Summary
我们描述了一种扩展的恐惧调节协议，在大鼠中产生过度训练和恐惧孵化。该协议包括一次训练，包括25个音震配对（即过度训练），以及比较在背景和提示测试期间的条件冻结反应48小时（短期）和训练后6周（长期）。
Abstract
情感记忆主要以恐惧调节范式来研究。恐惧条件是一种学习形式，通过这种学习，个人通过这种学习来学习逆境事件和其他中性刺激之间的关系。研究情感记忆的最广泛使用的程序是老鼠的恐惧调节。在这些任务中，无条件的刺激（美国）是单次或多次在单次或多次会话中呈现的足部冲击，并且条件响应 （CR） 是冻结的。在这些程序（称为"恐惧调理"）的版本中，在训练阶段，音调（条件刺激，CS）与脚蹄（美国）配对。在第一次测试中，动物暴露在训练发生的相同环境中，在没有脚蹄和音调（即上下文测试）的情况下测试冻结反应。在第二次测试中，当上下文发生变化时（例如，通过操纵实验室的气味和墙壁）时测量冻结，在没有脚踏车（即提示测试）的情况下显示音调。大多数恐惧调节程序需要很少的音震配对（例如，在一个会话中进行1-3次试验）。人们越来越关注较不常见的版本，这些版本涉及大量配对（即过度训练），这些配对与称为恐惧孵化的长期影响有关（即，恐惧反应会随着时间的推移而增加，而不会进一步暴露于风险事件或有条件的刺激）。延长的恐惧调节任务是理解恐惧孵化的行为和神经生物学方面的关键，包括它与其他心理现象（例如创伤后应激障碍）的关系。在这里，我们描述了一种扩展的恐惧调节协议，在大鼠中产生过度训练和恐惧孵化。该协议包括一次训练，包括25个音震配对（即过度训练），以及比较在背景和提示测试期间的条件冻结反应48小时（短期）和训练后6周（长期）。
Introduction
记忆是一个心理过程，包括不同的阶段：信息获取、整合（允许获取信息的稳定性）和检索（整合过程的证据）1。在合并阶段，将建立新的突触连接并修改预先存在的连接。这表明有必要在一段时间内，分子和生理事件导致这些变化发生1,1，2。这些生理或分子的变化各不相同，无论检索到的事件是否充满情绪（即情感记忆）。例如，研究表明，横向核和基莫拉特杏仁核复合物与情感记忆,3、4、54特别相关。3
情感记忆现象主要研究与恐惧调理范式5,5，6。恐惧条件是一种学习形式，通过它个人学习逆境事件和其他中性刺激之间的关系7。恐惧调理范式在杏仁核中产生分子、细胞和结构变化。此外，恐惧调理在情感记忆的巩固和检索过程中改变海马体的连通性。
研究恐惧记忆最常用的程序之一是大鼠的经典（巴甫洛夫）调理。此过程通常使用脚击 （US） 作为逆刺激，在一次或多次会话中传递一次或多次。接触此程序的大鼠的调节反应（CR）是冷冻（即"由动物骨骼肌肉的一般补性反应引起的普遍不动"，除了呼吸中使用的肌肉外），7）。 此响应可以通过两种类型的测试进行评估：上下文和提示测试。对于上下文测试，该主体在训练过程中会经历一些脚蹄，然后在规定的时间内从实验室中移除。在测试期间，该科目被送回培训进行时所处，在没有脚踏车（例如，冷冻发作的持续时间、百分比或频率）的情况下收集不同的冻结措施，并与培训阶段建立的基线水平进行比较。对于第二种类型的测试，提示测试，刺激（通常是音）在训练阶段与脚踏车配对（即条件刺激，CS）。训练完成后，动物在规定的时间内从训练环境中移走，然后被放置在一个经过修改的上下文中（例如，具有不同的实验室，具有不同形状的墙壁和不同的气味）。然后，给出提示的给定次，对提示的冻结反应进行测量，并与训练期间收集的基线水平进行比较。此范式的最常见版本在一次训练期间使用 1 到 3 个音调冲击配对，然后是数小时或几天后进行的上下文和提示测试。
其他不太频繁的恐惧调节程序涉及大量的休克提示配对（即试验），这通常被称为过度训练程序8。对这些任务的兴趣与它们长期和增加的记忆效应有关，称为恐惧孵化（即，在没有进一步接触逆动事件或有条件刺激的情况下，有条件的恐惧反应会随着时间的推移而增加）9、10、11。9,10,11例如，这种过度训练程序包括100个音震配对的训练阶段，分布在10个会话中，然后是48小时和30天后11、12,的上下文和提示测试。为了避免几天来的广泛训练，Maren（1998年）报告说，在一次训练中可以建立和优化过度训练，有25对8。与训练后48小时测试的老鼠相比，在训练后31天测试的老鼠中，潜伏效应明显更高。延长的恐惧调节任务是理解行为和神经生物学方面的关键，这些方面是恐惧孵化的基础，包括它与其他心理现象（如创伤后应激障碍）的关系（如延迟发作的创伤后应激障碍）11、12、13。11,12,13
在这里，我们描述了一个扩展的恐惧调节协议，它诱发过度训练，在大鼠中潜伏恐惧。与其他需要几天培训的范式不同，目前的协议集中在一次训练8。我们使用25个音-休克配对，在训练后6周进行上下文和提示测试时产生更高的条件冻结反应，而训练后48小时进行的测试。
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Protocol
以下议定书已获康拉德洛伦茨大学机构动物护理和使用委员会批准。国际动物权利联盟、瑞士日内瓦（1989年）发表的动物权利普遍宣言和国际动物权利联盟发布的动物实验道德原则得到尊重。
1. 主题准备
- 选择雄性成年威斯塔大鼠（n = 12）。在开始培训和测试程序之前，将他们放在每笼四个笼子里，进行三天的适应。在整个实验中，为老鼠提供免费用水。在 12 h 明暗循环下（07：00 h 亮起灯），控制室温在 20°C 至 25 °C 之间。
注：大鼠菌株在恐惧调节过程中表现出差异性能。例如，Schaap等人（2013年）报告说，与Fawn Hooded和Brown挪威大鼠12相比，威斯塔和刘易斯菌株表现出更长的冷冻行为持续时间。因此，应评估疼痛和热阈值的差异，以调整冲击的强度和持续时间。 - 每天在同一时间限制食物获取，使大鼠保持85%的自由喂养重量（正常重量在350-400克之间）。在光循环中，每天在同一时间称大鼠体重。在延长的恐惧调节训练开始前三天计算广告量（100% 重量）。
注：本实验中使用的动物在未在此报告的其他仪器测试中进行了测试。这些额外检查需要剥夺食物。这种程序性差异被认为有可能扩大本程序的范围，因为它暗示了工具恐惧综合测试的可能性。然而，只使用恐惧条件测试的研究不需要食物剥夺。 - 随机将受试者分配给以下组之一：训练后6周的情绪测试（n = 6）;训练后 48 小时的情绪测试 （n = 6） 。
- 在暗光循环的光相中，在类似时间进行训练和测试。在训练和测试期间将动物分配到同一实验室，并保持相同的动物顺序。
注：另一种可以实施的控制是在训练和测试阶段平衡动物的顺序。我们建议在评估多个组或跨实验应用不同任务时使用此技术，以减少任务顺序对行为可能产生的影响。
2. 设备设置和冲击校准
- 用 10% 乙醇清洁实验室和不锈钢格栅地板的所有内部表面。在测试每种动物之前重复一遍。
- 使用 USB 电缆将设备连接到计算机，然后启动冻结检测系统设备：CPU、控制柜、红外光、反刺激器/扰动器和冲击强度校准器。
注：虽然该协议是使用市售仪器（材料表）执行的，但可以使用不同品牌的设备和软件。该装置由内部丙烯酸方室（29.53 厘米 x 23.5 厘米 x 20.96 厘米，称为实验室）组成，嵌入在一个木箱中，上面覆盖着塑料外形。外门允许隔离声音、噪音或光线（衰减箱门）。摄像机横向位于外部门的内部部分。内部丙烯酸盒与地板金属网格（36不锈钢棒，每个直径3毫米，空间8毫米，中心到中心）允许脚击交付。在其中一个内面墙壁中，扬声器位于距离地板 6 厘米的位置，以显示听觉提示。 - 将冲击强度校准器（即正向和负连接器）的红色和黑色夹子连接到电网地板上的两根不同杆。将 USB 电缆连接到计算机的相应端口。确保将红色和黑色剪辑连接到由另一根条形分隔的条形图。
注：本节介绍使用材料表中提到的特定品牌设备的冲击 强度校准过程。但是，校准过程可以使用不同品牌的设备执行。建议校准电网地板三个扇区的冲击强度，以验证其是否一致。此外，始终从栅格地板上清除粪便和尿液残留物，以避免在冲击过程中受到干扰。 - 启动冲击强度校准软件（材料表）。单击范围箭头，在应用程序中选择 1.0 mA 的强度。然后，将"运行/停止"开关更改为"运行"。
注：我们建议1.0 mA基于我们的研究与啮齿动物模型在我们的实验室和文献，报告范围从0.75 mA到1.5 mA作为足够的研究恐惧条件33，34，35。33,34,35 - 打开逆刺激器或用于提供脚踏车的设备，并查看应用面板上显示的冲击强度。如果需要，使用逆刺激器上的旋钮将强度调整到 1.0 mA。
注：应将激励器设置为"OUT"，以适当测试、校准和运行实验。
3. 冻结检测系统校准
- 关闭实验室和声音衰减箱门。此时不要引入动物，因为冷冻检测系统校准完成后，动物将被放置在腔室中。检查包装盒内的光强是否介于 20 到 30 lux 之间。
- 启动冻结检测系统软件并打开实验设置对话窗口。输入每个主题的详细信息（如主题标识号、日期和组），并加载标题为"培训协议"VFC.pro文件（http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ）。
注意：上下文和提示测试使用不同的程序配置;因此，请确保在每个测试中使用正确的文件。此时，正确的文件对应于"培训协议VFC.pro"。请记住，在测试阶段，相应的文件将不同于培训课程。 - 选择相应的摄像机，并选中"保存 视频"选项 （如果需要）。将运动 阈值设置为 100，将 最小冻结持续时间设置为 30 帧。
注：此运动阈值基于所用物种的大小（基于像素数）。制造商建议使用最小冻结持续时间值。这些值用于确保适当识别腔室中的动物。 - 验证所选摄像机的实时源是否出现在屏幕上，以及运动阈值图和训练期间显示的不同刺激（例如声音和冲击）的时间线。
注：使用其他品牌，设备设置应提供测量动物运动的可能性，以检测运动的"指数"，以便比较动物移动或冻结的时间。另一种可能性是使用一种软件，只有视频源（在实验期间或实验后）可以检测动物在运动或冻结的时间量，如自由软件 ImageFZ13，在Matlab14中的开源工具箱，或作为JAABA15的动物行为的自由分类器。 - 单击" 校准" 选项三次，同时检查运动指数是否仍低于 100（阈值）。然后，通过单击 屏幕上的相应 按钮将设备锁定。
注：本节介绍使用材料表中列出的特定品牌的设备的冻结检测 系统校准过程。如前所述，校准过程可以使用不同品牌的设备进行（有关设备和软件中不同选项的审查，请参见 Anagnostaras 等人 2010 年）16。
4. 延长恐惧调理训练
- 将老鼠从动物护理设施运送到实验室的行为训练室，用布盖住家里的笼子里。在将动物运送到行为训练室时，避免暴露在噪音或产生压力的条件下。如果同时运送几种动物，则只携带动物进行测试，并将其他大鼠控制在保留室中，以加强实验控制。在开始训练前轻轻处理动物2分钟。
注意：在协议中，动物每天被处理2分钟，然后进行行为训练。处理后，动物被引入实验室。我们建议操纵动物，让老鼠习惯给研究人员。 - 将大鼠引入实验室。轻轻地处理它的尾巴底部，并放在房间的中间。关闭实验室和声音衰减箱门。
- 单击"录制"按钮 开始 会话。让老鼠适应房间3分钟。这 3 分钟周期是设备制造商推荐的标准，用作腔室的基线和习惯时间。
- 提供25个音震配对（试验）与60秒的试间间隔（ITI），从第3分钟开始。在每个 ITI 的最后 10 s 期间呈现音调（条件刺激 = CS;90 dB SPL，2000 Hz，50-ms 上升时间），以及每个 ITI 的最后 2 s 期间的冲击（无空调刺激 = 美国）。
注：激活" 记录 "按钮取决于摄像机的校准和锁定。 - 当28分钟的会话结束时，将大鼠从实验室中取出。将动物返回到各自的家庭笼子。将家中笼子里用布覆盖的老鼠从行为训练室运送到动物护理设施。
- 重复冷冻检测系统校准（步骤 3.1-3.5）和恐惧调节（步骤 4.1 和 4.3）来训练所有受试者。
注：我们强烈建议重新校准每个动物的检测系统，以确保软件在处理冻结检测信息时保持相同的参数。 - 休息时间：在此期间，让动物单独在家庭笼子里休息。在潜伏期6周内，每周监测两次动物体重。在它们加权时，轻轻操纵每个动物两分钟。
5. 上下文测试 = 单个 10 分钟会话
- 训练阶段后，让动物们接受第一个记忆测试，称为上下文测试。在这10分钟的阶段，让大鼠暴露在训练发生的相同环境中，但不存在线索或冲击。将老鼠放在有盖的家笼里（例如，用一块布）从动物护理设施运送到行为训练室。请记住，动物被分成小组，因此一组在训练阶段后48小时进行测试，另一组在训练后6周进行测试（见图1）。
图1：实验的时间轴。请单击此处查看此图的较大版本。
- 用 10% 乙醇清洁实验室和不锈钢格栅地板的所有内部表面。在测试每种动物之前重复一遍。
- 重复冻结检测系统校准（步骤 3.1 到 3.5）。打开 实验设置对话 窗口并加载名为"上下文测试protocol.pro"的文件， 可从http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ。
注：此文件包含此实验阶段的设置，该设置不包含冲击或音调。 - 将动物介绍到实验室。轻轻地处理它的尾巴底部，并放在房间的中间。关闭实验室和声音衰减箱门。
- 单击"录制"按钮 开始 会话。在这个10分钟的上下文测试过程中，没有刺激（既不发出任何声音）。
- 当 10 分钟的会话结束时，将主体从实验室中移除。将动物运到各自的笼子里，将被关在有盖家笼子里的老鼠从行为训练室运送到动物护理设施。重复步骤 5.2-5.5 以测试所有受试者。
6. 提示测试 = 单 13 分钟会话
- 上下文测试后一天，让动物们接受第二次记忆测试，称为提示测试。在这一阶段，大鼠将在13分钟内处于不同的训练环境中;提示（音调）呈现，但没有冲击交付。将家中笼子里的老鼠从动物护理设施运送到行为训练室。测试一组72小时后的恐惧调理训练，并测试另一组6周和训练后一天（图1）。
注：可以实施不同的交通系统（从动物护理设施到实验室），以区分更多的背景和提示测试。由于这些动物被运送到训练课和家庭笼子里的上下文测试课，因此在运送到提示测试课时可以使用不同的运输笼、床上用品和/或盖。 - 用 10% 乙醇清洁实验室和不锈钢格栅地板的所有内部表面。在测试每种动物之前重复一遍。
- 要更改视觉背景，请将塑料周围壁插入实验室。
- 要改变嗅觉环境，将1%醋酸涂抹到棉丝棉签上，并将其放在格栅17、18、19,层下方的金属托盘中。
- 重复冻结检测系统校准（步骤 3.1-3.5）。加载名为文件的文件"Cue protocol.pro"文件，该文件 可从http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ。
注意：此文件包含此实验阶段的设置，包括提供在训练阶段 （CS） 中呈现的相同音调，但在没有冲击的情况下（美国）。 - 将动物介绍到实验室。轻轻地处理它的尾巴底部，并放在房间的中间。关闭实验室和声音衰减箱门。
- 单击"录制"按钮 开始 会话。在单个 13 分钟的提示测试会话中，CS 刺激（音调）显示 10 次，从会话的第 3 分钟开始。
注：前3分钟对应于本课程的基线，然后是10个提示测试试验（即每个10秒），在没有冲击的情况下，使用50个S IT进行。通过使用以前加载的文件自动传递音调。 - 当13分钟的课程结束时，将动物从实验室中取出。将动物运到各自的笼子里，然后将它们运送到动物护理设施。重复步骤 6.2 到 6.5 以测试所有受试者。
7. 数据分析
- 使用冻结检测系统软件获取从视频流派生的一般活动索引（即运动索引）。该软件会自动转换运动索引，以提供每个会话的冻结时间百分比和冻结发作数。将冻结阈值设置为系统的默认最小冻结持续时间设置（1 s = 30 帧）。
- 使用其他自定义程序（从 http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ文件）获取：
- 使用程序确定在培训课程前三分钟（即基线冻结，因为在这 3 分钟之前或期间没有显示冲击或音调）和提示测试课前三分钟期间冻结的百分比。
- 使用该程序确定培训课程中 8 个 3 分钟箱中每个垃圾箱的冻结百分比。
- 使用程序确定提示演示期间的冻结百分比（即音调期间的冻结）和无提示周期（间隔;ITIS），用于培训和提示测试课程。
- 要获取这些数据，请打开冻结检测系统软件。
- 选择 文件 | 报告 | 批处理组件摘要。
- 选择具有扩展名 的文件。CMP 可从 http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ。
- 命名输出文件，将运动阈值更改为 100。然后，单击"确定"。
- 选择要分析的文件（扩展。原始）。这些文件在会话结束时从冻结检测系统软件自动生成，并对应于每个会话的原始数据。最初，这些文件保存在计算机的桌面中，但可以存储在自定义文件夹中（例如，文档恐惧条件），以便于在需要分析时进行后续识别和打开。
- 打开输出文件（扩展名 ）。CSV）。它们可以在电子表格软件中编辑，以作进一步分析。此文件包含实验会话期间的冻结结果。
注：要获取冻结的总百分比，请将主题在会话总时间中所花费的时间除以不动的时间。可以计算冻结事件数，计算通过会话的冻结事件数。在这两种情况下，必须基于最小冻结持续时间定义运动阈值。这是定义是否记录冻结剧集的时间标准。自动记录系统可以使用一定数量的每秒帧 （fps） 作为最小冻结持续时间的度量。例如，采样速率为 30 fps 时，15 帧的最小冻结持续时间将记录为冻结持续 30 秒的固定实例。
- 计算每个会话（训练和测试、上下文和提示）的平均持续时间，方法是将总冻结持续时间（以秒为单位）除以冻结发作的总数。
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Representative Results
使用依赖 t 测试（表1）分析所有科目（n = 12）在培训课程不同阶段的冻结时间百分比变化情况。动物活跃，在训练课前三分钟（协议的第一天）探索实验室，在此期间没有音色或冲击（即基线-BL）。如图 2A 所示，在随后的 25 个音震配对中冻结时间百分比（M = 48.88; SE = 4.37）明显高于 BL 期间（M = 14.65; SE = 4.05），这被假定为恐惧习得的迹象。
| 统计测试 | 图 | 阶段 | ||
| 依赖 t 测试 | 2A | t （11） = -6.21， p <. .001， d = 2.34 | ||
| 3 分钟箱 | ||||
| 重复措施 ANOVA | 2B | F （3.75， 41.32） = 11.19， p <. .001， =p2 = 0.50. | ||
| 阶段 | 组 | 阶段 X 组 | ||
| 混合 ANOVA | 2C | F（3， 30） = 14.21， p <. 001， μp2 =.58 | F（3， 30） = 4.63， p < .05， μp2 =.31 | F（1， 10） = 2.06， p >.05， μp2 ±.17 |
| 单向 ANOVA | 3A | F（1， 10） = 6.91， p <. 05， μp2 =.40 | ||
| 单向 ANOVA | 3B | F（1， 10） = 10.30， p < .05， μp2 =.50 | ||
| 单向 ANOVA | 3C | F（1， 10） = 5.83， p <05， μp2 ±.36 | ||
| 混合 ANOVA | 4A | F（2， 20） = 29.28， p <. 001， μp2 =.74 | F（2， 20） = 2.33， p >.05， μp2 ±.18 | F（1， 10） = 2.14， p >.05， μp2 ±.17 |
| 混合 ANOVA | 4B | F（1， 10） = 1.53， p >.05， μp2 =.13 | F（1， 10） = 3.98， p < .05， μp2 =.28 | F（1， 10） = .23， p >.05， μp2 =.02 |
| 混合 ANOVA | 4C | F（1， 10） = 25.43， p <. 001， μp2 =.71 | F（1， 10） = 6.17， p <. 05， μp2 =.38 | F（1， 10） = .22， p >.05， μp2 =.02 |
表1：数据分析中使用的统计数据。 对于 图 2A，在培训课程前 3 分钟（对应于基线 BL）中所有受试者（n = 12）的冻结平均百分比与课程剩余 25 分钟的冻结百分比（25 个音震试验）进行比较，显示显著差异和较大效果大小（Cohen's d = 2.34）。对于 图 2B，在 3 分钟的条柱上进行了比较，显示重复测量 ANOVA 测试（BL 和 8 个 3 分钟箱）存在显著差异。对于 图2C，通过混合ANOVA与各组大鼠因子（48小时或6周）和受试者内因素阶段（BL、训练、背景测试和提示测试）进行对比，对每组大鼠在基线（BL、训练、背景测试和提示测试）期间冻结的均百分比进行比较。发现阶段和组的差异，但在交互阶段*组中没有差异。 图 3A = 3B 显示了有关活动（面板 3A，运动指数）、冻结（面板 3B，平均冻结秒）和剧集持续时间（面板 3C，以秒为单位的平均冻结时间）的数据。使用单向 ANOVA 对这些数据进行了分析，该分析指出了所有测量中各组之间的差异。最后，对于 图4A = 4C， 对每个面板（A、B 和 C）执行混合 ANOVA，将受试者之间的因子作为组（48 小时或 6 周），而主体内因素为阶段（BL、培训、上下文测试和提示测试）。
图 2：扩展的 cued 恐惧调理协议的训练阶段。 数据显示冻结响应的均值（柱线）和 SEM（误差条）。（A） 显示所有科目在培训课程前3分钟的冻结平均百分比（n = 12），在此期间没有出现冲击或音调（基线、BL），以及课程的剩余25分钟（25次音调冲击试验，间隔，ITI，60秒）;• 与 BL（p <. 001） 不同。（B） 显示所有动物的平均冷冻时间 （n = 12） 在 3 分钟的基线期间 （BL， 没有冲击或色调交付） 和随后的 3 分钟箱的训练课;• 不同于所有剩余的箱（p <.001）。（C） 显示基线（BL，训练前3分钟）、训练期（25个音震配对）、背景测试课和提示测试课期间每组大鼠的冷冻平均百分比（训练后测试48小时;训练后6周测试）。* 与 48 小时后的测试不同 （平均差异上下文 = -34.95， SE = 14.99， p <. .05， 科恩的 d = 1.34）; a = 与训练期不同（平均差异培训48h = 42.51; SE = 7.28; p <.05; 科恩的 d = 3.03）; b = 与训练期不同（平均差异培训 6 周 = 25.94; SE = 7.28; p <.05; 科恩的 d = 1.77）， 上下文测试 （平均差异上下文6 周 = 50.36; SE = 10.58; p <.01; 科恩的 d = 3.13）， 和提示测试 （平均差异Cue6weeks = 55.86; SE = 10.25; p <.01; 科恩的 d = 2.47）。 请单击此处查看此图的较大版本。
通过将训练过程分段8个3分钟（图2B），对整个采集过程中冻结反应进行了分析。这些数据表明，在前三次音震试验（即 Bin 1）期间，分配给此响应的均时达到接近或接近 180 s 的不症状。这一发现在以前的研究中被认为是过度训练的迹象。重复测量 ANOVA 揭示了基线和所有后续条柱之间的一致显著差异，效果大小较大（表 1 和表 2）。
| 比较 | 平均差异 | 标准错误 | p 值 | 科恩的 d |
| 箱基线与箱 1 | -60.075* | 12,243 | <.05 | 1.95 |
| 箱基线与 bin 2 | -69.053* | 16,220 | <.05 | 1.89 |
| 箱基线与箱 3 | -66.197* | 13,706 | <.05 | 1.91 |
| 箱基线与 bin 4 | -68.595* | 11,969 | <.05 | 2.08 |
| 箱基线与箱 5 | -65.475* | 10,991 | <.05 | 2.15 |
| 箱基线与 bin 6 | -65.795* | 13,509 | <.05 | 2.06 |
| 箱基线与 bin 7 | -72.900* | 12,231 | <.05 | 2.53 |
| 箱基线 vs bin 8 | -78.633* | 8,692 | <.001 | 3.37 |
表2：图2B中3分钟箱的均值差、标准 误差和效果大小。 下表显示了基线 Bin 和每个后续条柱之间的比较（图2B）。平均差值、标准误差 、p值和 Cohen 的 d 报告为这些差异大小（效果大小）的索引。
进行了混合的 ANOVA 以测试任务期间冻结百分比的差异，将 阶段（BL、 训练、上下文测试和提示测试）作为主体内因子，组（48 小时和 6 周）作为主体之间的因子（表1）。训练期间所有动物的冷冻百分比明显高于基线期间（见 图2C）。在记忆测试期间与训练期间（ps >..05）的冻结百分比之间没有显著差异。
在 BL、训练和提示测试期间，两组（48 小时和 6 周）的冻结百分比没有显著差异（ps >.115;参见 图 2C）。相反，在训练后6周测试的动物在背景测试中表现出比在48小时测试时测试的动物高得多的冷冻率，效果大（见 图2C）。总体而言 ，图2C 显示，长期延迟上下文和提示测试（即培训后6周）的冻结总体明显高于训练期间。在训练后48小时接受测试的动物群中观察到了相反的下降趋势。但是，48 h 组的这些差异在统计学上并不显著（ps > .05）。最后，虽然冻结水平显示不同阶段的差异，但与其他协议相比，它们可以被视为较低。一种解释可能是实验室之间固有的方法差异或校准过程中确定的运动指数阈值，使得实验室之间的数据比较变得困难。
通过分析其他指标，即平均活动（即运动指数）、每集的总冻结时间和冻结时间，进一步探讨了两activity组受试者在背景测试期间的条件冻结反应。 total freezing time使用单行 ANOVA 测试这些变量之间的差异（表1）。训练后6周测试的受试者的活动明显低于训练后48小时测试的动物（图3A）。因此，训练后不久测试的动物的总冷冻时间明显低于6周后测试的动物的总冷冻时间（图3B）。最后，对每个冷冻发作的平均持续时间的分析表明，在训练后6周测试的动物比训练后测试的48小时的动物表现出更长的冷冻发作（图3C）。总之，这些发现表明存在恐惧孵化效应。
图3：延长的cued恐惧调节协议对大鼠冷冻反应的影响。
数据显示冻结响应的均值（柱线）和 SEM（误差条）。（A） 显示背景测试期间每组科目的活动（即运动指数）（训练后测试48小时;训练后6周测试）;* 与 6周不同。（B） 显示上下文测试期间每组受试者的平均总冻结时间（以秒为单位）;* 与 6周不同。（C） 显示上下文测试期间每组受试者每组冻结事件的平均持续时间（以秒为单位）;* 只与 6周不同。 请单击此处查看此图的较大版本。
通过分析（a） 基线期间（BL 培训和 BL 提示测试）和整个 10 分钟的提示测试（10 次 10 s 音调演示和 10 个 50 秒的 IT I- 图 4A）的冻结百分比，对提示测试会话期间的性能进行了进一步检查。 （b） 在提示（音调）的10次演示中，训练和提示测试会议（图4B）和（c） 50秒期间的平均冻结时间（以秒为单位）（ITI;即 仅无音调周期 = 图 4C。混合的ANOVA用于分析这些依赖性度量， 假设阶段 （BL训练、BL提示测试和提示测试）作为主体内 因子 ，组（48小时和6周）作为主体之间的因子（表1）。如图 4A所示，与BL训练（即在任何暴露于音调和冲击之前），在提示测试课程的基线（BL提示测试;前3分钟的实验）和10分钟的提示测试期间，在训练后6周测试的老鼠组显著增加了冷冻百分比。在48小时后测试的一组大鼠（p>05）未观察到BL训练和BL 提示之间的类似差异。对于两组大鼠，10 分钟提示测试期间的冻结百分比高于同一会话的相应基线周期（BL 提示测试），这表明检索效果。不同时期的冷冻百分比（ps>.05）没有 观察到大鼠组之间存在差异。
图 4B 显示了在训练（音调-休克配对）和提示测试（仅音调演示）的 10 个音调演示期间，特别是平均冻结时间（以秒为单位）的比较。只有大鼠在训练后6周进行试验，显著增加了在提示期间冻结的时间量。
最后，如图 4C所示，只有一组大鼠在训练后48小时测试，显著减少了从训练课到提示测试期间的冻结时间。在两组大鼠（ps>.05）中，在 ITIS 期间没有冻结时间的差异。
图4：扩展的 cued 恐惧调节协议对提示测试期间冻结响应的影响。
数据显示冻结响应的均值（柱线）和 SEM（误差条）。（A） 显示训练课前 3 分钟（BL、基线）、提示测试课前 3 分钟（BL 提示）和提示测试（提示测试 10 分钟）中每组受试者的冻结百分比（训练后测试 48 小时;训练后测试 6 周）。 a = 与 48 小时后的提示测试不同 （平均差异 Bltrain- Cue48h = 32.84; SE = 10.25; p <.05; 科恩的 d = 1.52）; b = 不同于 BL 提示测试 （平均差异Blcue-BL6weeks = 33.98; SE = 8.36; p <.05; 科恩的 d = 1.59） 和提示测试 （平均差异 Cue- bl6week = 55.86; SE = 10.25; p <.05; 科恩的 d = 2.47）; c = 与 48 小时后的提示测试不同 （平均差异Blcue-Cue48h = 18.99; SE = 5.17; p <.05; 科恩的 d = 0.67）; d = 6 周后与提示测试不同 （平均差异Blcue - cue6 周 = 21.87; SE = 5.17; p <.05; 科恩的 d =. 88） 。（B） 显示训练和提示测试期间每组科目的提示（音调）的平均冻结时间（以秒为单位）;* 与提示 测试测试期间的 6 周不同 （平均差异训练- Cue6 周 = - 3.14; SE = 1.37; p <.05; 科恩的 d = 1.64）。（C） 显示两组大鼠（48 小时和 6 周）在训练课（10 次音震配对）和提示测试（10 次仅音量演示）的审间间隔（以秒为单位）期间的平均冻结时间;• 不同于训练后 48 小时测试的大鼠组训练（平均差异训练-Cue48h = 506.16; SE = 95.08; p <.001; 科恩的 d = 2.48）。 请单击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
目前的扩展恐惧调节协议是一种有效和有效的方法来评估短期（48小时）和长期（6周）的情绪记忆。因此，该协议允许研究大鼠过度训练和恐惧孵化现象。该协议的不同优点包括：它提供了两种类型的内存测试，即上下文和提示，允许识别两个延迟（48 小时和 6 周）跨上下文和提示操作的差异效应。第二，这项任务需要一次28分钟的训练，这反过来又会产生长期的影响，延长几个星期。考虑到某些版本的扩展恐惧调理需要至少 100 次冲击， 在 10 次训练 11 中， 这一优势是显著的。第三，该协议提供了几种测量方法，这些方法是自动计算的。此外，还有越来越多的药理学、生理学和解剖学证据支持这一范式的有效性，用于评估情绪记忆现象15，16。15,16
与其他有简短训练课程（即试验很少）的恐惧调节模式相比，导致过度训练效果的扩展协议受到的关注较少。然而，延长的恐惧调节任务是理解恐惧孵化的基本行为和神经生物学过程的关键，包括它与其他心理现象（如延迟发作的创伤后应激障碍）的关系11，12，13。,12,13目前的恐惧调节协议可靠地产生恐惧孵化。与训练后48小时测试的动物相比，训练后6周评估的动物的冷冻时间较高，运动指数较低。此外，在每种类型的测试中，可以不同地观察到这种效果;具体来说， 在训练后 6 周的上下文测试期间更长的冻结情节， 在训练后 6 周的提示演示期间增加冻结。与后一种效应有关（即训练后6周的提示演示期间冻结的增量），似乎可以丢弃实验情况的新颖性（即新背景），因为同一会话期间的基线冻结水平明显低于后续的提示演示期间。
虽然两组人都有恐惧学习的趋势（即3分钟基线与训练之间的差异），但经过48小时（背景）和72小时（提示）测试的动物在两次测试中在冷冻水平上没有显著差异。这可被视为协议的限制，这似乎是 48 h 组中行为变异性高的结果（参见 图 2C）。为了减少变异性和改进程序，可以实施的方法论改变是训练后进行上下文和提示测试 24 小时，这在某些恐惧调节程序中很常见。
本协议可应用于临床研究23.实施后产生的强烈记忆痕迹和孵化作用可能允许测试经常用于治疗心理和精神病理的药物（如焦虑或情绪调节器治疗24）对情绪记忆现象（如恐惧灭绝）25、26、27,26,27的影响。因此，该协议可以允许测量药物对不同时间帧的记忆轨迹的影响，包括生物相关物，如神经递质和分子相关的记忆维持28，29。28,该协议也可能与具有转化视角的研究相关，该研究提出，恐惧范式可能有助于测试行为疗法30的临床前模型和物种21、22,等对恐惧的比较研究。最后，从神经生物学的观点来看，本协议是一个可靠的模型，用于研究大脑机制、结构、网络或神经元群之间的通信，这些结构、网络或神经元合奏涉及情感记忆的长期采集、巩固和储存，或在发育过程中孵育的影响。
该协议的其他一些方面值得讨论。在整个实验中，食物剥夺被使用。之所以采用这一决定，是因为基于食物奖励（如操作或器乐技术）33、34、35,34,35的其他行为测试可以与最小的变化相结合，使目前的协议成为一种更加通用的技术。例如，我们已经成功地将该协议与基于车轮的锻炼协议和 T-maze 内存任务集成在一起。另一个方面与此协议中实现的组大小 （n=6） 相关。虽然这是一个相对较小的样本，并且肯定建议使用较大的样本，但孵化效果的大小可以补偿这一限制（见表1）。这可以被认为是这项议定书的一个优势，特别是关于动物委员会根据减少原则提出的建议。该协议的一个限制是，没有评估很少或没有接触脚蹄和恐惧孵育的时间过程。具有前一条件的额外对照组可以增加实验设计的严格性。
本协议的最佳实施和结果的最终建议包括正确清洁实验室，特别是网格地板，在训练每个主体之前校准冲击强度（例如，粪便和尿液通常会降低腔室不同区域的冲击强度的可靠性）和冷冻检测系统校准（冻结措施的可靠性取决于正确设置运动阈值和最小冻结持续时间）。
该协议可以与其他老鼠或其他啮齿动物（如小鼠或蒙古鼠）进行试验，扩大应用范围。在这种情况下，调整冲击强度、运动和持续时间阈值非常重要。小鼠在恐惧调节协议中使用的休克强度通常为0.4 mA至1.5 mA，而0.75 mA常报告,有效强度为16、36、37、38,36和1.5 mA，报告强度最高为39。37,38蒙古格比尔是一种啮齿动物模型，由于害怕调理研究而较少选择;然而，蒙古格比尔已经成功地用于模型在哺乳动物40的昼夜节律。因此，目前的协议可以实施，以研究昼夜节律和情绪记忆之间的潜在关系，这两者都与疾病有关，如抑郁，焦虑或情绪改变41，42。41,在gerbils的情况下，这个和类似的逆向调节协议的有效冲击强度范围是1.0和4.0 mA 43，44，45，46。43,44,45,46最后，重要的是要注意，运动和持续时间阈值应根据选择的物种47调整。这些阈值是在运动跟踪软件上设置的限制，超过该限制，动物行为被注册为运动，低于该阈值，软件将记录冻结。在小鼠和鼠的逆向调节研究中，报告的有效运动和持续时间阈值分别是25和30 fps（即最小1 s不动），分别是30、35。,35
为了确保对逆向刺激（脚蹄）的充分控制，网格地板的所有扇区必须提供相同的强度。建议校准电网地板三个扇区的冲击强度，以验证其是否一致。这样可以防止动物通过移动到出低强度的盒子里的位置来学习减少冲击。如果校准显示金属栅格未在所有扇区中提供相同强度，请从地板上拆下网格，清洁杆，并更换腔室中的网格。电网地板必须正确插入腔室，以确保从逆向刺激装置到电网地板的最佳输电。
冷冻检测系统摄像机的对焦和光圈由制造商校准。但是，如果需要额外的校准，松开对焦环上的固定螺钉，进行调整，直到实现清晰的图像，然后拧紧对焦环上的固定螺钉。制造商建议将镜头打开锁定在最大打开位置。要达到此设置，请确保开口环的白点与镜头筒上的数字 1.4 对齐。建议参考制造商手册。请注意，如果调整了摄像机的焦点，则还必须使用相应的软件对摄像机进行校准。相机校准需要调整亮度、增益和快门。建议参考制造商手册，获取有关摄像机校准过程的精确说明。
总之，该协议允许在短期和长期测试情绪记忆，并产生长期的恐惧孵化。这种恐惧孵化效应是通过单一会话过度训练产生的，在6周后在上下文和提示测试中显示效果。这表明强烈的情感记忆痕迹。目前的协议是探索大鼠情感记忆成分的一种有效和有效的方法。
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Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
孔拉德·洛伦茨大学基金会为这项研究提供了财政支持，赠款号9IN15151。作者要感谢康拉德·洛伦茨大学通信系在录制和编辑视频方面的帮助，特别是娜塔莉亚·里维拉和安德烈斯·塞拉诺（制作人）。此外，妮可·普法勒-萨多夫斯基和卢西亚·梅迪纳对手稿发表了评论，伊比利亚美洲大学学院院长约翰娜·巴雷罗对手稿发表了评论。作者没有利益冲突。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acetic acid (ethanoic acid) | https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/compound/acetic_acid | ||
| Aversive Stimulation Current Package | MED Associates Inc | ENV-420 | https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/ |
| Contextual test protocol.pro | http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ | ||
| Cue test protocol.pro | http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ | ||
| Curved Wall Insert | MED Associates Inc | VFC-008-CWI | https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/ |
| Data processing.zip | http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ | ||
| NIR/White Light Control Box | MED Associates Inc | NIR-100 | |
| Quick Change Floor/Pan Unit for Mouse | MED Associates Inc | ENV-005FPU-M | https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/ |
| Small Tabletop Cabinet and Power Supply | MED Associates Inc | SG-6080D | https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/ |
| Standalone Aversive Stimulator/Scrambler (115 V / 60 Hz) | MED Associates Inc | ENV-414S | https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/ |
| Standard Fear Conditioning Chamber | MED Associates Inc | VFC-008 | https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/ |
| Training protocol VFC.pro | http://doi.org/10.17605/OSF.IO/4NKFQ | ||
| Video Fear Conditioning Package for Rat | MED Associates Inc | MED-VFC-SCT-R | https://www.med-associates.com/product-category/video-fear-packages-for-rat/ |
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