Summary
Скамья масштаба, апоры культивирование облегчает микроводорослей характеристики и оптимизации производительности до последующего расширения процесса. Фотобиореакторы обеспечивают необходимый контроль для надежных и воспроизводимых микроводорослей экспериментов и могут быть адаптированы для безопасного выращивания микроводорослей с коррозионными газами (CO2,SO2,NO2) от муниципальных или промышленных выбросов сгорания.
Abstract
Фотобиореакторы являются подсвеченными системами выращивания для экспериментов на фототрофических микроорганизмах. Эти системы обеспечивают стерильную среду для микроводорослей выращивания с температурой, рН, и газообразования и контроля скорости потока. На скамейке масштаба, фотобиореакторы выгодны для исследователей, изучающих микроводорослей свойства, производительность и оптимизация роста. На промышленных масштабах фотобиореакторы могут поддерживать чистоту продукции и повышать эффективность производства. В видео описаны подготовка и использование фотобиореактора в масштабе скамейки для выращивания микроводорослей, включая безопасное использование коррозионных входов газа, а также подробно описаны соответствующие измерения биомассы и расчеты производительности биомассы. В частности, видео иллюстрирует микроводорослей культуры хранения и подготовки к прививке, фотобиореактор сборки и стерилизации, измерения концентрации биомассы, а также логистической модели для микроводорослей биомассы производительности со скоростью расчеты, включая максимальную и общую производительность биомассы. Кроме того, поскольку растет интерес к экспериментам по выращиванию микроводорослей с использованием смоделированных или реальных выбросов газа отходов, видео будет охватывать адаптации оборудования фотобиореакторов, необходимых для работы с коррозионными газами и обсуждения безопасного отбора проб в таких сценариев.
Introduction
Фотобиореакторы полезны для контролируемых экспериментов и выращивания более чистых микроводорослей, чем это может быть достигнуто с помощью открытых прудов. Микроводоросли выращивания в скамейке масштаба фотобиореакторы поддерживает развитие фундаментальных знаний, которые могут быть использованы для расширения процесса. Незначительные изменения в условиях окружающей среды могут существенно изменить микробиологические эксперименты и затруднить результаты1. Стерильный процесс с температурой, рН и контролем разжижающего газа является выгодным для изучения микроводорослей свойств и производительности в различных условиях. Кроме того, контроль над концентрацией входной газа, температурой, силой сдвига от смешивания и средним рН может поддерживать различные виды, которые в противном случае сложно культивировать. Фотобиореакторы могут работать как пакетный процесс с непрерывным газоемка и щадящее, или как хемостат проточные системы с непрерывным газоемка и sparging плюс влияющие и сточные воды питательных веществ. Здесь мы демонстрируем процесс партии с непрерывным газоотражем и щадя.
Использование фотобиореакторов решает несколько проблем выращивания микроводорослей и производства. Поле обычно борется с проблемами загрязнения другими микроорганизмами, эффективного использования субстрата (что особенно важно в случае CO2 смягчения или очистки сточных вод)2, контроль рН, изменчивость освещения, и производительность биомассы3. Фотобиореакторы позволяют исследователям изучать широкий спектр фототрофов в тщательно контролируемых пакетных системах, где даже медленно растущие виды защищены от хищников или конкурирующих микроорганизмов4. Эти пакетные системы также лучше способствуют увеличению коэффициентов использования CO2 и производительности биомассы, поскольку они являются закрытыми системами, которые с большей вероятностью находятся в равновесии с поставляемыми газами. Технология Photobioreactor также предлагает контроль рН, отсутствие которого препятствует высокой производительности биомассы в прошлых исследованиях5. В скамье шкале уровень контроля, предлагаемый фотобиореакторами, выгоден исследователям. В больших промышленных масштабах фотобиореакторы могут использоваться для поддержания чистоты коммерческих биопродуктов и повышения эффективности производства для нутрицевтических, косметических, пищевых или кормовых приложений6.
Микроводоросли представляют большой интерес для биосеквестации CO2, потому что они могут быстро исправить CO2 как углерод биомассы. Однако большинство антропогенных источников CO2 загрязнены другими коррозионными и токсичными газами или загрязняющими веществами (NOx,SOx,CO, Hg), в зависимости от источника топлива процесса сгорания. Растущий интерес к устойчивому секвестрированию CO2 побудил развитие технологий фотобиореактора для лечения выбросов CO2,таких как выбросы угольных электростанций(таблица 1). К сожалению, существует неотъемлемый риск воздействия коррозионных и токсичных загрязниенов на человека и окружающую среду в ходе исследований и наращивания масштабов. Таким образом, описание безопасной сборки и эксплуатации биореакторов с использованием коррозионных газов является необходимым и поучительным.
Этот метод предназначен для использования фотобиореактора размером 2 л для роста микроводорослей в тщательно контролируемых экспериментальных условиях. Протокол описывает микроводоросли хранения, инокулум подготовки, а также фотобиореактор установки и стерилизации. Помимо основной эксплуатации, эта работа описывает измерения микроводорослей биомассы и расчеты производительности биомассы, а также адаптацию оборудования для выращивания микроводорослей с коррозионными газами. Описанный ниже протокол подходит для исследователей, стремящихся усилить экспериментальный контроль, оптимизировать условия роста микроводорослей или аксентико культуры ряд фототрофических микробов. Этот метод не описывает соответствующие материалы для выращивания микробов, которые производят или потребляют легковоспламеняющиеся газы (например, CH4,H2и т.д.) 7.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Безопасное использование и отбор проб фотобиореактора, спаржается с коррозионными газами
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод не описывает соответствующие процедуры для безопасной выборки микроводорослей культур, которые производят или потребляют легковоспламеняющиеся газы.
- Управление токсичным газом как риск для здоровья человека.
ПРИМЕЧАНИЕ: В Университете Штата Айова химической гигиены плана, авторы работали с университетом пожарной безопасности координатора и университета охраны окружающей среды и безопасности промышленной гигиены сотрудника по разработке протокола безопасности для работы с токсичными газами. - Настройка системы мониторинга токсичных газов с датчиками для каждого из токсичных газов в использовании. Калибровать датчики в соответствии с инструкциями производителя. Bump тест (проверка на датчик и функциональность сигнализации с калибровочными газами) часто, в соответствии с инструкциями производителя. Найдите газовый монитор недалеко от капота дыма.
- Перед началом любых коррозионных газовых экспериментов, уведомить близлежащий персонал о риске и сигнализации системы. Кроме того, уведомить соответствующих местных аварийно-спасательных служб. Почтовые знаки на лабораторных входах с указанием, какие опасные газы используются.
- Проинструктируйте весь близлежащий персонал эвакуироваться в случае обнаружения токсичного газа. Сообщите руководителям лабораторий и персоналу по реагированию на чрезвычайные ситуации.
ПРИМЕЧАНИЕ: При отключении электроэнергии газорегулирующая башня остановит поток газа, когда потеряет мощность. Однако, если система отопления, вентиляции и кондиционирования воздуха (HVAC) или капот дыма не сдувается без отключения электроэнергии, это приведет к утечке токсичного газа.
- Проинструктируйте весь близлежащий персонал эвакуироваться в случае обнаружения токсичного газа. Сообщите руководителям лабораторий и персоналу по реагированию на чрезвычайные ситуации.
- Модель возможной накопленной концентрации токсичных газов в комнате, если дым капот были на провал с помощью Американской ассоциации промышленной гигиены (AIHA) математического моделирования таблицы IH MOD8 для каждого газа.
- Получить номер питания / выхлопных воздуха, вм3 мин-1 от здания HVAC обслуживающего персонала или HVAC техник. Рассчитайте объем, V, лаборатории (L х W х H) в м3. Рассчитайте уровень выбросов загрязняющих веществ, G, каждого типа токсичного газа в мг мин-1, с помощью уравнения 1 адаптированы из идеального закона газа:
(1)
где P является фракция давления, оказываемого токсичным газом на 1 атм (ppm газа / 106 ppm), газ является скорость потока газа в L мин-1, R является универсальной газовой постоянной (0.082057 L'atm-1 K-1), T температура в K, и МВт молекулярный вес газа в g mol-1. - Используйте значения для V, q, и G для каждого газа (рассчитывается в шаге 1.4.1) в "Хорошо-Смешанная модель комнаты с возможностью прекратить генерацию и модель комнаты очистки" алгоритм в таблице IH MOD для расчета накопленных концентраций газа комнате для каждого газа в течение 1440 мин (24 ч) период моделирования. Сравните эти значения с ограничениями экспозиции(таблица 2)9.
- Получить номер питания / выхлопных воздуха, вм3 мин-1 от здания HVAC обслуживающего персонала или HVAC техник. Рассчитайте объем, V, лаборатории (L х W х H) в м3. Рассчитайте уровень выбросов загрязняющих веществ, G, каждого типа токсичного газа в мг мин-1, с помощью уравнения 1 адаптированы из идеального закона газа:
(1)2. Подготовка микроводорослей инокулума
- Подготовьте Scenedesmus obliquus inoculum, или другие микроводоросли, отобранные для фотобиореактора, до начала эксперимента, переведя его из хранилища, будь то криоконсервированные или культурные на агар-носителях.
- Добавьте 30-50 мл стерильной микроводорослей среды роста (тройной азот Bold's базальной среды 3N-BBM, Таблица 3) в стерильной (150-250 мл) встряхнуть колбу с колбузом с пеной.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если колба не спаржается, только одна пятая часть встряхивания колбы объем должен быть занят жидких носителей. - Используйте шкаф биобезопасности для поддержания бесплодия при передаче клеток на наклон или встряхнуть колбу. Для культур на агаре используйте стерильную петлю для переноса микроводорослей из агаровой пластины или наклона в колбу для встряхивания. Для криоконсервированных культур, постепенно оттаивать криоконсервированный образец и промыть криопротектотор в соответствии с выбранным протоколом10, затем добавить клетки в колбу встряхнуть.
- Культурные клетки в 3N-BBM при 20-25 градусах по Цельсию при 16 ч:8 ч свет: темные и трясущиеся при 115-130 об/мин.
- Отслеживайте рост микроводорослей с течением времени с помощью измерений оптической плотности (OD) (как в разделах 5 и 6). Разрешить микроводорослей, чтобы достичь своей фазы экспоненциального роста (2-4 дней) до передачи клеток в фотобиореактор.
ПРИМЕЧАНИЕ: В зависимости от цели эксперимента, клетки могут быть промыты культуры среды (это исследование) и / или сосредоточены с несколькими шагами центрифугации до прививки биореактора.
- Добавьте 30-50 мл стерильной микроводорослей среды роста (тройной азот Bold's базальной среды 3N-BBM, Таблица 3) в стерильной (150-250 мл) встряхнуть колбу с колбузом с пеной.
3. Настройка и эксплуатация фотобиореактора
- Используйте фотобиореактор(рисунок 1) для контроля температуры, рН, скорости перемешивания, скорости потока газа и скорости ввода раствора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фотобиореактор может быть использован для управления потоком до четырех различных входных растворов, обычно кислотных, базовых, антипенных и субстратов.- Приготовьте 100 мл каждый из 1 N NaOH и 1 N HCl и добавьте каждый из них в бутылку входному раствора 250 мл. Используйте вторичное сдерживание для этих решений.
- Храните дозированные входные растворы в автоматических крышках бутылок, оснащенных трубками и вентиляционной трубкой со стерильным встровоздушным воздушным фильтром. Подключите трубки для погружения к четырем входным портам фотобиореактора с помощью автоматических труб и, во время работы фотобиореактора, поможнете окунающие трубки в входных растворах. Передайте 1,6 мм внутри dimeter (ID) автоматических труб между входными растворами и их портами через отдельные перистальтические насосы, которые могут управляться либо вручную выбранными темпами потока, либо обратной связью от зондов рН и пены (в случае кислоты, базы, и антипенные растворы).
- Калибровка фотобиореактора рН метр до автоклавирования.
- Подключите зонд pH к башне управления фотобиореактором, подключив зонд к соединительной линии и закрутив его для блокировки. Используйте pH 4 и pH 7 буферы для калибровки счетчика рН. Подождите, пока значения не стабилизируются, прежде чем принять значение счетчика pH.
- Отсоедините зонд pH от шнура счетчика pH который соединяет зонд к башне управления.
- Поверхность стерилизовать с 70% этанола или автоклав зонд с реактором. Для автоклава, крышка pH зонд плотно с алюминиевой фольгой.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если зонд аутокративирован, существует риск коррозии интерьера зонда от повреждения пара. Этот метод укупорки не полностью гарантирует предотвращение повреждений. - Добавьте 10 мМ 4-(2-гидроксиэтил)пиперазин-1-этанесульфоновая кислота (HEPES) буфер амдопрельное для лучшего контроля рН.
- Вставьте и винт закрыл холодный палец и конденсатор выхлопных газов на головной панели фотобиореактора.
- Вставьте прививоченный порт и плотно ввините на месте. Добавьте длину автоматических труб к разделу прививочной порт над головной платой фотобиореактора. Перед автоклавированием биореактора зажим тюбингового зажима зажимом автоклавинного шланга.
- Прикрепите трубку, оснащенную стерильными фильтрами, к любым неиспользованным портам фотобиореактора.
- Прикрепите кислотные и базовые входные растворы к входной порты фотобиореактора с помощью автоматических труб. Добавьте 1,5 л культуры среды.
- Автоклав реактора и связанных с ним входных растворов в течение 30-45 мин при 121 градусов по Цельсию в зависимости от рабочего объема.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если культура среды отрицательно влияет на autoclaving, добавить средства массовой информации после автоклавирования в стерильных условиях в ламинарный капот потока. Протокол можно приложить здесь.
ВНИМАНИЕ: Реактор будет горячим после удаления из автоклава. - Прикрепите двигатель импелера к валу импелера и затяните фитинг.
- Упорядочить светодиодные световые панели симметрично за пределами биореактора в соответствии с требованиями освещения.
- Перед автоклавированием измерьте и запишите интенсивность света с помощью фотометра. Поместите датчик светления внутри сосуда фотобиореактора и лицом к датчику к источнику света.
- Соедините до двух газовых баллонов для снабжения смоделированных угольных выбросов электростанции(таблица 1) к микроводорослям в фотобиореакторе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрации газа, используемые в этом исследовании, приблизились к концентрациям электростанции Университета Айовы.- Соберите соединения между газовым баллоном, газорегулирующей башней и разгнением фотобиореактора. Прикрепите соответствующие регуляторы, способные 20 psi выход давления на газовые баллоны. Прикрепите 6 мм ID давление устойчивых труб для регулятора выход ный барб и закрепите с шлангом зажим. Прикрепите другой конец давления устойчивых труб к газорегулирующей башни впускгаза с помощью шланга колючка до 6 мм стволовых быстро подключить установку обеспеченных шланг зажим. Подключите 3,2 мм ID трубки к газорегулирующей башне газовой розетки с помощью еще 6 мм быстро подключить установку и подключить другой конец розетки труб к sparging кольцо порта на фотобиореактор головной убор.
ПРИМЕЧАНИЕ: Для второго входного газа повторите шаг 3.9.1, но используйте Т-образный шланг для консолидации двух входных линий газа к одному участку трубки, соединенной с портом спаржающего кольца. - Установите давление розетки до 20 пси на каждом газовом регуляторе и используйте интерфейс биореактора для установки экспериментальных тарифов потока газа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рассчитать и сообщить об объеме воздуха в стандартных условиях на объем жидкости в минуту (vvm); разделить скорость потока объема газа на объем культуры. Отчет в единицах в минимуме.
- Соберите соединения между газовым баллоном, газорегулирующей башней и разгнением фотобиореактора. Прикрепите соответствующие регуляторы, способные 20 psi выход давления на газовые баллоны. Прикрепите 6 мм ID давление устойчивых труб для регулятора выход ный барб и закрепите с шлангом зажим. Прикрепите другой конец давления устойчивых труб к газорегулирующей башни впускгаза с помощью шланга колючка до 6 мм стволовых быстро подключить установку обеспеченных шланг зажим. Подключите 3,2 мм ID трубки к газорегулирующей башне газовой розетки с помощью еще 6 мм быстро подключить установку и подключить другой конец розетки труб к sparging кольцо порта на фотобиореактор головной убор.
- При спарринге с более чем одним газовым баллоном, подтвердите подаваемую концентрацию CO2 на фотобиореактор с датчиком CO2.
- Подключите совместимый с компьютером датчик CO2 (например, GasLab). Скачать самое последнее программное обеспечение, которое соответствует модели датчика CO2. Откройте программное обеспечение и введите модель датчика, интервал времени измерения и продолжительность регистрации данных измерений.
- Поместите датчик CO2 и комбинированную трубку потока газа (до соединения трубки с биореактором) в 100-250 мл, ограниченный, вентилируемый сосуд (внешний биореактор).
ПРИМЕЧАНИЕ: В ходе эксперимента концентрации CO2 в головном пространстве могут измеряться из одной из вентиляционных трубок на головном уборе фотобиореактора. - Начните измерения концентрации CO2 на пользовательском интерфейсе и ждите, пока измерения уравновеш— уравновеш—.
- Используйте пользовательский интерфейс photobioreactor для регулировки скорости потока газа из каждого бака до желаемой общей скорости потока (0,1 л мин-1)и концентрации CO2 (12%) достигается.
- На пользовательском интерфейсе photobioreactor используйте функцию STIRR для установки скорости вращения импеллера. Убедитесь, что скорость смешивания достаточно быстра для культуры среды ассимилировать sparged пузырьков газа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые микроводоросли имеют слабые клеточные структуры и будут повреждены или разорваны высокой силой сдвига.
4. Адаптация фотобиореактора и экспериментальная установка для использования токсичного газа
ВНИМАНИЕ: Коррозионные газы в реальном или смоделированном газе являются коррозионными и токсичными. Эти газы представляют серьезную опасность при вдыхании.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот метод не описывает соответствующие материалы для безопасного выращивания микробов, которые производят или потребляют легковоспламеняющиеся газы (например, метан, водород и т.д.).
- Замените латунные, пластиковые и стандартные компоненты труб с коррозионными устойчивыми материалами.
- Используйте нержавеющей стали, чтобы надежно противостоять коррозии от сильных кислот, образованных реакцией между NOx или SOx и водой. Замените пластиковые светильники быстрого подключения на газовых впусках и розетки на газорегулирующей башне с помощью быстрой фитинги из нержавеющей стали. Используйте регуляторы из нержавеющей стали для газовых баллонов, включая выходшки шланга колючка, а не латуни.
- Используйте политетрафторотилен (ПТФЕ) или натуральный этиловый виниловый ацетат (EVA), чтобы противостоять коррозии от NOx и SOx газов (соответственно) на соединениях между газовым баллоном с газорегулирующей башней и газорегулирующей башней к фотобиореактору.
- После автоклавирования, собрать фотобиореактор и газовые баллоны в ходьбе в дым капот. Поместите фотобиореактор на стол внутри вторичного сдерживания и поместите газовые баллоны в свободно стоящие воротники цилиндра или стойку цилиндра.
- После иначины потока газа используйте детектор утечки жидкости типа пузыря для проверки утечки газа во всех соединениях между газовыми баллонами и биореактором. Используйте бутылку для мытья, наполненную 1:100 (v:v) разбавлением мыла для посуды: вода, чтобы покрыть связь небольшим потоком мыльного раствора.
ПРИМЕЧАНИЕ: Утечки будут указаны восходящей на соединениях. - При начале микроводорослей эксперименты, начать разъем затем настроить рН перед прививкой (как в стандартных экспериментов фотобиореактор).
ПРИМЕЧАНИЕ: Buffering среды культуры во время коррозионных экспериментов газа настоятельно рекомендуется, так как входные газы сильно кислой. - Прививать фотобиореактор, укрепляя подготовленный микроводорослевой инокулум в стерильный шприц, прикрепляя шприц к трубке, прикрепленному к прививочной порту, открывая прививочный трубный зажим и угнетая шприц.
- Проверьте газовый монитор, давление газовых баллонов и фотобиореактор два раза в день (и до отбора проб) на наличие повышенного уровня токсичного газа или указание на утечку.
- Ограничьте отверстие створки капота дыма до ширины, что позволяет достичь регуляторов биореактора и газовых цилиндров. Чтобы избежать риска заражения ингаляцией, убедитесь, что отверстие не подвергает персонал над областью туловиска.
- Поверните регуляторы газовых баллонов в замкнутое положение, чтобы прекратить поступление газа в реактор. Закройте дым капот створки и позволяют 5 минут для капота, чтобы эвакуировать коррозионных газов до отбора проб фотобиореактор культуры.
- Образец в дым капот либо путем открытия головной панели порт и с помощью стерильных серологических пипеты или рисунок культуры в шприц через прививку / выборки порта. Защищайте порты фотобиореактора до открытия газовых баллонов и возобновления эксперимента.
5. Измерение производительности микроводорослей биомассы
- Используйте кривую калибровки, чтобы связать измерения микроводорослей od750 с высушенными концентрациями микромассы биомассы.
- Подготовьте несколько (минимальный: 4, минимальный объем работы: 500 мл) колбы со стерильной микроводорослей среды и привить с видами интереса (например, S. obliquus в этом исследовании).
- Измерьте культуру OD750 до тех пор, пока рост не будет экспоненциальным, и быстро жертвуйте образцом фляг, фильтруя известные объемы (минимум 100 мл) содержимого с мембраной фильтра 0,45 мкм известной массы. Используйте покрытые алюминия вес лодки или стеклянные сосуды для поддержки биомассы и фильтров, как они высыхают.
- Масса биомассы и фильтров после сушки примерно 18-24 ч в духовке между 80-100 градусов по Цельсию. Чтобы проверить полную сушку, измерьте еще раз после дополнительного 2'3 h, чтобы определить, стабилизировалась ли масса.
- Вычтите массу фильтра из комбинированной биомассы и массу фильтра для расчета массы биомассы.
- Участок калибровки кривой, как измеряется OD750 против концентрации биомассы (масса биомассы делится на объем фильтрованной культуры) и соответствует данным с линейной регрессии.
6. Моделирование производительности биомассы и расчеты ставок
- Рассчитайте концентрации биомассы эксперимента на основе измерений OD750 с использованием кривой калибровки линейной регрессии (определяется в разделе 5).
- Fit пакет микроводорослей данные роста от лаг экспоненциальной стационарной фазы с логистической регрессии (Equation 2) в графике и статистике программного обеспечения (Таблица материалов):
(2)
где L является максимальным значением концентрации биомассы кривой, k является относительной крутизной экспоненциальной фазы (время-1), xo это время середины кривой сигмоидальной кривых, и x - время.- Вручную введите логистическое уравнение выше. Выберите Fit кривой с нелинейной регрессией на вкладке Анализ в программном обеспечении. Слева от параметра: Нелинейная регрессионная коробка, выберите Создать новое уравнение под новой коробкой сброса. Используйте явное уравнение по умолчанию в качестве типа уравнения, назовите новую функцию и определите новую функцию как Y q L/(1) exp (-k'(x-b)), где b представляет xo.
- Рассчитайте общую производительность биомассы микроводорослей, разделив разницу между окончательными и первоначальными концентрациями биомассы на разницу между окончательным и первоначальным временем.
- Рассчитайте максимальную производительность биомассы микроводорослей из производной из уравнения 2 (Equation 3) в средней точке сигмоида, когда x xo.
(3)
(2)
(3)Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Кривая калибровки для зеленых микроводорослей, S. obliquus, собранная в экспоненциальной фазе, была установлена с OD750 и сушеными концентрациями биомассы(рисунок 2). Линейная регрессия имела значение R2 0.9996.
Культура S. obliquus была начата в колбе Erlenmeyer 250 мл из культуры, хранящейся на охлажденной агаровой тарелке. Микроводоросль был привит в 3N-BBM с буфером HEPES 10 мм и спаржается с 2,2% CO2 в 2 л фотобиореактор с 1,5 л рабочего объема (0,07 vvm) (Рисунок 1). Партия была отслежена через OD750; концентрации биомассы были рассчитаны на основе кривой калибровки, а затем смоделированы с помощью логистической кривой(рисунок 3). Фотобиореактор поддерживал культуру при рН 6,8, 100 см3 мин-1 общая скорость потока газа, непрерывный 280 ммм -1 освещение, и 27 градусов по Цельсию. Логистическая кривая соответствует данным концентрации биомассы от лаги до экспоненциальной и стационарной фазы. Из логистической модели максимальная концентрация биомассы во время партии составила 2070 и 20 мг л-1,максимальная производительность биомассы составила 4,6 дня, а уровень специфической продуктивности биомассы составил 1,0 д-1. Максимальная продуктивность биомассы, рассчитанная на основе производной логистической кривой на момент максимального роста, составила 532 и 60 мг Л-1 д-1.
Хорошо смешанная модель комнаты использовалась для расчета накопленной концентрации No2,SO2и CO в случае отказа капота дыма на 24 ч. Эти значения были сопоставлены с ограничениями экспозиции(таблица 2). Например, в сценарии, где 0,05 л мин-1 из 400 ppm NO2 выделяется во время периода отказа капота дыма 24 ч, хорошо смешанная модель комнаты с входами вычисляемого G 0.0377 мг мин-1, 0.0001 m3 min-1, V q 100 m3, и максимальное время для моделирования - 1440 мин предсказывает No2 накопления до 0,54 мгмм -3 (0,29 промилле), что выше приемлемого хронического предела воздействия (американского предела значения промышленной зоны ACGIH TLV) и ниже краткосрочного лимита воздействия (STEL).
Перспективное предварительное испытание с смоделированным газом достигло большей максимальной производительности микроводорослей биомассы (690 и 70 мг L-1 d-1), чем у 12% CO2 и ультра-нулевого воздуха (510 й 40 мг L-1 d-1)(рисунок 4). До эксперимента газовый монитор был откалиброван с CO, NO2и SO2. Смоделированный эксперимент по газоза был проведен без какого-либо риска для персонала или повреждения оборудования от коррозионных газов.
Рисунок 1: Фотобиореактор на скамейке, освещенный красными и синими светодиодными огнями. Фотобиореактор работает как двухлпакетный реактор с рабочим объемом 1,5 л. Фотобиореактор непрерывно подается газами через щадящее кольцо и избыточные газовые вентиляционные отверстия через порты в головном уборе. Адаптировано с разрешения Molitor et al.5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Кривая калибровки, относящаяСЯ к OD750 к сухому весу клетки S. obliquus. S. obliquus клеточной культуры светпоглощения была измерена на 750 nm, затем клетки были фильтруются и высушены для получения измерения сухого веса клеток. Перепечатано с разрешения Molitor et al.5. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 3: S. obliquus данные роста на 2,2% CO2 входных смоделированы с логистической регрессии. Точки данных представляют значения биомассы, рассчитанные на основе измерений оптической плотности. Данные были смоделированы с логистической регрессии через наименьшие квадраты подходят; 
где L й 1955 мг L-1, k 1.154 d-1, и х0 и 3,317 д. R2 и 0,995. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 4: Смоделированный S. obliquus рост на 12% CO2, с и без дополнительных смоделированных компонентов газа flue. Измерения биомассы из каждой партии микроводорослей были смоделированы с помощью логистических регрессий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Компонент | Процентов |
| H2O | 12.6% |
| CO2 | 11.6% |
| O2 | 5.8% |
| Co | 0.048% |
| ТАК2 | 0.045% |
| NO2 | 0.022% |
| N2 | 69.9% |
Таблица 1: Состав выбросов угольных электростанций. Эти количества были усреднены из данных о выбросах электростанций ВАЙо, собранных с интервалом в минуту в течение 10 ч.
| Токсичный газ | Twa | Потолка | STEL | НИОШ IDLH | НИОШ РЕЛ | ACGIH TLV | Описание CDC |
| Co | 35 промилле | 200 промилле | - | 1200 промилле | 35 промилле | 25 промилле | Бесцветный, без запаха |
| ТАК2 | 2 промилле | 100 промилле | 5 промилле | 100 промилле | 2 промилле | 2 промилле | Бесцветный газ с характерным, раздражающим, едким запахом |
| NO2 | 3 промилле | 5 промилле | 1 промилле | 13 промилле | 1 промилле | 0,2 промилле | желтовато-коричневый жидкий или красновато-коричневый газ (выше 70 градусов по Фаренгейту) с едким, едким запахом |
Таблица 2: Ограничения воздействия и описания токсичных газов (CO, SO2, NO2) в газе. OSHA TWA: средневзвешенное время (обычно 8 ч период), CEILING: значение никогда не будет достигнуто, STEL: краткосрочный предел воздействия (TWA более 15 мин), NIOSH IDLH: опасность для жизни и здоровья, NIOSH REL: 15 мин предел воздействия, ACGIH TLV: приемлемый предел хронического воздействия, без негативных последствий.
| Составной | Мм |
| NaNO3 | 8.82 x 100 |
| MgSO4No7H2O | 3,04 x 10-1 |
| Nacl | 4.28 x 10-1 |
| K2HPO4 | 4.31 x 10-1 |
| KH2PO4 | 1.29 x 100 |
| CaCl2No2H2O | 1.70 x 10-1 |
| NSO4No7H2O | 3,07 x 10-2 |
| MnCl2No 4H2O | 7.28 x 10-3 |
| МО3 | 4.93 x 10-3 |
| CuSO4No5H2O | 6.29 x 10-3 |
| Ко (NO3)2No 6H2O | 1,68 x 10-3 |
| H3BO3 | 1,85 x 10-1 |
| Эдта | 1.71 x 10-1 |
| Ко | 5.52 x 10-1 |
| FeSO4No7H2O | 1.79 x 10-2 |
| H2SO4 (концентрированный) | 1 x 10-3 л |
Таблица 3: Состав базальной среды с тройным азотом (3N-BBM). Количество азота было утроено от базальной среды оригинального Смелая11.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Эксперименты с биобиореактором с регулируемым рН, температурой, скоростью потока газа и концентрацией газа способствуют значимым результатам, устраняя загрязнение нецелевыми водорослями и изменчивость в культурных условиях. Точную кинетику роста чистой культуры можно получить даже при наличии коррозионных газов (CO2,SO2,NO2),которые служат питательными веществами, превращая отходы в ценный продукт, такой как корм для животных.
Перед началом любого микроводорослей культуры, выбранной культуры микроводорослей должны быть взяты из хранения и переадажены к жидкой культуре. Выращивание микроводорослей в экспоненциальную фазу повышает вероятность того, что эксперименты имеют эквивалентные первоначальные условия и что микроводоросли не застаиваются в фазе отставания после прививки.
Кривые калибровки, касающиеся оптической плотности и концентраций биомассы, особенно важны при изучении продуктивности биомассы. Высокая производительность микроводорослей биомассы является одной из ключевых целей микроводорослевой промышленности и, как таковая, часто является показателем успеха исследований12. Поэтому точные расчеты концентраций биомассы на основе измерений оптической плотности должны вытекать из конкретных видов, точных и точных данных кривой калибровки. Чтобы избежать потенциальных оптических помех, важно, чтобы измерения кривой калибровки и в ходе эксперимента производились в эквивалентных фоновых решениях. Кроме того, кривая калибровки должна быть сделана с измерениями, взятыми из микроводорослей в фазе роста (ы) наиболее репрезентативным из тех, в экспериментах. Некоторые микроводоросли могут иметь значительные различия в размерах клеток на различных фазах роста, которые могут изменять оптическую плотность и воспринимаемые концентрации биомассы. Следует отметить, что производительность биомассы связана с темпами роста, но не эквивалентна им. Конкретные темпы роста зависят от количества клеток (изменение плотности клеток с течением времени/плотности клеток) присутствуют, а специфическая производительность биомассы зависит от массы клеток (изменение биомассы мг/л с течением времени на мг/л биомассы)13 настоящее время.
При моделировании концентраций микроводорослей биомассы с помощью логистической кривой экспериментальные результаты можно осмысленно сравнивать путем интерполяции концентраций биомассы и точного расчета продуктивности биомассы. Тем не менее, следует принимать меры при интерпретации этих экспериментальных результатов; неуместным сравнивать общую и максимальную продуктивность биомассы. Хотя максимальные значения производительности биомассы полезны для сравнения результатов пакетов, общая производительность биомассы вводит в заблуждение без дополнительной информации о продолжительности эксперимента и этапах микроводорослей. Эти показатели постоянно меняются во время задержки, роста журналов и стационарных фаз.
Во время экспериментов с коррозионными газами, характерными для электростанций или промышленных выбросов сгорания, следует проявлять осторожность как для здоровья человека, так и для долговечности оборудования. Стандартные детали должны быть заменены более прочными материалами, а расходные материалы, такие как трубки, должны быть проверены и заменены чаще, чтобы противостоять коррозии, предотвращать утечки и избегать воздействия на человека. Дополнительные меры безопасности и осведомленность о рисках имеют важное значение для безопасной и успешной эксплуатации и отбора проб. Этот метод не подходит для легковоспламеняющихся газов, поскольку существует потенциал для накопления газа в головном пространстве, и оборудование не предназначено ни для таких рисков, ни подходит для безопасной адаптации к таким условиям.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Этот материал основан на работе, поддерживаемой Национальным научным фондом стипендий по исследованиям в рамках ГрантА No 1546595. Любые мнения, выводы, выводы или рекомендации, выраженные в этом материале, являются мнениями авторов и не обязательно отражают точку зрения Национального научного фонда. Работа была также поддержана Университетом Айовы Выпускник и профессиональный студенческий правительственный грант исследований, а также Университет штата Айова Фонда, Аллен С. Генри облечения. Исследования проводились в Фитотехнофийской лаборатории В.М. Кека. Авторы хотели бы поблагодарить сотрудников электростанции Университета Айовы, особенно Марка Максвелла, за экспертизу и финансовую поддержку смоделированных газов. Авторы также хотели бы поблагодарить Эмили Мур за ее помощь в отборе проб и анализа и Эмили Грин за ее помощь и участие в протоколе видео.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Biostat A bioreactor | Sartorius Stedim | 2-liter bioreactor for microbial fermentation; designed to be autoclaved; pH, temperature, gas flow rate control | |
| Bump test NO2 gas | Grainger | GAS34L-112-5 | Calibration gas for MultiRAE gas detector |
| Bump test O2, CO, LEL gas | Grainger | GAS44ES-301A | Calibration gas for MultiRAE gas detector |
| Bump test SO2 gas | Grainger | GAS34L-175-5 | Calibration gas for MultiRAE gas detector |
| Corrosion resistant tubing for NO2 gas | Swagelok | SS-XT4TA4TA4-6 | PTFE Core Hose Smooth Bore X Series—Fiber Braid and 304 SS Braid Reinforcement |
| Corrosion resistant tubing for SO2 gas | QC Supply | 120325 | Reinforced Braided Natural EVA Tubing - 1/4" ID |
| cozIR 100% CO2 meter | Gas Sensing Solutions Ltd. | CM-0121 at CO2meter.com | CO2 meter for concentrations up to 100% |
| cozIR 20% CO2 meter | Gas Sensing Solutions Ltd. | CM-0123 at CO2meter.com | CO2 meter for concentrations up to 20% |
| Durapore Membrane Filter, 0.45 μm | Millipore Sigma | HVLP04700 | Hydrophilic, plain white, 47 mm diameter, 0.45 μm pore size, PVFD membrane filters |
| Gas cylinder regulators | Praxair | PRS 40221331-660 | Single-stage stainless steel regulator configured for 0-15 psi outlet assembly diaphragm valve with 1/4" MNPT threads, Stainless steel to resist corrosion from NOx and SOx |
| Gas cylinders | Praxair | Ulta-zero air, high purity CO2, or custom gas composition | Dependent on study objectives |
| Gas monitoring and leak detection system | RAE Systems by Honeywell | MAB3000235E020 | Pumped model that detects O2, SO2, NO2, CO, and LEL |
| GasLab software | GasLab | v2.0.8.14 | Software for CO2 meter measurements and data logging |
| Hose barb | Grainger | Item # 3DTN3 | Used to adapt regulators to tubing, Stainless steel to resist corrosion from NOx and SOx |
| K30 1% CO2 meter | Senseair | CM-0024 at CO2meter.com | CO2 meter for concentrations less than 1% |
| LED grow panels | Roleadro | HY-MD-D169-S | Red & blue LED light panels |
| Memosens dissolved oxygen probe | Endress+ Hauser | COS22D-19M6/0 | Autoclavable (with precautions) dissolved oxygen probe for bioreactor |
| Memosens pH probe | Endress+ Hauser | CPS71D-7TB41 | Autoclavable (with precautions) pH probe for bioreactor |
| Oven, Isotemp 500 Series | Fisher Scientific | 13246516GAQ | Small oven for drying |
| Prism GraphPad software | GraphPad Software | Version 7.03 or 8.0.1 | Graphing software for data organization, data analysis, and publication-quality graphs |
| Stem to hose barb fitting | Swagelok | SS-4-HC-A-6MTA | Stainless Steel Hose Connector, 6 mm Tube Adapter, 1/4 in. Hose ID |
| Tubing, dilute acid/base transfer | Allied Electronics and Automation | 6678441 | Silicone TP Process Tubing; 1.6mm Bore Size; 3000mm Long; Food Grade |
| Tubing, gas transfer | Allied Electronics and Automation | 6678444 | Silicone TP Process Tubing; 3.2mm Bore Size; 3000mm Long; Food Grade |
References
- Obom, K. M., Magno, A., Cummings, P. J.
- Cheah, W. Y., Pau Loke, S., Chang, J. -S., Ling, T., Juan, J. C. Biosequestration of atmospheric CO2 and flue gas-containing CO2 by microalgae. Bioresource Technology. 184, 190-201 (2014).
- Xu, L., Weathers, P. J., Xiong, X. -R., Liu, C. -Z. Microalgal bioreactors: Challenges and opportunities. Engineering in Life Sciences. 9 (3), 178-189 (2009).
- Tsang, Y. F. Photobioreactors: Advancements, Applications and Research. , Nova Science Publishers, Inc. Hauppauge, NY. (2017).
- Molitor, H. R., Moore, E. J., Schnoor, J. L. Maximum CO2 Utilization by Nutritious Microalgae. ACS Sustainable Chemistry & Engineering. 7 (10), 9474-9479 (2019).
- Khan, M. I., Shin, J. H., Kim, J. D. The promising future of microalgae: current status, challenges, and optimization of a sustainable and renewable industry for biofuels, feed, and other products. Microbial Cell Factories. 17 (1), 36 (2018).
- Benemann, J. R.
- AIHA. IH MOD. , Available from: https://aiha.org/public-resources/consumer-resources/topics-of-interest/ih-apps-tools (2019).
- Centers for Disease Control and Prevention, Immediately Dangerous To Life or Health (IDLH) Values. The National Institute for Occupational Safety and Health. , Available from: https://www.cdc.gov/niosh/idlh/intridl4.html (2019).
- Nakanishi, K., Deuchi, K., Kuwano, K. Cryopreservation of four valuable strains of microalgae, including viability and characteristics during 15 of cryostorage. Journal of Applied Phycology. 24 (6), 1381-1385 (2012).
- Bischoff, H. W., Bold, H. C. Some soil algae from Enchanted Rock and related algal species. , University of Texas. Austin, Texas. (1963).
- Mata, T. M., Martins, A. A., Caetano, N. S. Microalgae for biodiesel production and other applications: A review. Renewable and Sustainable Energy Reviews. 14 (1), 217-232 (2010).
- Wood, A. M., Everroad, R. C., Wingard, L. M. Measuring growth rates in microalgal cultures. Algal Culturing Techniques. Andersen, R. A. , Elsevier Academic Press. Burlington, MA. 270-272 (2005).
