Summary
La coltivazione ascia su scala bench facilita la caratterizzazione delle microalghe e l'ottimizzazione della produttività prima della successiva scalabilità del processo. I fotobioreattori forniscono il controllo necessario per esperimenti di microalghe affidabili e riproducibili e possono essere adattati per coltivare in modo sicuro le microalghe con i gas corrosivi (CO2, SO2, NO2) dalle emissioni di combustione municipale o industriale.
Abstract
I fotobioreattori sono sistemi di coltivazione illuminati per esperimenti su microrganismi fototrofici. Questi sistemi forniscono un ambiente sterile per la coltivazione di microalghe con temperatura, pH, e la composizione del gas e il controllo della portata. Su banco, i fotobioreattori sono vantaggiosi per i ricercatori che studiano le proprietà microalghe, la produttività e l'ottimizzazione della crescita. Su scala industriale, i fotobioreattori possono mantenere la purezza del prodotto e migliorare l'efficienza produttiva. Il video descrive la preparazione e l'uso di un fotoreattore su scala da banco per la coltivazione di microalghe, compreso l'uso sicuro di input di gas corrosivi, e descrive le misurazioni rilevanti della biomassa e i calcoli della produttività della biomassa. In particolare, il video illustra lo stoccaggio e la preparazione della coltura microalgale per l'inoculazione, l'assemblaggio e la sterilizzazione del fotobioreattore, le misurazioni della concentrazione di biomassa e un modello logistico per la produttività della biomassa microalgale con tasso compresi i prodotti massimi e complessivi della biomassa. Inoltre, poiché vi è un crescente interesse per gli esperimenti per coltivare microalghe utilizzando emissioni di gas di scarico simulate o reali, il video riguarderà gli adattamenti delle apparecchiature fotobiochimico necessari per lavorare con gas corrosivi e discutere il campionamento sicuro in tali scenari.
Introduction
I fotobioreattori sono utili per esperimenti controllati e la coltivazione di prodotti microalgali più puri di quelli che possono essere raggiunti da stagni aperti. La coltivazione di microalghe in fotobioreattori su scala da banco supporta lo sviluppo di conoscenze fondamentali che possono essere utilizzate per la scalabilità dei processi. Piccoli cambiamenti alle condizioni ambientali possono alterare significativamente gli esperimenti microbiologici e confondere i risultati1. Un processo sterile con controllo della temperatura, del pH e del sparging di gas è vantaggioso per studiare le proprietà e le prestazioni delle microalghe in condizioni diverse. Inoltre, il controllo sulle concentrazioni di gas di input, la temperatura, la forza di taglio dalla miscelazione e il pH medio possono supportare diverse specie che altrimenti sono difficili da coltivare. I fotobioreattori possono essere eseguiti come un processo batch con alimentazione continua di gas e sparging, o come un sistema di flusso chemostat con alimentazione continua di gas e sparging oltre a input di nutrienti per acque reflue influenti ed effluenti. Qui, dimostriamo il processo batch con alimentazione continua di gas e sparging.
L'uso di fotobioreattori affronta diverse sfide legate alla coltivazione e produzione di microalghe. Il campo generalmente lotta con le preoccupazioni di contaminazione da altri microrganismi, l'utilizzo efficiente del substrato (che è particolarmente importante nel caso della mitigazione di CO2 o del trattamento delle acque reflue)2, il controllo del pH, la variabilità dell'illuminazione e la produttività della biomassa3. I fotobioreattori consentono ai ricercatori di studiare un'ampia gamma di fototrofi in sistemi a lotti strettamente controllati, dove anche le specie a crescita lenta sono protette da predatori o microrganismi concorrenti4. Questi sistemi batch sono anche migliori per facilitare maggiori tassi di utilizzo diCO2 e la produttività della biomassa perché sono sistemi chiusi che hanno maggiori probabilità di essere in equilibrio con i gas forniti. La tecnologia fotobioreattore offre anche il controllo del pH, la cui mancanza ha ostacolato l'elevata produttività della biomassa negli studi precedenti5. Su scala da banco, il livello di controllo offerto dai fotobioreattori è vantaggioso per i ricercatori. Su scale industriali più grandi, i fotobioreattori possono essere utilizzati per mantenere la purezza dei bioprodotti commerciali e migliorare l'efficienza produttiva per applicazioni nutraceutiche, cosmetiche, alimentari o di mangimi6.
Le microalghe sono di grande interesse per la biosequestro di CO2 perché possono risolvere rapidamenteco2 come carbonio biomassa. Tuttavia, la maggior parte delle fonti antropogeniche di CO2 sono contaminate da altri gas o contaminanti corrosivi e tossici (NOx, SOx, CO, Hg), a seconda della fonte di combustibile del processo di combustione. Il crescente interesse per il sequestro sostenibile di CO2 ha spinto lo sviluppo di tecnologie fotobioreattori per il trattamento delle emissioni ricche di CO2,come quelle delle centrali elettriche a carbone (tabella 1). Purtroppo, vi è un rischio intrinseco di esposizione umana e ambientale ai contaminanti corrosivi e tossici durante i processi di ricerca e scale-up. Di conseguenza, è necessario e istruttivo descrivere l'assemblaggio e il funzionamento sicuri dei bioreattori che utilizzano gas corrosivi.
Questo metodo è per l'uso di un fotobioreattore in scala da banco 2 L per la crescita di microalghe in condizioni sperimentali attentamente controllate. Il protocollo descrive lo stoccaggio microalghele, la preparazione dell'inoculo e l'impostazione e la sterilizzazione del fotobioreattore. Oltre al funzionamento di base, questo lavoro descrive le misurazioni della biomassa microalgale e i calcoli della produttività della biomassa, e l'adattamento delle attrezzature per la coltivazione di microalgali con gas corrosivi. Il protocollo descritto di seguito è appropriato per i ricercatori che cercano di esercitare un maggiore controllo sperimentale, ottimizzare le condizioni di crescita delle microalghe o produrre assianicamente una serie di microbi fototrofici. Questo metodo non descrive materiali appropriati per la coltivazione di microbi che producono o consumano gas infiammabili (ad esempio CH4, H2,ecc.) 7.
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Protocol
1. Uso sicuro e campionamento di un fotobioreattore risparmiato con gas corrosivi
NOTA: Questo metodo non descrive le procedure appropriate per il campionamento sicuro delle colture microalgali che producono o consumano gas altamente infiammabili.
- Gestire il gas tossico come un rischio per la salute umana.
NOTA: Secondo il piano di igiene chimica dell'Università dell'Iowa, gli autori hanno lavorato con il coordinatore della sicurezza antincendio dell'Università e il responsabile dell'igiene industriale della salute ambientale dell'università per la salute e la sicurezza per sviluppare un protocollo di sicurezza per lavorare con i gas tossici. - Impostare un sistema di monitoraggio dei gas tossici con sensori per ciascuno dei gas tossici in uso. Calibrare i sensori in base alle istruzioni del produttore. Bump test (controllo della funzionalità del sensore e dell'allarme con i gas di calibrazione) frequentemente, secondo le istruzioni del produttore. Individuare il monitor del gas appena fuori dal cofano dei fumi.
- Prima di iniziare qualsiasi esperimento di gas corrosivo, informare il personale nelle vicinanze del sistema di rischio e allarme. Inoltre, informare i soccorritori locali appropriati. Post segni sugli ingressi di laboratorio che specificano quali gas pericolosi sono in uso.
- Indicare a tutto il personale nelle vicinanze di evacuare se viene rilevato gas tossico. Informare i supervisori di laboratorio e il personale di risposta alle emergenze.
NOTA: In caso di interruzione dell'alimentazione, la torre di regolazione del gas arresterà il flusso di gas quando perde l'alimentazione. Tuttavia, se il sistema di riscaldamento, ventilazione e aria condizionata (HVAC) della stanza o il cofano dei fumi si guasto senza un'interruzione di corrente, ciò comporterà perdite di gas tossici.
- Indicare a tutto il personale nelle vicinanze di evacuare se viene rilevato gas tossico. Informare i supervisori di laboratorio e il personale di risposta alle emergenze.
- Modella la possibile concentrazione accumulata di gas tossici nella stanza se la cappa di fumi dovesse fallire utilizzando il foglio di calcolo di modellazione matematica IH MOD8 dell'American Industrial Hygiene Association (AIHA) per ogni gas.
- Ottenere la velocità di alimentazione/scarico dell'aria della camera, Q, in m3 min-1 dal personale di manutenzione HVAC dell'edificio o dal tecnico HVAC. Calcolare il volume, V, del laboratorio (L x W x H) in m3. Calcolare il tasso di emissione di contaminanti, G, di ogni tipo di gas tossico in mg min-1, utilizzando l'equazione 1 adattata dalla legge del gas ideale:
(1)
dove P è la frazione di pressione esercitata dal gas tossico a 1 atm (ppm gas/106 ppm), il gas Q è la portata del gas in Lmin -1, R è la costante di gas universale (0,082057 L K-1), T è la temperatura in K, e MW è il peso molecolare del gas in g mol-1. - Utilizzare i valori per V, Qe G per ogni gas (calcolato al punto 1.4.1) nell'algoritmo "Well-Mixed Room Model With option to cease generation and model room purge" nel foglio di calcolo IH MOD per calcolare le concentrazioni di gas locali accumulate per ciascun gas in un periodo di simulazione di 1440 min (24 h). Confrontare questi valori con i limiti di esposizione (Tabella 2)9.
- Ottenere la velocità di alimentazione/scarico dell'aria della camera, Q, in m3 min-1 dal personale di manutenzione HVAC dell'edificio o dal tecnico HVAC. Calcolare il volume, V, del laboratorio (L x W x H) in m3. Calcolare il tasso di emissione di contaminanti, G, di ogni tipo di gas tossico in mg min-1, utilizzando l'equazione 1 adattata dalla legge del gas ideale:
(1)2. Preparazione dell'inoculo microalgal
- Preparare lo Scenedesmus obliquus inoculum, o altre specie di microalghe selezionate per il fotobioreattore, prima dell'inizio dell'esperimento trasferendolo dal deposito, sia crioconservato che coltivato su supporti agar.
- Aggiungete un numero di 30-50 mL di un mezzo sterile di crescita dei microalgali (mezzo basale a triplo azoto di Bold [3N-BBM], tabella 3) a un flacone sterile (150-250 mL) con tappo in schiuma.
NOTA: A meno che il pallone non venga risparmiato, solo un quinto del volume del pallone di scosse deve essere occupato da supporti liquidi. - Utilizzare un armadio di biosicurezza per mantenere la sterilità durante il trasferimento delle cellule su un'inclinazione o scuotere il pallone. Per le colture sull'agar, utilizzare un anello sterile per trasferire microalghe dalla sua piastra di agar o inclinazione al pallone shake. Per le colture crioconservate, scongelare gradualmente il campione crioconservato e sciacquare il crioprotettore secondo il protocollo scelto10, quindi aggiungere le cellule al pallone di agitazione.
- Cellule di coltura in 3N-BBM a 20,25 gradi centigradi sotto i 16 h:8 h luce:scuro e tremante a 115-130 rpm.
- Monitora la crescita dei microalgali nel tempo utilizzando misurazioni ottiche a densità ottica (oD) (come nelle sezioni 5 e 6). Permettete alle microalghe di raggiungere la sua fase di crescita esponenziale (2,4 giorni) prima di trasferire le cellule al fotobioreattore.
NOTA: A seconda dell'obiettivo dell'esperimento, le cellule possono essere sciacquate di mezzo di coltura (questo studio) e/o concentrate con più fasi di centrifugazione prima dell'inoculazione del bioreattore.
- Aggiungete un numero di 30-50 mL di un mezzo sterile di crescita dei microalgali (mezzo basale a triplo azoto di Bold [3N-BBM], tabella 3) a un flacone sterile (150-250 mL) con tappo in schiuma.
3. Configurazione e funzionamento del fotobioreattore
- Utilizzare il fotobioreattore (Figura 1) per controllare la temperatura, il pH, la velocità di agitazione, la portata del gas e la portata della soluzione di input.
NOTA: Il fotobioreattore può essere utilizzato per controllare il flusso di fino a quattro diverse soluzioni di input, comunemente acido, base, antifoam e substrato.- Preparare 100 mL ciascuno di 1 N NaOH e 1 N HCl e aggiungerne ciascuno a una bottiglia di soluzione di ingresso da 250 mL. Utilizzare il contenimento secondario per queste soluzioni.
- Conservare le soluzioni di ingresso misurato in bottiglie con tappo autoclabile dotate di tubi di immersione e un tubo di sfiato con un filtro dell'aria in linea sterile. Collegare i tubi di immersione alle quattro porte di ingresso del fotobioreattore utilizzando tubi autoclati biliabili e, durante il funzionamento del fotobioreattore, immergere i tubi di immersione nelle soluzioni di ingresso. Passare il tubo autoclavabile di 1,6 mm (ID) tra le soluzioni di ingresso e le loro porte attraverso pompe peristalitiche separate che possono essere controllate sia mediante portate selezionate manualmente o mediante feedback da sonde a pH e schiuma (nel caso di acido, base e soluzioni antifoam).
- Calibrare il misuratore di pH del fotobioreattore prima dell'autoclaving.
- Collegare la sonda del pH alla torre di controllo del fotobioreattore adattando la sonda alla linea di collegamento e torcendola. Utilizzare i buffer pH 4 e pH 7 per calibrare il misuratore di pH. Attendere che i valori siano stabilizzati prima di accettare il valore del misuratore pH.
- Scollegare la sonda pH dal cavo del misuratore di pH che collega la sonda alla torre di controllo.
- Superficie sterilizzare con 70% etanolo o autoclave la sonda con il reattore. Per autoclave, capovolpare saldamente la sonda del pH con un foglio di alluminio.
NOTA: Se la sonda è autoclaved, c'è il rischio di corrosione dell'interno della sonda da danni al vapore. Questo metodo di tappatura non garantisce completamente la prevenzione dei danni. - Aggiungere 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) tampone al mezzo di coltura per controllare meglio il pH.
- Inserire e avvitare chiuso il dito freddo e il condensatore di scarico sulla tela del fotobioreattore.
- Inserire la porta di inoculazione e avvitare saldamente in posizione. Aggiungere una lunghezza di tubo autoclavabile alla sezione del porta di inoculazione sopra la tela del fotobioreattore. Prima di autoclaving il bioreattore, bloccare il tubo chiuso con un morsetto tubo autoclavable.
- Collegare i tubi con filtri sterili a tutte le porte fotobioreattore inutilizzate.
- Collegare soluzioni di ingresso acido e base alle porte di ingresso del fotobioreattore tramite tubi autoclavable. Aggiungere 1,5 L di media di coltura.
- Autoclave il reattore e le soluzioni di ingresso associate per 30-45 min a 121 gradi centigradi in base al volume di lavoro.
NOTA: Se il mezzo di coltura è influenzato negativamente dall'autoclaving, aggiungere il supporto dopo l'autoclaving in condizioni sterili in un cappuccio a flusso laminare. Il protocollo può essere messo in pausa qui.
PROCEDIMENTO: Reattore sarà caldo dopo la rimozione dall'autoclave. - Attaccare il motore dell'elma all'albero dell'elma e stringere il raccordo.
- Disporre i pannelli luminosi a LED simmetricamente all'esterno del bioreattore in base ai requisiti di illuminazione.
- Prima di autoclaving, misurare e registrare l'intensità della luce con un fotometro. Posizionare il sensore di illuminazione all'interno del recipiente fotobioreattore e posizionare il sensore verso la sorgente luminosa.
- Collegare fino a due bombole di gas per fornire le emissioni simulate della centrale elettrica a carbone (Tabella 1) alle microalghe nel fotobioreattore.
NOTA: Le concentrazioni di gas utilizzate in questo studio hanno approssimato quelle della centrale elettrica dell'Università dell'Iowa.- Assemblare i collegamenti tra la bombola di gas, la torre di regolazione del gas e l'anello di spargimento del fotobioreattore. Attaccare alle bombole di gas i regolatori competenti in grado di esercitare una pressione di uscita di 20 psi. Attaccare tubi resistenti alla pressione DA 6 mm alla barra del tubo flessibile di uscita del regolatore e fissarli con un morsetto. Fissare l'altra estremità del tubo resistente alla pressione all'inserimento del gas a gas che regola la torre utilizzando una barra flessibile a 6 mm di collegamento rapido fissato con un morsetto. Collegare i tubi ID da 3,2 mm alla presa del gas a torre a gas utilizzando un altro raccordo rapido di 6 mm e collegare l'altra estremità del tubo di uscita alla porta dell'anello sparging alla tela del fotobioreattore.
NOTA: per un secondo gas di ingresso, ripetere il passaggio 3.9.1, ma utilizzare una barra del tubo flessibile a forma di T per consolidare le due linee di gas di ingresso in una singola sezione del tubo collegata alla porta ad anello spargibile. - Impostare la pressione di uscita a 20 psi su ciascun regolatore di gas e utilizzare l'interfaccia del bioreattore per impostare le portate sperimentali del gas.
NOTA: Calcolare e segnalare il volume dell'aria in condizioni standard per volume di liquido al minuto (vvm); dividere la portata volumetrica del gas per il volume di coltura. Report in unità di per miniute.
- Assemblare i collegamenti tra la bombola di gas, la torre di regolazione del gas e l'anello di spargimento del fotobioreattore. Attaccare alle bombole di gas i regolatori competenti in grado di esercitare una pressione di uscita di 20 psi. Attaccare tubi resistenti alla pressione DA 6 mm alla barra del tubo flessibile di uscita del regolatore e fissarli con un morsetto. Fissare l'altra estremità del tubo resistente alla pressione all'inserimento del gas a gas che regola la torre utilizzando una barra flessibile a 6 mm di collegamento rapido fissato con un morsetto. Collegare i tubi ID da 3,2 mm alla presa del gas a torre a gas utilizzando un altro raccordo rapido di 6 mm e collegare l'altra estremità del tubo di uscita alla porta dell'anello sparging alla tela del fotobioreattore.
- In caso di sparging con più di una bombola di gas, confermare la concentrazione di CO2 fornita al fotobioreattore con un sensore CO2.
- Collegare un sensore CO2 compatibile con un software (ad esempio GasLab) alla porta USB di un computer. Scaricare il software più recente che corrisponde al modello di sensore DI CO2. Aprire il software e immettere il modello del sensore, l'intervallo di tempo di misurazione e la durata della registrazione dei dati di misurazione.
- Posizionare il sensore CO2 e il tubo di flusso del gas combinato (prima di collegare il tubo con il bioreattore) in un recipiente ventilato da 100-250 mL (esterno al bioreattore).
NOTA: Durante l'esperimento, le concentrazioni di CO2 dello spazio della testa possono essere misurate da uno dei tubi di ventilazione sulla tela del fotobioreattore. - Avviare le misurazioni di concentrazione di CO2 sull'interfaccia utente e attendere che le misurazioni eseguano.
- Utilizzare l'interfaccia utente del fotobioreattore per regolare la portata del gas da ciascun serbatoio fino alla portata totale desiderata (0,1 L min-1) e la concentrazione di CO2 (12%) si ottiene.
- Nell'interfaccia utente del fotobioreattore, utilizzare la funzione STIRR per impostare la velocità di rotazione dell'impeto. Assicurarsi che il tasso di miscelazione sia abbastanza rapido da far sì che il mezzo di coltura assimila le bolle di gas sparged.
NOTA: Alcune specie di microalgali hanno strutture cellulari deboli e saranno danneggiate o distrutte dall'elevata forza di taglio.
4. Adattamento del fotobioreattore e dell'allestimento sperimentale per l'uso di gas tossici
AVVISO: I gas corrosivi nel gas di scarico reale o simulato sono corrosivi e tossici. Questi gas rappresentano un grave rischio se inalati.
NOTA: Questo metodo non descrive materiali appropriati per la coltivazione sicura di microbi che producono o consumano gas altamente infiammabili (ad esempio, metano, idrogeno, ecc.).
- Sostituire i componenti in ottone, plastica e tubi standard con materiali resistenti alla corrosione.
- Utilizzare acciaio inossidabile per resistere in modo affidabile alla corrosione dei forti acidi formati dalla reazione tra NOx o SOx e acqua. Sostituire i raccordi a collegamento rapido in plastica nelle prese di gas sulla torre di regolazione del gas con raccordi rapidi in acciaio inox. Utilizzare regolatori in acciaio inox per bombole di gas, tra cui la barra del tubo di uscita piuttosto che l'ottone.
- Utilizzare tubi in politetrafluoroetilene (PTFE) o acetato di vinile etile naturale (EVA) per resistere alla corrosione da gas NOx e SOx (rispettivamente) sui collegamenti tra il cilindro di gas alla torre di regolazione del gas e la torre di regolazione del gas al fotobioreattore.
- Dopo l'autoclaving, assemblare il fotobioreattore e le bombole di gas all'interno di un cofano di fumi walk-in. Posizionare il fotobioreattore su un tavolo all'interno del contenimento secondario e posizionare le bombole di gas in collari a cilindro in piedi liberi o in un portabombi.
- Dopo aver incassato il flusso di gas, utilizzare un rilevatore di perdite liquide di tipo bolla per verificare la presenza di perdite di gas in tutte le connessioni tra le bombole di gas e il bioreattore. Utilizzare una bottiglia di lavaggio riempita con una diluizione 1:100 (v:v) di sapone per piatto: acqua per coprire la connessione con un piccolo flusso di soluzione di sapone.
NOTA: le perdite saranno indicate mediante bubbling alle connessioni. - Quando si avviano gli esperimenti microalgali, iniziare sparging quindi regolare il pH prima dell'inoculazione (come negli esperimenti fotobioreattori standard).
NOTA: Il buffering del mezzo di coltura durante gli esperimenti sui gas corrosivi è altamente raccomandato poiché i gas di ingresso sono fortemente acidi. - Inoculare il fotobioreattore aspirando l'inoculo del microalgale preparato in una siringa sterile, adattando la siringa al tubo attaccato alla porta di inoculazione, aprendo il morsetto della tubazione di inoculazione e deprimendo la siringa.
- Controllare il monitor del gas, le pressioni della bombola di gas e il fotobioreattore due volte al giorno (e prima del campionamento) per ottenere livelli elevati di gas tossici o l'indicazione di perdite.
- Limitare l'apertura della fascia del cofano dei fumi a una larghezza che consente di raggiungere i regolatori del bioreattore e del cilindro del gas. Per evitare rischi di esposizione all'inalazione, assicurarsi che l'apertura non esponga il personale al di sopra della regione del torso.
- Ruotare i regolatori di bombe del gas in posizione chiusa per interrompere il flusso di gas al reattore. Chiudere la fascia del cofano del fuma e consentire 5 min per il cappuccio di evacuare i gas corrosivi prima di assaggiare la coltura del fotobioreattore.
- Campionare all'interno della cappa del fumi aprendo un porta della piastra e utilizzando un pipet sierologico sterile o attirando la coltura in una siringa attraverso la porta di inoculazione/campionamento. Fissare le porte del fotobioreattore prima di aprire le bombole di gas e riprendere l'esperimento.
5. Misurazione della produttività della biomassa microalgale
- Utilizzare una curva di calibrazione per correlare la coltura delle microalghe OD750 misurazioni alle concentrazioni di biomassa microalgale essiccata.
- Preparare diversi (minimo: 4, volume di lavoro minimo: 500 mL) flaconi con mezzo microalgale sterile e inoculato con la specie di interesse (ad esempio, S. obliquus in questo studio).
- Misurare la coltura OD750 fino a quando la crescita è esponenziale, e pografmente sacrificalmente i flaconi filtrando volumi noti (minimo 100 mL) del contenuto con una membrana filtrante di 0,45 m di massa nota. Utilizzare barche di pesatura in alluminio coperto o barche di vetro per sostenere la biomassa e filtri mentre vengono essiccati.
- Massa la biomassa e filtri dopo l'essiccazione per circa 18-24 h in un forno compreso tra 80-100 gradi centigradi. Per verificare l'essiccazione completa, misurare di nuovo dopo un ulteriore 2/3 h per determinare se la massa si è stabilizzata.
- Sottrarre la massa del filtro dalla biomassa combinata e filtrare la massa per calcolare la massa di biomassa.
- Tracciare la curva di calibrazione misurato OD750 rispetto alla concentrazione di biomassa (massa di biomassa divisa per il volume della coltura filtrata) e adattare i dati con una regressione lineare.
6. Modellazione della produttività della biomassa e calcolo dei tassi
- Calcolare le concentrazioni di biomassa dell'esperimento dalle misurazioni OD750 utilizzando la regressione lineare della curva di calibrazione (determinata nella sezione 5).
- Adattare i dati di crescita dei microalgali batch da ritardo a fase esponenziale a stastita con una regressione logistica (equazione 2) nel software grafico e statistica (Tabella dei materiali):
(2)
dove L è il valore massimo di concentrazione di biomassa della curva, k è la mancheggia relativa della fase esponenziale (tempo-1), xo è il tempo del punto medio della curva sigmoidale e x è il tempo.- Immettere manualmente l'equazione logistica precedente. Selezionare Adatta una curva con regressione non lineare nella scheda Analisi del software. A sinistra della casella Parametri: regressione non lineare scegliere Crea nuova equazione nella casella di riepilogo a discesa Nuovo. Utilizzare l'equazione esplicita predefinita come tipo di equazione, denominare la nuova funzione e definire la nuova funzione come Y , L/(1, exp(-k, (x-b))), dove b rappresenta xo.
- Calcolare la produttività complessiva della biomassa del lotto di microalghe dividendo la differenza tra le concentrazioni finali e iniziali di biomassa per la differenza tra i tempi finali e quelli iniziali.
- Calcolare la produttività massima della biomassa del lotto microalghe dalla derivata dell'equazione 2 (Equazione 3) al punto medio sigmoide, quando x xo.
(3)
(2)
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Representative Results
Una curva di calibrazione per le microalghe verdi, S. obliquus, raccolta nella fase esponenziale, è stata stabilita con OD750 e concentrazioni di biomassa essiccata (Figura 2). La regressione lineare aveva un valore R2 di 0,9996.
Una coltura S. obliquus è stata avviata in una fiaschetta Erlenmeyer da 250 mL da una coltura immagazzinata su un piatto di agar refrigerato. La microalga è stata inoculata in 3N-BBM con buffer HEPES da 10 mM e sparged con 2.2% CO2 in un fotobioreattore 2 L con 1.5 L volume di lavoro (0.07 vvm) (Figura 1). Il lotto è stato tracciato tramite OD750; le concentrazioni di biomassa sono state calcolate dalla curva di calibrazione e quindi modellate con una curva logistica (Figura 3). Il fotobioreattore manteneva la coltura a pH 6,8, 100 cm3 min-1 portata totale di gas, continua 280-mol m -2 s-1 illuminazione e 27 . La curva logistica si adatta ai dati di concentrazione della biomassa da lag a fase esponenziale a fase stazionaria. Dal modello logistico, la concentrazione massima di biomassa durante il lotto è stata di 2070 x 20 mgL-1, la massima produttività della biomassa si è verificata a 4,6 giorni e il tasso di produttività specifica della biomassa era di 1,0 d-1. La produttività massima della biomassa, calcolata dalla derivata della curva logistica al momento della crescita massima, era di 532 x 60 mg L-1 d-1.
Il modello di camera ben miscelato è stato utilizzato per calcolare la concentrazione accumulata di NO2,SO2e CO in caso di insufficienza del cappuccio fumi per 24 h. Questi valori sono stati confrontati con i limiti di esposizione (Tabella 2). For example, in the scenario where 0.05 L min-1 of 400 ppm NO2 is released during a fume hood failure period of 24 h, the well-mixed room model with inputs of calculated G = 0.0377 mg min-1, Q = 0.0001 m3 min-1, V = 100 m3, and maximum time for simulation = 1440 min predicts NO2 accumulation to 0.54 mg m-3 (0.29 ppm), which is above the acceptable chronic exposure limit (American Conference of Governmental Industrial Hygienists threshold limit value [ ACGIH TLV]) e al di sotto del limite di esposizione a breve termine (STEL).
Una promettente sperimentazione preliminare con gas flue simulato ha raggiunto un tasso massimo di produttività massima della biomassa microalgale (690 x 70 mg L-1 d -1) rispetto a quello del 12% di CO2 e dell'aria ultra-zero (510 mg L-1 d-1) (Figura 4). Prima dell'esperimento, un monitor del gas è stato calibrato con CO, NO2e SO2. L'esperimento simulato del gas di scarico è stato effettuato senza alcun rischio per il personale o danni alle apparecchiature derivanti da gas corrosivi.
Figura 1: fotoreattore bench-top illuminato da luci LED rosse e blu. Il fotobioreattore funziona come un reattore a lotti da 2 L con 1,5 L di volume di lavoro. Il fotobioreattore viene continuamente alimentato con gas attraverso l'anello di sparging e prese d'aria di gas in eccesso attraverso le porte nella tela. Adattato con il permesso di Molitor et al.5. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Curva di calibrazione relativa al peso secco delle cellule OD750 a S. obliquus. S. obliquus cell colture di assorbimento leggero è stato misurato a 750 nm, poi le cellule sono state filtrate e asciugate per ottenere misurazioni del peso secco delle cellule. Ristampato con il permesso di Molitor et al.5. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Dati di crescita S. obliquus al 2,2% di CO2 input modellati con una regressione logistica. I punti dati rappresentano i valori di biomassa calcolati dalle misurazioni ottiche della densità. I dati sono stati modellati con una regressione logistica attraverso un adattamento dei minimi quadrati; 
dove L è 1955 mg L-1, k , 1,154 d-1e x0 , 3,317 d. R2 , 0,995. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 4: Crescita modellata di S. obliquus al 12% di CO2,con e senza componenti di gas flue simulati aggiuntivi. Le misurazioni della biomassa da ogni lotto di microalghe sono state modellate con regressioni logistiche. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Componente | Percentuale |
| H2O | 12.6% |
| CO2 | 11.6% |
| O2 | 5.8% |
| Co | 0.048% |
| COSÌ2 | 0.045% |
| N.2 | 0.022% |
| N2 | 69.9% |
Tabella 1: Composizione delle emissioni delle centrali elettriche a carbone. Queste quantità sono state mediamente utilizzate dai dati sulle emissioni della centrale elettrica dell'Università dell'Iowa raccolti a intervalli minimi nell'arco di 10 h.
| Gas tossico | Twa | Soffitto | Stel | NIOSH IDLH | NIOSH REL | ACGIH TLV | Descrizione CDC |
| Co | 35 ppm | 200 ppm | - | 1.200 ppm | 35 ppm | 25 ppm | Incolore, inodore |
| COSÌ2 | 2 ppm | 100 ppm | 5 ppm | 100 ppm | 2 ppm | 2 ppm | Gas incolore con un odore caratteristico, irritante e pungente |
| N.2 | 3 ppm | 5 ppm | 1 ppm | 13 ppm | 1 ppm | 0,2 ppm | Liquido giallo-marrone o gas bruno-rossastro (superiore a 70 gradi centigradi) con un odore pungente e acre |
Tabella 2: Limiti di esposizione e descrizioni per i gas tossici (CO, SO2, NO2) nel gas di scarico. OSHA TWA: media ponderata nel tempo (solitamente periodo 8 h), CEILING: valore mai raggiunto, STEL: limite di esposizione a breve termine (TWA superiore a 15 min), NIOSH IDLH: pericolo per la vita e la salute, NIOSH REL: limite di esposizione di 15 min, ACGIH TLV accettabile: limite di esposizione cronica, nessun effetto negativo.
| Composto | Mm |
| NaNO3 | 8,82 x 100 |
| MgSO4X7O2O | 3,04 x 10-1 |
| Nacl | 4,28 x 10-1 |
| K2HPO4 | 4,31 x 10-1 |
| KH2PO4 | 1,29 x 100 |
| CaCl2o 2H2O | 1,70 x 10-1 |
| NSO4x 7H2O | 3,07 x 10-2 |
| MnCl2s4H2O | 7.28 x 10-3 |
| MoO3 | 4,93 x 10-3 |
| CuSO4x 5H2O | 6,29 x 10-3 |
| Co(NO3)2·6H2O | 1,68 x 10-3 |
| H3BO3 | 1,85 x 10-1 |
| Edta | 1,71 x 10-1 |
| Koh | 5,52 x 10-1 |
| FeSO4o 7H2O | 1,79 x 10-2 |
| H2SO4 (concentrato) | 1 x 10-3 ll |
Tabella 3: Composizione del mezzo basale a triplo azoto Bold (3N-BBM). La quantità di azoto è stata triplicata rispetto al mezzo basale di Bold11.
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Discussion
Gli esperimenti di fotoreattore a lotti, fotoreattore axenico con pH regolamentato, temperatura, portata di gas e concentrazione di gas promuovono risultati significativi eliminando la contaminazione da ceppi algali non bersaglio e variabilità in condizioni di coltura. Una cinetica di crescita pura e pura può essere ottenuta anche in presenza di gas corrosivi (CO2, SO2, NO2), che fungono da nutrienti, trasformando i gas di scarto in un prodotto prezioso come l'alimentazione animale.
Prima di iniziare qualsiasi esperimento di microalgali, la coltura di microalghe prescelta deve essere presa dallo stoccaggio e riadattata alla coltura liquida. La crescita delle microalghe in fase esponenziale migliora la probabilità che gli esperimenti abbiano condizioni iniziali equivalenti e che le microalghe non ristagnino nella fase di ritardo dopo l'inoculazione.
Le curve di calibrazione relative alla densità ottica e alle concentrazioni di biomassa sono particolarmente importanti durante gli studi sulla produttività della biomassa. L'elevata produttività della biomassa microalgale è uno degli obiettivi chiave dell'industria delle microalghe e, come tale, è spesso un indicatore del successo della ricerca12. Pertanto, calcoli accurati delle concentrazioni di biomassa da misurazioni ottiche della densità devono derivare da dati della curva di calibrazione specifici, precisi e precisi specifici della specie. Per evitare potenziali interferenze ottiche, è importante che le misurazioni per la curva di calibrazione e durante l'esperimento siano effettuate in soluzioni di fondo equivalenti. Inoltre, la curva di calibrazione deve essere effettuata con misurazioni effettuate dalle microalghe nelle fasi di crescita più rappresentative di quelle degli esperimenti. Alcune specie di microalgali possono avere differenze drammatiche nelle dimensioni delle cellule durante diverse fasi di crescita che possono alterare la densità ottica e le concentrazioni di biomassa percepite. Va notato che la produttività della biomassa è correlata al tasso di crescita, ma non equivalente,. Tasso di crescita specifico dipende dal numero di cellule (variazione della densità cellulare nel tempo/densità cellulare) presenti e la specifica produttività della biomassa dipende dalla massa sfusa di cellule (variazione nella biomassa mg/L nel tempo per biomassa mg/L)13 presenti.
Quando le concentrazioni di biomassa microalgale sono modellate con una curva logistica, i risultati sperimentali possono essere confrontati in modo significativo interpolando le concentrazioni di biomassa e calcolando con precisione la productività della biomassa. Tuttavia, occorre prestare attenzione nell'interpretazione di questi risultati sperimentali; è inappropriato confrontare la produttività complessiva e massima della biomassa in lotti. Mentre i valori massimi di produttività della biomassa sono utili per confrontare i risultati in batch, la produttività complessiva della biomassa è fuorviante senza ulteriori informazioni sulla durata dell'esperimento e sulle fasi di crescita delle microalghe. Questi tassi cambiano continuamente durante le fasi di ritardo, crescita del log e stazionarie.
Durante gli esperimenti con i gas corrosivi che sono caratteristici delle emissioni di centrale elettrica o di combustione industriale, occorre prestare attenzione sia per la salute umana che per la longevità delle apparecchiature. Le parti standard devono essere sostituite con materiali più robusti e i materiali di consumo come i tubi devono essere ispezionati e sostituiti più frequentemente per resistere alla corrosione, prevenire perdite ed evitare l'esposizione umana. Misure di sicurezza supplementari e la consapevolezza del rischio sono essenziali per un funzionamento e un campionamento sicuri e di successo. Il metodo non è appropriato per i gas infiammabili perché vi è un potenziale di accumulo di gas all'interno dello spazio head e l'apparecchiatura non è progettata per tali rischi né adatta per un adattamento sicuro a tali condizioni.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Questo materiale si basa sul lavoro sostenuto dalla National Science Foundation Graduate Research Fellowship sotto il n. 1546595. Qualsiasi opinione, risultati e conclusioni o raccomandazioni espresse in questo materiale sono quelle degli autori e non riflettono necessariamente le opinioni della National Science Foundation. Il lavoro è stato sostenuto anche da una borsa di ricerca del governo studentesco universitario e professionale dell'Università dell'Iowa, e dalla Fondazione dell'Università dell'Iowa, dalla Fondazione Allen S. Henry. La ricerca è stata condotta nel W. M. Keck Phytotechnologies Laboratory. Gli autori desiderano ringraziare il personale della centrale elettrica dell'Università dell'Iowa, in particolare Mark Maxwell, per l'esperienza e il sostegno finanziario per i gas di scarico simulati. Gli autori desiderano anche riconoscere Emily Moore per la sua assistenza con il campionamento e l'analisi e Emily Greene per la sua assistenza e la partecipazione al video del protocollo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biostat A bioreactor | Sartorius Stedim | 2-liter bioreactor for microbial fermentation; designed to be autoclaved; pH, temperature, gas flow rate control | |
| Bump test NO2 gas | Grainger | GAS34L-112-5 | Calibration gas for MultiRAE gas detector |
| Bump test O2, CO, LEL gas | Grainger | GAS44ES-301A | Calibration gas for MultiRAE gas detector |
| Bump test SO2 gas | Grainger | GAS34L-175-5 | Calibration gas for MultiRAE gas detector |
| Corrosion resistant tubing for NO2 gas | Swagelok | SS-XT4TA4TA4-6 | PTFE Core Hose Smooth Bore X Series—Fiber Braid and 304 SS Braid Reinforcement |
| Corrosion resistant tubing for SO2 gas | QC Supply | 120325 | Reinforced Braided Natural EVA Tubing - 1/4" ID |
| cozIR 100% CO2 meter | Gas Sensing Solutions Ltd. | CM-0121 at CO2meter.com | CO2 meter for concentrations up to 100% |
| cozIR 20% CO2 meter | Gas Sensing Solutions Ltd. | CM-0123 at CO2meter.com | CO2 meter for concentrations up to 20% |
| Durapore Membrane Filter, 0.45 μm | Millipore Sigma | HVLP04700 | Hydrophilic, plain white, 47 mm diameter, 0.45 μm pore size, PVFD membrane filters |
| Gas cylinder regulators | Praxair | PRS 40221331-660 | Single-stage stainless steel regulator configured for 0-15 psi outlet assembly diaphragm valve with 1/4" MNPT threads, Stainless steel to resist corrosion from NOx and SOx |
| Gas cylinders | Praxair | Ulta-zero air, high purity CO2, or custom gas composition | Dependent on study objectives |
| Gas monitoring and leak detection system | RAE Systems by Honeywell | MAB3000235E020 | Pumped model that detects O2, SO2, NO2, CO, and LEL |
| GasLab software | GasLab | v2.0.8.14 | Software for CO2 meter measurements and data logging |
| Hose barb | Grainger | Item # 3DTN3 | Used to adapt regulators to tubing, Stainless steel to resist corrosion from NOx and SOx |
| K30 1% CO2 meter | Senseair | CM-0024 at CO2meter.com | CO2 meter for concentrations less than 1% |
| LED grow panels | Roleadro | HY-MD-D169-S | Red & blue LED light panels |
| Memosens dissolved oxygen probe | Endress+ Hauser | COS22D-19M6/0 | Autoclavable (with precautions) dissolved oxygen probe for bioreactor |
| Memosens pH probe | Endress+ Hauser | CPS71D-7TB41 | Autoclavable (with precautions) pH probe for bioreactor |
| Oven, Isotemp 500 Series | Fisher Scientific | 13246516GAQ | Small oven for drying |
| Prism GraphPad software | GraphPad Software | Version 7.03 or 8.0.1 | Graphing software for data organization, data analysis, and publication-quality graphs |
| Stem to hose barb fitting | Swagelok | SS-4-HC-A-6MTA | Stainless Steel Hose Connector, 6 mm Tube Adapter, 1/4 in. Hose ID |
| Tubing, dilute acid/base transfer | Allied Electronics and Automation | 6678441 | Silicone TP Process Tubing; 1.6mm Bore Size; 3000mm Long; Food Grade |
| Tubing, gas transfer | Allied Electronics and Automation | 6678444 | Silicone TP Process Tubing; 3.2mm Bore Size; 3000mm Long; Food Grade |
References
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- Cheah, W. Y., Pau Loke, S., Chang, J. -S., Ling, T., Juan, J. C. Biosequestration of atmospheric CO2 and flue gas-containing CO2 by microalgae. Bioresource Technology. 184, 190-201 (2014).
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