Summary
מאמר זה מתאר את הפרוטוקולים המשמשים להפקת פלטפורמת אספקת חיסונים חדשנית, "polybubbles", כדי לאפשר שחרור פרץ מושהה. פוליאסטר כולל פולי (חומצה לקטית-co-גליקולית) ו polycaprolactone שימשו כדי ליצור את polybubbles מולקולות קטנות ואנטיגן שימשו מטען.
Abstract
אסטרטגיות אספקת חיסונים שיכולות להגביל את החשיפה של מטען לממס אורגני תוך מתן אפשרות לפרופילי שחרור חדשניים הן קריטיות לשיפור כיסוי החיסון ברחבי העולם. כאן, מוצגת פלטפורמת חדשנית להזרקה, אולטרה סגולה הניתנת לריפוי ועיכוב בהפצה, המאפשרת אספקת חיסונים בשם polybubbles. המטען הוזרק לתוך polybubbles פוליאסטר מבוסס שנוצרו 10% carboxymethycellulose מבוסס תמיסה מים. נייר זה כולל פרוטוקולים לשמירה על צורה כדורית של polybubbles ולמטב את מיקום מטען ושמירה כדי למקסם את כמות המטען בתוך polybubbles. כדי להבטיח בטיחות, תכולת ממס כלור בתוך polybubbles נותחו באמצעות ניתוח הפעלת ניוטרונים. מחקרי שחרור נערכו עם מולקולות קטנות כמטען בתוך polybubble כדי לאשר שחרור פרץ מושהה. כדי להראות עוד יותר את הפוטנציאל למסירה לפי דרישה של המטען, nanorods זהב היו מעורבים בתוך מעטפת פולימר כדי לאפשר הפעלת לייזר כמעט אינפרא אדום.
Introduction
כיסוי חיסון מוגבל גורם למותם של 3 מיליון אנשים הנגרמת במיוחד על ידי מחלות הניתנות למניעה חיסון1. תנאי אחסון ותחבורה לקויים מובילים לבזבוז של חיסונים פונקציונליים ובכך תורמים לצמצום החיסונים הגלובליים. בנוסף, חיסון לא שלם בשל אי דבקות בלוחות הזמנים הנדרשים של החיסון גורם גם לכיסוי חיסון מוגבל, במיוחד במדינות מתפתחות2. ביקורים מרובים של אנשי צוות רפואי נדרשים בתקופה המומלצת לקבלת זריקות מאיץ, ובכך להגביל את אחוז האוכלוסייה עם חיסון מלא. לפיכך, יש צורך בפיתוח אסטרטגיות חדשניות לאספקת חיסון מבוקר כדי לעקוף אתגרים אלה.
המאמצים הנוכחיים לפיתוח טכנולוגיות לאספקת חיסונים כוללים מערכות פולימריות מבוססות אמולסיה3,4. עם זאת, המטען חשוף לעתים קרובות לכמות גדולה יותר של ממס אורגני שעלול לגרום באופן פוטנציאלי צבירה ופירוק, במיוחד בהקשר שלמטען מבוסס חלבון 5,6. פיתחנו פלטפורמת אספקת חיסונים חדשנית, "polybubbles", שיכולה לאסוף מספר תאים מטען תוך מזעור נפח המטען החשוףלממס 7. לדוגמה, בפלטפורמת מעטפת הליבה שלנו polybubble, כיס מטען אחד של קוטר 0.38 מ"מ (SEM) מוזרק במרכז polybubble 1 מ"מ. במקרה זה, שטח פני השטח של מטען חשוף ממס אורגני יהיה כ 0.453 מ"מ2. לאחר ששקל את צפיפות האריזה של ספירות (מיקרוחלקיקים) בתוך כדור (מחסן מטען), הנפח בפועל של מיקרוחלקיקים (10 μm קוטר) שיכול להתאים במחסן הוא 0.17מ"מ 3. הנפח של מיקרוחלקיקים אחד הוא 5.24x10-8 מ"מ 3 ולכן מספר החלקיקים מיקרוחלקיקים שיכולים להתאים למחסן הוא ~ 3.2x106 חלקיקים. אם לכל מיקרו-חלקיק יש 20 כיסי מטען (כתוצאה מתמוה כפול) בקוטר 0.25 μm, אז שטח פני השטח של המטען שנחשף לממס אורגני הוא 1274 מ"מ2. מחסן מטען בתוך polybubble ובכך יהיה ~ 2800 פי שטח פני השטח פחות חשוף ממס אורגני בהשוואה לזה של מטען אורגני חשוף ממס בחלקיקים זעירים. הפלטפורמה המבוססת על פוליאסטר שלנו יכולה להפחית את כמות המטען החשוף לממס אורגני, שאחרת עלול לגרום לצובר מטענים וחוסר יציבות.
Polybubbles נוצרים על בסיס עקרון הפרדת פאזה שבו הפוליאסטר בשלב אורגני מוזרק לתוך פתרון מים וכתוצאה מכך בועה כדורית. מטען בשלב המים לאחר מכן ניתן להזריק במרכז polybubble. תא מטען נוסף יכול להיות מושגת פוטנציאלית בתוך polybubble על ידי ערבוב מטען שונה עם מעטפת הפולימר. הפוליבבל בשלב זה יהיה ניתן לגבש ולאחר מכן ירפא כדי לגרום למבנה polybubble מוצק עם מטען באמצע. פוליבבלים כדוריים נבחרו על פני צורות גיאומטריות אחרות כדי להגדיל את קיבולת המטען בתוך polybubble תוך מזעור הגודל הכולל של polybubble. פוליקבבלים עם מטען במרכז נבחרו להפגין שחרור פרץ מושהה. Polybubbles שולבו גם עם אינפרא אדום ליד (NIR)- רגיש (כלומר, theranostic-זמין) סוכן, כלומר nanorods זהב (AuNR), כדי לגרום לעלייה בטמפרטורה של polybubbles. אפקט זה עשוי להקל על השפלה מהירה יותר, והוא יכול לשמש לשליטה בקינטיות ביישומים עתידיים. בנייר זה, אנו מתארים את הגישה שלנו לצורה ולאפיין polybubbles, כדי להשיג שחרור פרץ מושהה מן polybubbles, ולשלב AuNR בתוך polybubbles כדי לגרום ניר-הפעלה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. פוליקאפולאציון טריקרילט (PCLTA) סינתזה
- יבש 3.2 מ"ל של 400 דה פוליקאפולאסיון (PCL) טריו בלילה ב 50 מעלות צלזיוס בקבוקון פתוח 200 מ"ל עגול בתחתית K2CO3 ב בקבוקון זכוכית ב 90 מעלות צלזיוס.
- מערבבים את הטריו עם 6.4 מ"ל של דיכלורומטאן (DCM) ו-4.246 גרם אשלגן קרבונט (K2CO3)תחת ארגון.
- מערבבים 2.72 מ"ל של אקרילויל כלוריד ב-27.2 מ"ל של DCM ומוסיפים את הירידה לתערובת התגובה במבחנות במשך 5 דקות.
- מכסים את תערובת התגובה בנייר אלומיניום ומשאירים אותה ללא הפרעה בטמפרטורת החדר למשך 24 שעות תחת ארגון.
- לאחר 24 שעות, לסנן את תערובת התגובה באמצעות נייר מסנן על משפך Buchner תחת ואקום כדי להשליך ריאגנטים עודפים.
- לזרז את סינון מ שלב 1.5 המכיל את הפולימר endcapped באתר diethyl ב 1:3 (vol / vol) ו rotovape ב 30 ° C כדי להסיר את אתר diethyl.
2. היווצרות הפוליבבל
הערה: הזרקת פולימר במים deionized (DI) תגרום polybubbles לנדוד לתחתית הבקבוקון וכתוצאה מכך תחתית שטוחה. השתמש 10% (wt / vol) תאית carboxymethyl (CMC) למלא את בקבוקון הזכוכית במקום כדי למנוע שיטוח polybubble.
- הכן 10% (wt/vol) CMC פתרון במים DI.
- מלא בקבוקון זכוכית 0.92 מ"ל עם 0.8 מ"ל של 10% CMC באמצעות צינור העברה 1 מ"ל.
- לערבב 1000 מ"ג/מ"ל של 14 kDa PCL ב- DCM ולסנתז PCLTA ב 1:3 (vol/vol) עבור נפח כולל של 200 μL או להכין 200 μL של 1000 מ"ג/מ"ל של 5 kDa פולי (חומצה לקטית-co-גליקולית) diacrylate (PLGADA) בכלורופורם.
- לערבב את 2-hydroxy-4′-(2-hydroxyethoxy)-2-מתילפרופיופנון (פוטויינטיאטור) עם פולימר (PLGADA או PCL / PCLTA) תערובת ב 0.005:1 (vol / vol).
- טען 200 μL של תערובת פולימר לתוך מזרק זכוכית 1 מ"ל רכוב על משאבת מזרק המחובר צינור נירוסטה חלוקת עם קוטר פנימי של 0.016 אינץ'.
- השתמש micromotor כדי לשלוט בתנועה קדימה ואחורה של צינור הפולימר להזריק פולימר לתוך 10% CMC במבחנה זכוכית כדי ליצור את polybubble.
- לרפא את polybubbles תחת אולטרה סגול (UV) ב אורך גל 254 צפון צפון עבור 60 s ב 2 W / ס"מ2.
- פלאש להקפיא את polybubbles חנקן נוזלי lyophilize לילה ב 0.010 mBar ואקום ב -85 ° C.
- הפרד את הפוליבבלים מה-CMC המיובש באמצעות מרסים ושטוף את הפוליבבלים עם מי DI כדי להסיר כל שאריות CMC שיורית. שים לב כי פולימרים אחרים יכול לשמש סביר עם שינויים כדי לשנות את הקינטיות שחרור.
3. אפנון של קוטר polybubble
- מלא בקבוקון זכוכית 0.92 מ"ל עם 10% CMC באמצעות צינור העברה של 1 מ"ל.
- ערבב PCL/PCLTA ב- 1:3 (vol/vol) עם 1000 מ"ג/מ"ל 14kDa PCL וסנתז PCLTA. מערבבים את הפוטו-אינטיטור עם תערובת פולימר ב-0.005:1 (vol/vol).
- טען את תערובת הפולימר למזרק זכוכית של 1 מ"ל המותקן על משאבת מזרק המחוברת לצינור מפלדת אל-חלד בקוטר פנימי של 0.016 אינץ'.
- השתמש micromotor כדי לשלוט בתנועה קדימה ואחורה של צינור הפולימר להזריק פולימר לתוך 10% CMC במבחנה זכוכית כדי ליצור את polybubble.
- כדי להשיג polybubbles עם קוטרים שונים, לשנות את קצב חלוקת מ 0.0005 כדי 1 μL / s.
- לצלם תמונות של הבקבוקון עם polybubbles בקוטר משתנה.
- השתמש ב- ImageJ כדי לכמת את קוטר הפוליקבלים ולהשתמש בגודל הבקבוקון כקני קנה מידה.
4. רכז מטען בתוך polybubble
-
אפנון צמיגות PCL/PCLTA באמצעות K2CO3:
הערה: צמיגות של PLGADA אין צורך לשנות באמצעות K2CO3 כי צמיגות של 5 kDa PLAGDA ב 1000 מ"ג / מ"ל מספיק למרכז המטען.- להוסיף K2CO3 (שהיה מבודד לאחר תגובת PCLTA) PCLTA בריכוזים שונים כולל 0 מ"ג / מ"ל, 10 מ"ג / מ"ל, 20 מ"ג / מ"ל, 40 מ"ג / מ"ל, ו 60 מ"ג / מ"ל.
- מדוד את צמיגות הדינמיות של הפתרונות על-ידי שינוי קצב ההטיה מ- 0 ל- 1000 1/s באמצעות ראומטריה.
- להזריק באופן ידני את המטען באמצע (עיין שלב 4.2 כדי להכין את תערובת המטען) של polybubbles שנוצרו באמצעות פתרונות PCL / PCLTA עםריכוזים שוניםשל K 2 CO3 (שלב 4.1.1). לקבוע את הריכוז האופטימלי של K2CO3 על ידי התבוננות איזה פתרון מ שלב 4.1.1 יכול לגרום לשמירה של המטען באמצע.
-
רכז המטען (שכבר מוצג היתכנות עם מולקולות קטנות) עם CMC
- מערבבים את המטען עם 5% (wt/vol) CMC ברוטציה בן לילה כדי להגדיל את צמיגות המטען.
- באופן ידני להזריק 2 μL של תערובת מטען polybubble ולהמשיך עם ריפוי UV ב 254 צפון צפון גל עבור 60 s ב 2 W / ס"מ2.
- פלאש להקפיא את polybubbles בחנקן נוזלי עבור 30 s ו lyophilize לילה ב 0.010 mBar ואקום ב -85 ° C.
- הפרד את הפוליבבלים מה-CMC המיובש באמצעות מרסים ושטיפה עם מי DI כדי להסיר שאריות CMC.
- חותכים את הפוליבבל לשניים ודמיינת את החצאים באמצעות מיקרוסקופית קונפוקלית כדי להבטיח שהמטען יהיה מרוכז (עיין בשלב 6 לרגשות ולאוכי גל של פליטה).
5. ניסוח מטען
הערה: ניסוח Polybubble יכול לאסוף סוגי מטען שונים, כולל מולקולות קטנות, חלבונים, וחומצות גרעין.
- בהתבסס על מחקרים קודמים, במקרה של מטען חלבון, להשתמש excipients כולל פוליאתילן גליקול (PEG)6, polyvinylpyrrolidone (PVP), ו גליקופולימרים 6 כדי לשפר את היציבות של חלבוןבמהלך ניסוח polybubble.
- טופס polybubbles בהתבסס על הפרוטוקול בשלב 2.
- להכין את פתרון האנטיגן על ידי הוספת 17.11 גרם של trehalose 625 μL של HIV gp120/41 אנטיגן.
- להזריק באופן ידני 1 μL של תמיסת אנטיגן באמצע polybubble.
- פתח polybubbles בימים 0, 7, 14, ו 21, ולתוע את הפלואורסצנטיות של אנטיגן עם אורכי גל של העירור ופליטה 497 נמיום ו 520 צפון צפון, בהתאמה.
- לקבוע את הפונקציונליות של האנטיגן באמצעות אנזים מקושר תסה חיסונית (ELISA) ולהשתמש 5% חלב דל שומן כמאגר חסימה.
6. שחרור מטען
הערה: מולקולה קטנה או אנטיגן יכול לשמש כסוג המטען
-
מולקולה קטנה
- דגירה polybubbles עם acriflavine מרוכז ב 400 μL של תמיסת מלח מאגר פוספט (PBS) ב 37 ° C, 50 ° C עבור פוליבבים PLGADA וב 37 ° C, 50 ° C, 70 ° C עבור PCL / PCLTA polybubbles.
הערה: הסיבה מדוע אנו ממליצים בדיקות מעל טמפרטורות הגוף היא כדי) לדמות את הטמפרטורה (50 °C) שבה polybubble מגיע תוך לייזר nanorods זהב (AuNRs) בתוך PCL ו PLGA; ב) להאיץ את תהליך ההשפלה של PCL (50 °C, 70 °C). - בכל נקודת זמן, לאסוף את supernatants ולהחליף עם 400 μL של PBS טרי.
- השתמש בקורא לוחות כדי לכמת את עוצמת הפלואורסץ בסופרנטנטים שנאספו.
הערה: השתמש לשעבר/em של 416 נאר/514 צפון-מז' עבור acriflavine.
- דגירה polybubbles עם acriflavine מרוכז ב 400 μL של תמיסת מלח מאגר פוספט (PBS) ב 37 ° C, 50 ° C עבור פוליבבים PLGADA וב 37 ° C, 50 ° C, 70 ° C עבור PCL / PCLTA polybubbles.
-
אנטיגן
- דגירה polybubbles עם סרום אלבומין של פר מרוכז (BSA)-488 ב 400 μL של PBS ב 37 ° C, 50 ° C עבור PLGADA polybubbles וב 37 ° C, 50 ° C עבור PCL / PCLTA polybubbles.
- בכל נקודת זמן, לאסוף את supernatants ולהחליף עם 400 μL PBS טרי.
- השתמש בקורא לוחות כדי לכמת את עוצמת הפלואורסץ בסופרנטנטים שנאספו. השתמש ב-497 00 00 00 00 00 00:00:00,000 --&00:00,000 --&00:00,000 00:00:00
הערה: שחרור מחקר ב 70 °C עבור PCL / PCLTA polybubbles לא צריך לערך כדי למנוע חשיפת האנטיגן לטמפרטורה קיצונית.
7. רעילות
-
כימות תכולת כלור בפוליבבלים באמצעות ניתוח הפעלת ניוטרונים (NAA)
- השתמש polybubbles שהיו lyophilized עבור 2, 4, 6, 20, ו 24 שעות עבור מחקר זה ב 0.010 mBar ואקום ב -85 °C.
- למדוד 5-9 מ"ג של polybubbles ולמקם אותם על בקבוקונים LDPE ההקרן.
- הכן 1000 גרם/מ"ל של פתרון כיול כלור מהמכון הלאומי לתקנים וטכנולוגיה (NIST)-פתרון כיול הניתן למעקב.
- השתמש 1-מגוואט Triga כור לבצע הקרנות ניוטרונים על כל דגימה בקצב fluence ניוטרונים של 9.1 ×10 12 /cm2·s עבור 600 s.
- מעבירים את הפוליקבלים לנבעונים ללא תדר.
- השתמש בגלאי HPGe כדי להשיג ספקטרה קרני גמא עבור 500 s לאחר 360 מרווחי ריקבון.
- השתמש בתוכנות NAA על ידי תעשיות קנברה כדי לנתח את הנתונים.
-
כימות תכולת כלור ששוחררה מפוליבבלים באמצעות NAA
- דגירה polybubbles שהיו lyophilized לילה (ב 0.010 mBar ואקום ו -85 ° C) ב 400 μL של PBS ב 37 ° C.
- לאסוף את supernatants בשבועות 1, 2, ו 3 לאחר הדגירה.
- נתח את supernatants עבור תוכן כלור באמצעות NAA באמצעות אותה שיטה כמתואר לעיל בשלב 7.1.
8. סינתזה של AuNR מאת קיטלר, ס', ואח'8
- להכין פתרון זריעה AuNR על ידי ערבוב 250 μL של 10 m חומצה כלורואורית (HAuCl4),7.5 מ"ל של 100 m cetrimonium ברומיד (CTAB), ו 600 μL של 10 mM קרח קר נתרן borohydride (NaBH4).
- להכין פתרון צמיחה על ידי ערבוב 40 מ"ל של 100 מ"ר CTAB, 1.7 מ"ל של 10 mM HAuCl4, 250 μL של כסף חנקתי (AgNO3),ו 270 μL של 17.6 מ"ג / מ"ל חומצה אסקורבית לצינור.
- מערבבים במרץ 420 μL של פתרון זרע עם פתרון הצמיחה ב 1200 סל"ד במשך 1 דקות. לאחר מכן להשאיר את התערובת ללא הפרעה להגיב במשך 16 שעות.
- מוציאים את הריגנטים העודפים מהתערובת על ידי צנטריפוגה g ב-8,000 × גרם למשך 10 דקות ומשליכים את הסופרנטנט.
9. הידרופוביזציה של AuNRs על ידי סולימן, M.G., ואח '9
- להתאים את ה-pH של 1.5 מ"ל של AUNRs מיוצב CTAB מסונתז ל 10 באמצעות 1 mM נתרן הידרוקסיד (NaOH).
- מערבבים את הפתרון עם 0.1 מ"ל של 0.3 mM מתילציה PEG (mPEG) thiol ב 400 סל"ד לילה.
- מערבבים PEGylated AuNRs עם 0.4 M dodecylamine (DDA) בכלורופורם ב 500 סל"ד במשך 4 ימים.
- מקטרים את השכבה האורגנית העליונה המכילה AuNRs הידרופוביים ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס עד לשימוש עתידי.
10. ניר-הפעלה של polybubbles
- מערבבים את תמיסת הפולימר (PLGADA או PCL/PCLTA) עם AuNRs הידרופוביים ב- 1:9 (vol/vol).
- מוסיפים את הפוטו-יטיטור לתערובת הפולימר-AuNR ב- 0.005:1 (vol/vol).
- טופס polybubbles על ידי הזרקת תערובת פולימר-AuNR לתוך בקבוקון זכוכית 0.92 מ"ל עם 10% CMC (wt / vol) (עיין שלב 2).
- לרפא את polybubbles ב 254 צפון צפון אורך גל עבור 60 s ב 2 W / ס"מ2.
- פלאש להקפיא חנקן נוזלי עבור 30 s ו lyophilize לילה ב 0.010 mBar ואקום ב -85 ° C.
- הפרד את הפוליבבלים המיובשים באמצעות מרסים ושטיפה עם מי DI כדי להסיר כל שאריות CMC שיורית.
- דגירה polybubbles ב 400 μL של PBS ב 37 ° C.
- הפעל את polybubbles באמצעות 801 nm ניר לייזר ב 8A במשך 5 דקות בכל יום שני, רביעי ושישי.
- קח תמונות אינפרא אדום (FLIR) במבט קדימה של polybubble לפני ואחרי הפעלת לייזר כדי להשיג ערכי טמפרטורה.
- חשב את הבדלי הטמפרטורה בין לפני ואחרי הפעלת לייזר בהתבסס על ערכי הטמפרטורה מתמונות FLIR.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Polybubbles היו מאופיינים בהרחבה באמצעות SEM ו NAA. המטען היה מרוכז בהצלחה כדי לגרום לשחרור פרץ מושהה. Polybubbles היו גם בהצלחה מופעל בלייזר בגלל הנוכחות של AuNRs בתוך polybubbles.
אפיון פוליבבל
Polybubbles מוזרק בתמיסה מים ללא CMC הביא polybubble שטוח בשל המגע שלהם עם החלק התחתון של בקבוקון הזכוכית (איור 1,B). שיטוח חלקי נצפתה כאשר 5% פתרון מים מבוסס CMC שימש במקום מים DI (איור 1C). לאחר מכן, 10% פתרון מים מבוסס CMC בבקבוקון זכוכית הביא polybubble להיות מושעה בתמיסה ובכך תחזוקה מוצלחת של כדוריות של polybubble (איור 1D).
מרכז מטענים
הזרקת מטען לתוך polybubble בהיעדר CMC הביא דליפה גורם לא שמירה של מטען בתוך polybubble (איור 3). כדי להתמודד עם אתגר זה, שתי גישות שימשו: 1) צמיגות של PCLTA גדל בהצלחה באמצעות K2CO3 שהיה מבודד לאחר סיום PCL טריו עם triacrylate(איור 2),ו 2) צמיגות המטען גדל בהצלחה לאחר ערבוב המטען עם 5% CMC (איור 3, איור 4). צמיגות של polybubbles PLGADA היו מספיקים כדי להקל על רכזת המטען ולכן לא היה מאופנן באמצעות K2CO3.
פונקציונליות אנטיגן
HIV gp120/41 אנטיגן היה מעורבב עם ובלי trehalose לפני הזרקת לתוך polybubble (איור 5). יעילות מחייבת של נוגדנים לאנטיגן (בשם פונקציונליות) עם ובלי trehalose נצפתה אין הבדל משמעותי סטטיסטית.
שחרור מחקרים ללא הפעלת לייזר
מהדורות פרץ מושהות נצפו בפוליבובלי PLGADA עם acriflavine באמצע בימים 19 ו 5 עבור polybubbles דגירה ב 37 ° C (איור 6A) ו 50 ° C (איור 6B), בהתאמה. מהדורות פרץ מושהות נצפו גם בפוליבובלי PCL/PCLTA עם acriflavine באמצע בימים 160 ו 60 עבור polybubbles דגירה ב 50 ° C (איור 7A) ו 70 ° C (איור 7B), בהתאמה. מחקרי שחרור אלה נערכו בהיעדר AuNRs המופעלים באמצעות לייזר.
בהפעלת לייזר במבחנה של polybubbles
Polybubbles עם AuNRs בפגז הופעלו בהצלחה לייזר מספר פעמים PLGADA polybubbles (איור 8A) ו PCL / PCLTA polybubbles (איור 8B). שינויי טמפרטורה לפני ואחרי הפעלת לייזר היו 10 ± 1 ° C ו 5 ± 1 ° C ב PCL / PCLTA polybubbles עם ריכוז AuNR גבוה ונמוך יותר בפגז, בהתאמה. שינויי טמפרטורה שנצפו לפני ואחרי הפעלת לייזר היו 11 ± 2 ° C ו 6 ± 1 ° C בפוליבבלים PLGADA עם ריכוז AuNR גבוה ונמוך יותר בפגז, בהתאמה.
איור 1: שמירה על כדוריות של פוליבבלים. תמונות SEM של (A) 14 kDa PCL/300 Da PCLTA שיטחה polybubble בשל המגע של polybubble עם החלק התחתון של בקבוקון הזכוכית; (ב)14 kDa PCL/300 Da PCLTA polybubble מההתחלה שלא היה במגע עם תחתית הזכוכית; (ג)polybubbles PCL/PCLTA עם מידה פחותה של שיטוח כאשר מוזרק לתוך 5% פתרון CMC לעומת פתרון מים DI, גורם להיווצרות של צורה כמו חצי הכדור בנקודת המגע עם הבקבוקון; (D)polybubble שלא הגיע לתחתית בקבוקון הזכוכית כאשר מוזרק לתוך 10% CMC פתרון, המאפשר את הצורה הכדורית להישמר. כל הסורגים בקנה מידה המצוין הם 500 μm. נתון זה שונה מ- Lee ואח '7. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 2: אפנון צמיגות PCLTA. ריכוז K2CO3 הוגדל מ 0 כדי 80 מ"ג / מ"ל ב PCLTA צמיגות דינמית נצפתה להגדיל באופן פרופורציונלי עם הריכוז של K2CO3. נתון זה שונה מ- Arun Kumar et al10. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 3: הזרקת מטען לתוך polybubble עם ובלי CMC. הלוח העליון מראה מסגרות שחולצו מהווידאו של דליפת מטען במהלך הזרקה בהיעדר CMC. הלוח התחתון מציג מסגרות שחולצו מהווידאו של שימור מטענים בתוך polybubble בנוכחות של 5% CMC. נתון זה שונה מ- Lee ואח '7. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 4: מטען מרוכז. תמונות מיקרוסקופ פלורסנט של (A) PCL / PCLTA polybubble עם מטען מרוכז, (B) PCL / PCLTA polybubble עם מטען בפגז וצבע מרוכז שאינו פלורסנט. נתון זה שונה מ- Arun Kumar et al10. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 5: פונקציונליות אנטיגן עם טרהלוז. פונקציונליות של HIV gp120/41 עם ובלי trehalose בתוך polybubble נותח באמצעות ELISA. היעילות המחייבת של נוגדן לחלבון נחשבת בדרך כלל כאינדיקטור לפונקציונליות של החלבון. כאשר אנו דנים בפונקציונליות של אנטיגן במחקר זה, אנו מתכוונים שזה אומר שזה מסייע נוגדנים מחייב את החלבון של עניין (שהוא אינדיקטור לפונקציונליות חלבון). לא נצפתה כל משמעות סטטיסטית בין שתי הקבוצות. מרווחי ביטחון מצוינים על-ידי קווים מוצקים ומנוקדים. נתון זה שונה מ- Lee ואח '7. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 6: שחרור פרץ מושהה מפוליבבלים PLGADA. מחקרי שחרור המציגים מהדורות פרץ מושהות מפוליבבלים PLGADA עם acriflavine באמצע ב (A) 37 ° C, (B) 50 ° C. קו מלא מציין את העקומה המותאם שהושגה בהתבסס על נקודות הנתונים. נתון זה שונה מ- Arun Kumar et al10. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 7: שחרור פרץ מושהה מפוליבבלים PCL/PCLTA. מחקרי שחרור המציגים מהדורות פרץ מושהות מפוליבובלים PCL/PCLTA עם acriflavine באמצע ב (A) 50 °C, (B) 70 °C. נתון זה שונה מ- Arun Kumar et al10. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
איור 8: הפעלת לייזר NIR של polybubbles. שינוי טמפרטורה שנצפה לפני ואחרי הפעלת לייזר NIR ב (A) PLGADA polybubbles, (B) PCL / PCLTA polybubbles עם ריכוז גבוה ונמוך יותר של AuNRs בקלימת הפולימר. עלייה זו בטמפרטורה יכולה להיות ממונפת כדי לזרז את ההשפלה פולימר המוביל לשחרור מוקדם יותר של המטען. נתון זה שונה מ- Arun Kumar et al10. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
טכנולוגיות ואתגרים נוכחיים
חלקיקים מיקרו וחלקיקים מבוססי אמולסיה שימשו בדרך כלל כנשאים משלוח סמים. למרות שחרור קינטיקה של המטען ממכשירים אלה נחקרו בהרחבה, שליטה פרץ שחרור קינטיקה כבר אתגר גדול11. רב-תכליתיות ופונקציונליות המטען מוגבלות גם במערכות מבוססות אמולסיה בשל חשיפת המטען לממיסים מים ואורגניים עודפים. מטען מבוסס חלבון לעתים קרובות אינם תואמים עם מיקרו וחלקיקים בשל האפשרות של denaturation מטען וצבירה12. בנוסף ליציבות המטען, קינטיקה מטען חשוב במיוחד בהקשר של חיסונים בשל הצורך יריות מאיץ המוביל seroconversion. מאמצים קודמים כדי להתמודד עם אתגרים אלה באספקת החיסון לא הצליחו מספיק, כמו הרעיון של מערכות חיסון הזרקה אחת כבר סביב במשך כמה עשורים, עדיין לא תורגם קלינית.
פלטפורמת אספקת החיסונים שלנו יכולה להתגבר על האתגרים עם חשיפה מוגברת של מטען לממס אורגני על ידי מזעור נפח המטען החשוף. טכנולוגיה זו יכולה להכיל לפחות שני תאי מטען: מטען בפגז ומטען במרכז. Polybubbles עם מטען מרוכז יכול לשמש כדי לשלוט על שחרור פרץ המטען תוך כדי להיות תואם לסוגי מטען שונים, כולל מולקולות קטנות ואנטיגן. במחקר זה, השתמשנו פוליאסטר עם זמני השפלה שונים, PLGADA (זמן השפלה קצר יותר) ו PCL / PCLTA (זמן השפלה ארוך יותר), כמו נושאות פולימר acriflavine (מולקולה קטנה) כסוג המטען להפגין שחרור פרץ מושהה. בסעיפים הבאים אנו מתארים את השלבים הקריטיים בגידור פולי-באבלים המסוגלים לאפשר גם שחרור פרץ מושהה והן הפעלת NIR, במיוחד עבור יישומי מסירה עתידיים לפי דרישה.
מטענים במרכז בתוך polybubble
רכזת המטענים הייתה אחד האתגרים המשמעותיים שנתקלו בהם במהלך ניסוח הפוליקבבלים. מיד לאחר ההזרקה, המטען היה נודד אל פני השטח וכיס המטען יתייצב מבלי לפרוץ לפתרון ה-CMC של 10% המים. Polybubbles עם מטען כזה מחוץ למרכז יכול לגרום לשחרור מוקדם יותר בשל עובי לא אחיד של הפולימר המקיף את המטען. ויסות צמיגות הפולימר והמטען היה חיוני לפיכך בפתרון בעיות הקשורות למרכז המטען. צמיגות המטען הוגדלה על ידי ערבוב פתרון המטען עם 5% CMC. כדי להגדיל את צמיגות הפולימר, המשקל המולקולרי של הפולימר היה יכול להיות שונה. עם זאת, הגדלת משקל מולקולרי לעתים קרובות גורמת לירידה פולימר איטית יותר ובכך גורמת לעיכוב נוסף בשחרור המטען. צמיגות הפולימר שונתה כך על ידי הגדלת ריכוז הפולימר. ריכוז גבוה יותר (1000 מ"ג/מ"ל) היה מספיק כדי להגדיל את צמיגות של PLGADA. עם זאת, צמיגות של PCL/PCLTA לא הייתה מספקת כדי לשמור על המטען באמצע. כך, K2CO3 שהיה מבודד לאחר התגובה endcapping של PCLTA שימש כדי להגדיל את צמיגות של PCLTA.
מהדורה מאוחרת של הרומן
שחרור פרץ מושהה נצפה מתוך מחקרי השחרור שנערכו באמצעות polybubbles עם מטען מרוכז. מולקולה קטנה (acriflavine) שימשה כמטען מרוכז בפוליבבלים כדי ללמוד את פרופיל השחרור. פרופילי שחרור ייחודיים נצפו בהתבסס על הפוליאסטר המשמש בשל ההבדל בזמן ההשפלה של הפולימרים. שחרור פרץ נצפתה מוקדם יותר PLGADA polybubbles לעומת זה של PCL / PCLTA polybubbles. שחרור מטען מוקדם נצפתה PLGADA polybubbles כי PLGA משפיל מהר יותר בהשוואה PCL13. לאחר אפנון מוצלח של קינטיקה שחרור עם שני סוגים של פוליאסטר, רצינו עוד יותר להנדס polybubble כדי לאפשר שחרור לפי דרישה של המטען.
ניר-הפעלה של פוליבבלים
שחרור לפי דרישה של המטען ביחס לתזמון של הצרכים של המטופלים היה מאתגר להשיג באמצעות אסטרטגיות משלוח הנוכחי14. שיערנו כי זירוז שחרור המטען לפי דרישה יכול להיות אפשרי על ידי האצת ההשפלה פולימר באמצעות שימוש בסוכני NIR- רגיש (כלומר, התומכים ת'רנוסטי). AuNRs נחקרו בהרחבה על יכולתם להיות מופעל באמצעות לייזר NIR שיכול לנסוע כמה סנטימטרים דרך העור15. AUNRs מיוצב CTAB הוכנו כך בהתבסס על הפרוטוקול על ידי Kittler, S, ואח ', היו הידרופוביים בהתבסס על השיטות שפורסמו על ידי סולימון, M.G., ואח '. Polybubbles עם AuNRs הידרופובי בפגז היו אז הוקרן עם לייזר NIR בנקודות זמן רצויות במשך 5 דקות כדי לצפות בשינוי טמפרטורה. טמפרטורות לפני ואחרי לייזר נמדדו בהתבסס על תמונות FLIR. מעטפת פולימר נרפאה סייעה לשמר את הצורה של AuNRs במהלך הפעלת הלייזר ובכך אפשרה הפעלות NIR מרובות של polybubbles. זוהי הבחנה מעניינת כי בספרות הקודמת, AuNRs היו ידועים לעתים קרובות לאבד את צורתם כמו מוט (חיוני להפעלת NIR) בשלהפעלת לייזר 16. הפעלת הלייזר המוצלחת של polybubbles עם AuNRs יכול לסלול את הדרך לשלוט על שחרור לפי דרישה של המטען בדור הבא של polybubbles.
יישומים בעלי משמעות ועתידיים
התוצאות שהתקבלו ממחקר זה ובכך מראה כי polybubbles יש את הפוטנציאל לשמש כפלטפורמה משלוח חיסון חדשני. הכנת polybubbles המתואר במאמר זה תאפשר עוד יותר חוקרים אחרים להשתמש polybubbles כפלטפורמת משלוח עבור יישומים טיפוליים אחרים. לדוגמה, בנוסף לאספקת חיסון, polybubbles יכול לשמש גם פוטנציאל לאספקת סוכנים טיפוליים סינרגטיים עם קינטיקה שחרור משתנה. יתר על כן, polybubbles עשויים פוליאסטר כי הם מתכלים שימשו במכשירים רפואיים רבים שאושרו על ידי ה-FDA. אנו גם אימתנו את הבטיחות של polybubbles על ידי מראה כי כלור שוחרר polybubbles הם גם בתוך רמות הבטיחות המומלצות על ידי המשרד לאיכותהסביבה 17. לכן, הפלטפורמה שלנו, polybubble חדשני, להזרקה, UV-curable יש פוטנציאל לשמש כפלטפורמה בטוחה ויעילה אספקת סמים עבור מגוון רחב של סוגי מטען.
מגבלות של טכנולוגיה זו
טכנולוגיית פלטפורמת polybubble יכולה לשמש כפלטפורמת אספקת חיסונים המאפשרת שחרור מבוקר. המחקרים שלנו מדגישים את הרב-תכליתיות של פלטפורמה זו המסוגלת לספק סוגי מטען שונים, כולל אנטיגנים ומולקולות קטנות. עם זאת, אחת המגבלות הנוכחיות של טכנולוגיה זו היא כי המטען הוא כרגע מוזרק באופן ידני. למטרות קנה מידה, אנו מהנדסים כיום פלטפורמה אוטומטית שתאפשר הזרקה (כלומר, כמערך) של מטען בתוך polybubble ועשויה לעזור להקל על החששות לגבי תרגום של טכנולוגיה זו.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
לסופרים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
ברצוננו להודות ד"ר בריאן א. טומלין המזוהה עם מעבדת ניתוח יסודי בתוך המחלקה לכימיה ב TAMU שסייע עם ניתוח ההפעלה ניוטרונים (NAA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Step Ultra Tetramethylbezidine (TMB)-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Substrate Solution | Thermo scientific | 34028 | |
| 2-Hydroxy-2-methylpropiophenone | TCI AMERICA | H0991 | |
| 450 nm Stop Solution for TMB Substrate | Abcam | ab17152 | |
| Acryloyl chloride | Sigma Aldrich | A24109-100G | |
| Acriflavine | Chem-Impex International | 22916 | |
| Anhydrous ethyl ether | Fisher Chemical | E138-500 | |
| Anti-HIV1 gp120 antibody conjugated to horseradish peroxidase (HRP) | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher BioReagents | BP9700100 | |
| BSA-CF488 dye conjugates | Invitrogen | A13100 | |
| Bromosalicylic acid | Acros Organics | AC162142500 | |
| Carboxymethylcellulose (CMC) | Millipore Sigma | 80502-040 | |
| Centrimonium bromide (CTAB) | MP Biomedicals | ICN19400480 | |
| Chloroform | Fisher Chemical | C2984 | |
| Coating buffer | Abcam | ab210899 | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma Aldrich | 270997-1L | |
| Diethyl ether | Fisher Chemical | E1384 | |
| Dodeacyl Amine | Acros Organics | AC117665000 | |
| Doxorubicin hydrochloride | Fisher BioReagents | BP251610 | |
| L-ascorbic acid | Acros Organics | A61 100 | |
| Legato 100 Syringe Pump | KD Scientific | 14 831 212 | |
| mPEG thiol | Laysan Bio | NC0702454 | |
| Nonfat dry milk | Andwin Scientific | NC9022655 | |
| Potassium carbonate | Acros Organics | AC424081000 | |
| Phosphate saline buffer | Fisher BioReagents | BP3991 | |
| (Poly(caprolactone) | Sigma Aldrich | 440744-250G | |
| (Poly(caprolactone) triol | Acros Organics | AC190730250 | |
| Poly (lactic-co-glycolic acid) diacrylate | CMTec | 280050 | |
| Potassium carbonate | Acros Organics | AC424081000 | |
| Recombinant HIV1 gp120 + gp41 protein | Abcam | ab49054 | |
| Silver nitrate | Acros Organics | S181 25 | |
| Sodium borohydride | Fisher Chemical | S678 10 | |
| Tetrachloroauric acid | Fisher Chemical | G54 1 | |
| Trehalose | Acros Organics | NC9022655 | |
| Triethyl amine | Acros Organics | AC157910010 |
References
- World Health Organization. Global Immunization: Worldwide Disease Incidence. , Children's Hospital of Philadelphia. https://www.chop.edu/centers-programs/vaccine-education-center/global-immunization/diseases-and-vaccines-world-view (2018).
- Paul, A., Bera, M., Gupta, P., Singh, N. D. P. o-Hydroxycinnamate for sequential photouncaging of two different functional groups and its application in releasing cosmeceuticals. Organic and Biomolecular Chemistry. 17 (33), 7689-7693 (2019).
- Kumari, A., Yadav, S. K., Yadav, S. C. Biodegradable polymeric nanoparticles based drug delivery systems. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 75 (1), 1-18 (2010).
- Dai, C., Wang, B., Zhao, H. Microencapsulation peptide and protein drugs delivery system. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces. 41 (2-3), 117-120 (2005).
- Souery, W. N., et al. Controlling and quantifying the stability of amino acid-based cargo within polymeric delivery systems. Journal of Control Release. 300, 102-113 (2019).
- Wang, W. Advanced protein formulations. Protein Science. 24 (7), 1031-1039 (2015).
- Lee, J., et al. An ultraviolet-curable, core-shell vaccine formed via phase separation. Journal of Biomedical Materials Research Part A. , (2019).
- Kittler, S., Hickey, S. G., Wolff, T., Eychmüller, A. Easy and Fast Phase Transfer of CTAB Stabilised Gold Nanoparticles from Water to Organic Phase. Zeitschrift für Physikalische Chemie. 229, 235 (2015).
- Soliman, M. G., Pelaz, B., Parak, W. J., del Pino, P. Phase Transfer and Polymer Coating Methods toward Improving the Stability of Metallic Nanoparticles for Biological Applications. Chemistry of Materials. 27 (3), 990-997 (2015).
- Arun Kumar, S., Good, J., Hendrix, D., Yoo, E., Kim, D., Deo, K. A., Jhan, Y. Y., Gaharwar, A. K., Bishop, C. J. Nanoengineered Light-Activatable Polybubbles for On?Demand Therapeutic Delivery. Adv. Funct. Mater. , 2003579 (2020).
- Wuthrich, P., Ng, S. Y., Fritzinger, B. K., Roskos, K. V., Heller, J. Pulsatile and delayed release of lysozyme from ointment-like poly(ortho esters). Journal of Controlled Release. 21 (1), 191-200 (1992).
- Wang, W. Instability, stabilization, and formulation of liquid protein pharmaceuticals. International Journal of Pharmaceutics. 185 (2), 129-188 (1999).
- Wong, D. Y., Hollister, S. J., Krebsbach, P. H., Nosrat, C. Poly(epsilon-caprolactone) and poly (L-lactic-co-glycolic acid) degradable polymer sponges attenuate astrocyte response and lesion growth in acute traumatic brain injury. Tissue Engineering. 13 (10), 2515-2523 (2007).
- Davoodi, P., et al. Drug delivery systems for programmed and on-demand release. Advanced Drug Delivery Reviews. 132, 104-138 (2018).
- Huang, Y. C., Lei, K. F., Liaw, J. W., Tsai, S. W. The influence of laser intensity activated plasmonic gold nanoparticle-generated photothermal effects on cellular morphology and viability: a real-time, long-term tracking and monitoring system. Photochemical and Photobiological Sciences. 18 (6), 1419-1429 (2019).
- Link, S., Burda, C., Nikoobakht, B., El-Sayed, M. A. Laser-Induced Shape Changes of Colloidal Gold Nanorods Using Femtosecond and Nanosecond Laser Pulses. The Journal of Physical Chemistry B. 104 (26), 6152-6163 (2000).
- U.S. Environmental Protection Agency. Chlorine. , https://www.epa.gov/sites/production/files/2016-09/documents/chlorine.pdf (2000).
