings in Bioinformatics. 16, (6), 974-986 (2015).
  18. Costa, J. M., Grant, O. M., Chaves, M. M. Thermography to explore plant-environment interactions. Journal of Experimental Botany. 64, (13), 3937-3949 (2013).
  19. Merlot, S., et al. Use of infrared thermal imaging to isolate Arabidopsis mutants defective in stomatal regulation. The Plant Journal. 30, (5), 601-609 (2002).
Identifiering av nya regulatorer av växttranspiration genom storskalig termisk avbildningsscreening i <em>Helianthus Annuus</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Guo, K., Mellinger, P., Doan, V., Allen, J., Pringle, R. N., Jammes, F. Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus. J. Vis. Exp. (155), e60535, doi:10.3791/60535 (2020).More

Guo, K., Mellinger, P., Doan, V., Allen, J., Pringle, R. N., Jammes, F. Identification of Novel Regulators of Plant Transpiration by Large-Scale Thermal Imaging Screening in Helianthus Annuus. J. Vis. Exp. (155), e60535, doi:10.3791/60535 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter