Summary
En este artículo se describen los protocolos utilizados para producir una nueva plataforma de administración de vacunas, "polybubbles", para permitir la liberación de ráfagas retrasadas. Se utilizaron poliésteres como poli(ácido láctico-co-glicólico) y policaprolactona para formar las poliburbujas y pequeñas moléculas y antígenos como carga.
Abstract
Las estrategias de administración de vacunas que pueden limitar la exposición de la carga a disolventes orgánicos al tiempo que permiten nuevos perfiles de liberación son cruciales para mejorar la cobertura de inmunización en todo el mundo. Aquí, se introduce una nueva plataforma inyectable, curable y retardada de liberación por ráfaga, que permite la administración de vacunas llamada polybubbles. La carga se inyectó en poliburbujas a base de poliéster que se formaron en una solución acuosa basada en carboximetilululosa al 10%. Este documento incluye protocolos para mantener la forma esférica de las poliburbujas y optimizar la colocación y retención de la carga para maximizar la cantidad de carga dentro de las poliburbujas. Para garantizar la seguridad, se analizó el contenido de disolvente clorado dentro de las poliburbujas mediante el análisis de activación de neutrones. Se realizaron estudios de liberación con moléculas pequeñas como carga dentro de la poliburbuja para confirmar la liberación tardía de ráfagas. Para mostrar aún más el potencial de entrega bajo demanda de la carga, los nanorods de oro se mezclaron dentro de la carcasa de polímero para permitir la activación del láser infrarrojo cercano.
Introduction
La cobertura limitada de inmunización da lugar a la muerte de 3 millones de personas causadas específicamente por enfermedades prevenibles mediantevacunas 1. Las condiciones inadecuadas de almacenamiento y transporte conducen al desperdicio de vacunas funcionales y, por lo tanto, contribuyen a reducir la inmunización mundial. Además, la vacunación incompleta debida a no adherirse a los calendarios de vacunas requeridos también provoca una cobertura vacunada limitada, específicamente en los países en desarrollo2. Se requieren varias visitas al personal médico dentro del período recomendado para recibir inyecciones de refuerzo, limitando así el porcentaje de población con vacunación completa. Por lo tanto, es necesario desarrollar nuevas estrategias para la administración controlada de vacunas a fin de eludir estos desafíos.
Los esfuerzos actuales para desarrollar tecnologías de administración de vacunas incluyen sistemas poliméricos basados en emulsiones3,,4. Sin embargo, la carga a menudo está expuesta a una mayor cantidad de disolvente orgánico que puede causar potencialmente agregación y desnaturalización, específicamente en el contexto de la carga basada enproteínas 5,,6. Hemos desarrollado una nueva plataforma de entrega de vacunas, "poliburbujas", que potencialmente puede albergar múltiples compartimentos de carga mientras minimiza el volumen de carga que está expuesto al disolvente7. Por ejemplo, en nuestra plataforma de poliburbujas de núcleo-shell, se inyecta un bolsillo de carga de diámetro 0,38 mm (SEM) en el centro de una poliburbuja de 1 mm. En este caso, la superficie de la carga expuesta al disolvente orgánico sería de aproximadamente 0,453 mm2. Después de considerar la densidad de embalaje de las esferas (micropartículas) dentro de una esfera (depósito de carga), el volumen real de micropartículas (10 m de diámetro) que podría caber en el depósito es de 0,17 mm3. El volumen de una micropartícula es de 5,24x10-8 mm3 y, por lo tanto, el número de micropartículas de partículas que pueden ajustarse al depósito es de 3,2x106 partículas. Si cada micropartícula tiene 20 bolsillos de carga (como resultado de la doble emulsión) de 0,25 m de diámetro, entonces la superficie de carga expuesta al disolvente orgánico es de 1274 mm2. Por lo tanto, el depósito de carga dentro de la poliburbuja tendría una superficie menos expuesta al disolvente orgánico en comparación con la de la carga orgánica expuesta a disolventes en micropartículas. Por lo tanto, nuestra plataforma a base de poliéster puede reducir potencialmente la cantidad de carga expuesta a disolvente orgánico que, de lo contrario, puede causar agregación de carga e inestabilidad.
Las poliburbujas se forman sobre la base del principio de separación de fase donde el poliéster en fase orgánica se inyecta en una solución acuosa que resulta en una burbuja esférica. La carga en la fase acuosa se puede inyectar en el centro de la poliburbuja. Otro compartimiento de carga se puede lograr potencialmente dentro de la poliburbuja mezclando una carga diferente con la cáscara de polímero. La poliburbuja en esta etapa será maleable y luego se curará para dar lugar a una estructura de poliburbuja sólida con carga en el medio. Se eligieron poliburbujas esféricas sobre otras formas geométricas para aumentar la capacidad de carga dentro de la poliburbuja, minimizando al mismo tiempo el tamaño total de la poliburbuja. Las poliburbujas con carga en el centro fueron elegidas para demostrar la liberación de ráfaga retrasada. Las poliburbujas también se incorporaron con un agente sensible al infrarrojo cercano (NIR), es decir, habilitador de la teología, a saber, nanorods de oro (AuNR), para provocar un aumento de la temperatura de las poliburbujas. Este efecto podría facilitar potencialmente una degradación más rápida y podría utilizarse para controlar la cinética en futuras aplicaciones. En este documento, describimos nuestro enfoque para formar y caracterizar poliburbujas, para lograr la liberación de ráfagas retrasadas de las poliburbujas, e incorporar AuNR dentro de las poliburbujas para causar la activación de NIR.
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Protocol
1. Síntesis de triacrilato de policaprolacilana (PCLTA)
- Secar 3,2 ml de triol de policaprolacyona (PCL) de 400 Da durante la noche a 50oC en un matraz inferior redondo abierto de 200 ml y K2CO3 en un vial de vidrio a 90oC.
- Mezclar el triol con 6,4 ml de diclorometano (DCM) y 4,246 g de carbonato de potasio (K2CO3)bajo argón.
- Mezclar 2,72 ml de cloruro de acriloilo en 27,2 ml de DCM y añadir gota a la mezcla de reacción en el matraz durante 5 min.
- Cubra la mezcla de reacción con papel de aluminio y déjela intacta a temperatura ambiente durante 24 horas bajo argón.
- Después de 24 h, filtre la mezcla de reacción con un papel de filtro en un embudo Buchner al vacío para descartar el exceso de reactivos.
- Prefría el filtrado del paso 1.5 que contiene el polímero endcapped en éter dietílico en un 1:3 (vol/vol) y rotovape a 30oC para eliminar el éter dietílico.
2. Formación de la poliburbuja
NOTA: La inyección de polímero en el agua desionizada (DI) haría que las poliburbujas migraran a la parte inferior del vial, lo que resultaría en un fondo aplanado. Utilice 10% (wt/vol) carboximetilcelulosa (CMC) llenar el vial de vidrio en su lugar para evitar el aplanamiento de la poliburbuja.
- Preparar una solución de CMC al 10% (wt/vol) en agua DI.
- Llene un vial de vidrio de 0,92 ml con 0,8 ml de 10% CMC utilizando una pipeta de transferencia de 1 ml.
- Mezclar 1000 mg/ml de 14 kDa PCL en DCM y sintetizar PCLTA en un 1:3 (vol/vol) para un volumen total de 200 l o preparar 200 l de 1000 mg/ml de 5 kDa de poli (ácido láctico-co-glicólico) diacrilato (PLGADA) en cloroformo.
- Mezclar la 2-hidroxi-4o-(2-hidroxitoxi)-2-metilpropiofenona (fotoiniciador) con la mezcla de polímero (PLGADA o PCL/PCLTA) en 0.005:1 (vol/vol).
- Cargue 200 l de mezcla de polímeros en una jeringa de vidrio de 1 ml montada en una bomba de jeringa que esté conectada a un tubo de acero inoxidable dispensador con un diámetro interior de 0,016 pulgadas.
- Utilice un micromotor para controlar el movimiento hacia adelante y hacia atrás del tubo de polímero para inyectar polímero en el 10% CMC en el vial de vidrio para formar la poliburbuja.
- Curar las poliburbujas bajo ultravioleta (UV) a 254 nm longitud de onda durante 60 s a 2 W/cm2.
- Congelar flash las poliburbujas en nitrógeno líquido y liofilizar durante la noche a 0,010 mBar vacío y a -85 oC.
- Separe las poliburbujas del CMC seco usando fórceps y lave las poliburbujas con agua DI para eliminar cualquier CMC residual. Tenga en cuenta que es probable que se utilicen otros polímeros con modificaciones para alterar la cinética de liberación.
3. Modulación del diámetro de la poliburbuja
- Llene un vial de vidrio de 0,92 ml con 10% CMC utilizando una pipeta de transferencia de 1 ml.
- Mezclar PCL/PCLTA en un 1:3 (vol/vol) con 1000mg/mL 14kDa PCL y sintetizar PCLTA. Mezclar el fotoiniciador con la mezcla de polímeros en un 0.005:1 (vol/vol).
- Cargue la mezcla de polímeros en una jeringa de vidrio de 1 ml montada en una bomba de jeringa que esté conectada a un tubo de acero inoxidable dispensador con un diámetro interior de 0,016 pulgadas.
- Utilice un micromotor para controlar el movimiento hacia adelante y hacia atrás del tubo de polímero para inyectar polímero en el 10% CMC en el vial de vidrio para formar la poliburbuja.
- Para obtener poliburbujas con varios diámetros, varíe la tasa de dosificación de 0.0005 a 1 l/s.
- Tome imágenes del vial con las poliburbujas con diámetro variable.
- Utilice ImageJ para cuantificar el diámetro de las poliburbujas y utilizar el tamaño del vial como escala.
4. Centrar la carga dentro de la poliburbuja
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Modulación de la viscosidad PCL/PCLTA utilizando K2CO3:
NOTA: La viscosidad de PLGADA no tiene que modificarse utilizando K2CO3 porque la viscosidad de 5 kDa PLAGDA a 1000 mg/ml es suficiente para centrar la carga.- Añadir K2CO3 (que se aisló después de la reacción PCLTA) a la PCLTA en diferentes concentraciones, incluyendo 0 mg/ml, 10 mg/ml, 20 mg/ml, 40 mg/ml y 60 mg/ml.
- Mida las viscosidades dinámicas de las soluciones cambiando la velocidad de cizallamiento de 0 a 1000 1/s utilizando la reometría.
- Inyectar manualmente la carga en el medio (consulte el paso 4.2 para preparar la mezcla de carga) de las poliburbujas que se formaron utilizando las soluciones PCL/PCLTA con diferentes concentraciones de K2CO3 (paso 4.1.1). Determinar la concentración óptima de K2CO3 observando qué solución del paso 4.1.1 puede resultar en la retención de la carga en el medio.
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Centrado de la carga (ya se muestra viabilidad con moléculas pequeñas) con CMC
- Mezclar la carga con 5% (wt/vol) CMC en un rotador durante la noche para aumentar la viscosidad de la carga.
- Inyectar manualmente 2 l de mezcla de carga en la poliburbuja y proceder con el curado UV a 254 nm de longitud de onda durante 60 s a 2 W/cm2.
- Congelar flash las poliburbujas en nitrógeno líquido durante 30 s y liofilizar durante la noche a 0,010 mBar vacío y a -85 oC.
- Separe las poliburbujas del CMC seco usando fórceps y lave con agua DI para eliminar cualquier CMC residual.
- Corte la poliburbuja por la mitad e imagine las mitades usando microscopía confocal para asegurarse de que la carga está centrada (consulte el paso 6 para las longitudes de onda de excitación y emisión utilizadas).
5. Formulación de carga
NOTA: La formulación de poliburbujas puede albergar varios tipos de carga, incluyendo moléculas pequeñas, proteínas y ácidos nucleicos.
- Sobre la base de estudios anteriores, en el caso de la carga proteica, utilizar excipientes incluyendo polietilenglicol (PEG)6,polivinilpirrolidona (PVP), y glucopolímeros6 para mejorar la estabilidad de la proteína durante la formulación de poliburbuja.
- Forme poliburbujas basadas en el protocolo del paso 2.
- Preparar la solución de antígeno añadiendo 17,11 g de trehalosa a 625 l de antígeno VIH gp120/41.
- Inyecte manualmente 1 ml de solución de antígeno en el centro de la poliburbuja.
- Abra las poliburbujas en los días 0, 7, 14 y 21, y registre la fluorescencia del antígeno con longitudes de onda de excitación y emisión 497 nm y 520 nm, respectivamente.
- Determinar la funcionalidad del antígeno mediante un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) y utilizar 5% de leche sin grasa como tampón de bloqueo.
6. Liberación de carga
NOTA: La molécula o antígeno pequeño se puede utilizar como tipo de carga
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Molécula pequeña
- Incubar poliburbujas con acriflavina centrada en 400 l de solución salina tampón de fosfato (PBS) a 37 oC, 50 oC para poliburbujas PLGADA y a 37 oC, 50 oC, 70 oC para poliburbujas PCL/PCLTA.
NOTA: La razón por la que recomendamos probar las temperaturas por encima del cuerpo es a) simular la temperatura (50 oC) a la que alcanza la poliburbuja mientras se láser de las nanorods de oro (AuNRs) dentro de PCL y PLGA; y b) acelerar el proceso de degradación de LA PCL (50oC, 70oC). - En cada momento, recoja los sobrenadantes y sustitúyalo con 400 l de PBS fresco.
- Utilice un lector de placas para cuantificar las intensidades de fluorescencia en los sobrenadantes recogidos.
NOTA: Utilice ex/em de 416 nm/514 nm para acriflavine.
- Incubar poliburbujas con acriflavina centrada en 400 l de solución salina tampón de fosfato (PBS) a 37 oC, 50 oC para poliburbujas PLGADA y a 37 oC, 50 oC, 70 oC para poliburbujas PCL/PCLTA.
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Antígeno
- Incubar poliburbujas con suero de albúmina bovina centrada (BSA)-488 en 400 l de PBS a 37 oC, 50 oC para poliburbujas PLGADA y a 37 oC, 50 oC para las poliburbujas PCL/PCLTA.
- En cada momento, recoja los sobrenadantes y sustitúyalo con 400 l de PBS fresco.
- Utilice un lector de placas para cuantificar las intensidades de fluorescencia en los sobrenadantes recogidos. Utilice ex/em de 497 nm/520 nm para BSA-488.
NOTA: No se debe realizar un estudio de liberación a 70 oC para las poliburbujas PCL/PCLTA para evitar exponer el antígeno a temperaturas extremas.
7. Toxicidad
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Cuantificación del contenido de cloro en poliburbujas mediante el análisis de activación de neutrones (NAA)
- Utilice poliburbujas que fueron liofilizadas durante 2, 4, 6, 20 y 24 h para este estudio a 0,010 mBar vacío y a -85 oC.
- Mida 5-9 mg de poliburbujas y colóquelos en viales de irradiación LDPE.
- Prepare 1000 g/ml de solución de calibración de cloro de la solución de calibración rastreable del Instituto Nacional de Estándares y Tecnología (NIST).
- Utilice el reactor Triga de 1 megavatios para llevar a cabo irradiaciones de neutrones en cada muestra a una velocidad de fluencia de neutrones de 9,1 ×10 12 /cm2s para 600 s.
- Transfiera las poliburbujas a viales sin racionados.
- Utilice el detector HPGe para obtener espectros de rayos gamma durante 500 s después de intervalos de descomposición de 360 s.
- Utilice el software NAA de Canberra Industries para analizar los datos.
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Cuantificar el contenido de cloro liberado de las poliburbujas utilizando NAA
- Incubar poliburbujas que fueron liofilizadas durante la noche (a 0,010 mBar de vacío y a -85 oC) en 400 oC de PBS a 37 oC.
- Recoger los sobrenadantes en las semanas 1, 2 y 3 después de la incubación.
- Analice los sobrenadantes para el contenido de cloro utilizando NAA utilizando el mismo método descrito anteriormente en el paso 7.1.
8. AuNR Synthesis de Kittler, S., et al.8
- Preparar la solución de siembra de AuNR mezclando 250 l de ácido cloroáurico de 10 mM (HAuCl4), 7,5 ml de bromuro de cetrimonio de 100 mM (CTAB), y 600 l de 10 mM de borohidruro de sodio frío en hielo (NaBH4).
- Preparar la solución de crecimiento mezclando 40 ml de CTAB de 100 mM, 1,7 ml de 10 mM HAuCl4,250 ml de nitrato de plata (AgNO3)y 270 l de ácido ascórbico de 17,6 mg/ml a un tubo.
- Mezcle vigorosamente 420 ml de solución de semillas con la solución de crecimiento a 1200 rpm durante 1 min. A continuación, deje la mezcla intacta para reaccionar durante 16 h.
- Retire el exceso de reactivos de la mezcla centrifugando a 8000 × g durante 10 min y deseche el sobrenadante.
9. Hidrofobicización de AuNRs por Soliman, M.G., et al.9.
- Ajuste el pH de 1,5 ml de auNR sintetizados estabilizados por CTAB a 10 utilizando hidróxido de sodio de 1 mM (NaOH).
- Revuelva la solución con 0,1 ml de tiol PEG metilado de 0,3 mM (mPEG) a 400 rpm durante la noche.
- Mezclar LOS AUNR peginados con 0,4 M de dodecilamina (DDA) en cloroformo a 500 rpm durante 4 días.
- Pipetear la capa orgánica superior que contiene AuNRs hidrofbicizados y almacenar a 4 oC hasta su uso futuro.
10. Activación NIR de poliburbujas
- Mezclar la solución de polímero (PLGADA o PCL/PCLTA) con AuNRs hidrofbicizados en un 1:9 (vol/vol).
- Añadir fotoiniciador a la mezcla polímero-AuNR en un 0.005:1 (vol/vol).
- Forme poliburbujas inyectando la mezcla polímero-AuNR en un vial de vidrio de 0,92 ml con 10% cmC (wt/vol) (consulte el paso 2).
- Curar las poliburbujas a 254 nm longitud de onda durante 60 s a 2 W/cm2.
- Congelación repentina de nitrógeno líquido durante 30 s y liofilizar durante la noche a 0,010 mBar vacío y a -85 oC.
- Separe las poliburbujas secas con fórceps y lave con agua DI para eliminar cualquier CMC residual.
- Incubar las poliburbujas en 400 oL de PBS a 37 oC.
- Active las poliburbujas usando láser NIR de 801 nm a 8A durante 5 minutos cada lunes, miércoles y viernes.
- Tome imágenes infrarrojas (FLIR) con visión de futuro de la poliburbuja antes y después de la activación láser para obtener valores de temperatura.
- Calcule las diferencias de temperatura entre antes y después de la activación láser en función de los valores de temperatura de las imágenes FLIR.
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Representative Results
Las poliburbujas se caracterizaron ampliamente utilizando SEM y NAA. La carga se centró con éxito para dar lugar a una liberación de ráfaga retrasada. Las poliburbujas también se activaron con éxito con láser debido a la presencia de AuNRs dentro de las poliburbujas.
Caracterización de la poliburbuja
Las burbujas inyectadas en una solución acuosa sin CMC dieron lugar a una poliburbuja aplanada debido a su contacto con la parte inferior del vial de vidrio (Figura 1A,B). Se observó aplanamiento parcial cuando se utilizó una solución acuosa basada en CMC al 5% en lugar de agua DI (Figura 1C). Posteriormente, la solución acuosa basada en CMC al 10% en el vial de vidrio dio lugar a la suspensión de la burbuja de polibuja en la solución y, por lo tanto, al mantenimiento exitoso de la esfericidad de la poliburbuja (Figura 1D).
Centrado de la carga
La inyección de carga en la poliburbuja en ausencia de CMC dio lugar a fugas que no causaron retención de carga dentro de la poliburbuja (Figura 3). Para contrarrestar este desafío, se utilizaron dos enfoques: 1) la viscosidad de PCLTA se incrementó con éxito utilizando K2CO3 que se aisló después de endcapping PCL triol con triacrilato(Figura 2), y 2) la viscosidad de la carga se incrementó con éxito después de mezclar la carga con 5% CMC (Figura 3, Figura 4). La viscosidad de las poliburbujas PLGADA era suficiente para facilitar el centrado de la carga y, por lo tanto, no se modulaba utilizando K2CO3.
Funcionalidad del antígeno
El antígeno VIH gp120/41 se mezcló con y sin trehalosa antes de inyectarse en la poliburburera (Figura 5). Se observó que la eficacia de unión de anticuerpos al antígeno (llamado funcionalidad) con y sin trehalosa no tenía ninguna diferencia estadísticamente significativa.
Estudios de liberación sin activación láser
Se observaron liberaciones de ráfagas retrasadas en poliburbujas PLGADA con acriflavina a media en los días 19 y 5 para las poliburbujas incubadas a 37 oC(Figura 6A)y 50 oC(Figura 6B),respectivamente. También se observaron liberaciones de ráfagas retrasadas en poliburbujas PCL/PCLTA con acriflavina a mediados de los días 160 y 60 para las poliburbujas incubadas a 50 oC(Figura 7A) y 70 oC(Figura 7B),respectivamente. Estos estudios de liberación se llevaron a cabo en ausencia de AuNR activador por láser.
Activación láser in vitro de poliburbujas
Las poliburbujas con AuNR en el shell se activaron con éxito con láser varias veces en poliburbujas PLGADA (Figura 8A) y poliburbujas PCL/PCLTA (Figura 8B). Los cambios de temperatura con respecto a antes y después de la activación por láser fueron de 10 ± 1 oC y 5 ± 1 oC en poliburbujas PCL/PCLTA con mayor y menor concentración de AuNR en la cáscara, respectivamente. Los cambios de temperatura observados antes y después de la activación por láser fueron de 11 ± 2oC y 6 ± 1oC en poliburbujas PLGADA con mayor y menor concentración de AuNR en la cáscara, respectivamente.
Figura 1: Mantenimiento de la esfericidad de las poliburbujas. Imágenes SEM de (A) 14 kDa PCL/300 Da PCLTA flattened polybubble debido al contacto de poliburbuja con la parte inferior del vial de vidrio; (B) 14 kDa PCL/300 Da PCLTA poliburbujía de la parte superior que no estaba en contacto con el fondo de cristal; (C) la poliburbuja PCL/PCLTA con menor grado de aplanamiento cuando se inyecta en una solución de 5% CMC en comparación con la solución de agua DI, causando la formación de forma similar al hemisferio en el punto de contacto con el vial; (D) poliburbuja que no llegó a la parte inferior del vial de vidrio cuando se inyecta en una solución de 10% CMC, lo que permite mantener la forma esférica. Todas las barras de escala indicadas son de 500 m. Esta cifra ha sido modificada de Lee et al.7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Modulación de la viscosidad PCLTA. La concentración de K2CO3 se incrementó de 0 a 80 mg/ml en PCLTA y se observó que la viscosidad dinámica aumentaba proporcionalmente con la concentración de K2CO3. Esta figura ha sido modificada de Arun Kumar et al10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Inyección de carga en la poliburbuja con y sin CMC. El panel superior muestra fotogramas extraídos del vídeo de fugas de carga durante la inyección en ausencia de CMC. El panel inferior muestra fotogramas extraídos del vídeo de retención de carga dentro de la poliburbuja en presencia de 5% CMC. Esta cifra ha sido modificada de Lee et al.7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Carga centrada. Imágenes fluorescentes del microscopio fluorescente de (A) poliburbuja PCL/PCLTA con carga centrada, (B) poliburbuja PCL/PCLTA con carga en la cáscara y tinte no fluorescente centrado. Esta figura ha sido modificada de Arun Kumar et al10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Funcionalidad del antígeno con trehalosa. La funcionalidad del VIH gp120/41 con y sin trehalosa dentro de la poliburbuja se analizó utilizando ELISA. La eficiencia de unión de un anticuerpo a la proteína se considera generalmente como un indicador de la funcionalidad de la proteína. Cuando discutimos la funcionalidad del antígeno en este estudio, pretendemos que signifique que ayuda a los anticuerpos que unen la proteína de interés (que es un indicador de la funcionalidad de las proteínas). No se observó significación estadística entre los dos grupos. Los intervalos de confianza se indican mediante líneas sólidas y punteadas. Esta cifra ha sido modificada de Lee et al.7. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Liberación de ráfaga retrasada de poliburbujas PLGADA. Estudios de liberación que muestran liberaciones de ráfagas retrasadas de poliburbujas PLGADA con acriflavina en el medio a (A) 37 oC, (B) 50 oC. La línea sólida indica la curva ajustada obtenida en función de los puntos de datos. Esta figura ha sido modificada de Arun Kumar et al10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Liberación de ráfaga retrasada de poliburbujas PCL/PCLTA. Estudios de liberación que muestran liberaciones de ráfagas retrasadas de poliburbujas PCL/PCLTA con acriflavina en el medio a (A) 50 oC, (B) 70 oC. Esta figura ha sido modificada de Arun Kumar et al10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8: Activación láser NIR de poliburbujas. Cambio de temperatura observado antes y después de la activación láser NIR en(A) poliburbujas PLGADA,( B) poliburbujas PCL/PCLTA con mayor y menor concentración de AuNR en la cáscara del polímero. Este aumento de la temperatura podría ser aprovechado para acelerar potencialmente la degradación del polímero que conduce a la liberación más temprana de la carga. Esta figura ha sido modificada de Arun Kumar et al10. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Tecnologías y desafíos actuales
Las micropartículas y nanopartículas a base de emulsión se han utilizado comúnmente como portadores de administración de fármacos. Aunque la cinética de liberación de la carga de estos dispositivos ha sido ampliamente estudiada, el control de la cinética de liberación de ráfagas ha sido un desafío importante11. La versatilidad y funcionalidad de la carga también está limitada en sistemas basados en emulsiones debido a la exposición de la carga a disolventes acuosos y orgánicos en exceso. La carga a base de proteínas a menudo no es compatible con micro y nanopartículas debido a la posibilidad de desnaturalización y agregación de carga12. Además de la estabilidad de la carga, la cinética de carga es especialmente importante en el contexto de las vacunas debido a la necesidad de inyecciones de refuerzo que conducen a la seroconversión. Los esfuerzos anteriores para hacer frente a estos desafíos en la administración de vacunas no han tenido el éxito suficiente, ya que la noción de sistemas de vacunas de inyección única ha existido durante un par de décadas y aún no se ha traducido clínicamente.
Nuestra plataforma de administración de vacunas de poliburbuja puede superar potencialmente los desafíos con una mayor exposición de la carga al disolvente orgánico al minimizar el volumen de carga expuesto. Esta tecnología puede acomodar potencialmente al menos dos compartimentos de carga: carga en la carcasa y carga en el centro. Las poliburbujas con carga centrada se pueden utilizar para controlar la liberación de ráfagas de la carga, siendo compatibles con diferentes tipos de carga, incluidas moléculas pequeñas y antígenos. En este estudio, utilizamos poliésteres con diferentes tiempos de degradación, PLGADA (tiempo de degradación más corto) y PCL/PCLTA (tiempo de degradación más largo), como los portadores de polímeros y acriflavina (molécula pequeña) como el tipo de carga para demostrar la liberación de ráfaga retrasada. En las secciones siguientes se describen los pasos cruciales para formar poliburbujas que son capaces de habilitar tanto la liberación de ráfaga retrasada como la activación de NIR, especialmente para futuras aplicaciones de entrega bajo demanda.
Centrado de carga dentro de la poliburbuja
El centrado de la carga fue uno de los desafíos significativos que se encontró durante la formulación de las poliburbujas. Inmediatamente después de la inyección, la carga migraría a la superficie y el bolsillo de la carga se estabilizaría sin estallar en la solución acuosa de 10% CMC. Las poliburbujas con dicha carga descentró pueden dar lugar a una liberación anterior debido al espesor no uniforme del polímero que rodea la carga. La modulación de la viscosidad del polímero y la carga fue por lo tanto crucial para resolver cuestiones relacionadas con el centrado de la carga. La viscosidad de la carga se incrementó mezclando la solución de carga con 5% CMC. Para aumentar la viscosidad del polímero, el peso molecular del polímero podría haber sido modificado. Sin embargo, el aumento del peso molecular a menudo resulta en una degradación más lenta de los polímeros, lo que provoca un mayor retraso en la liberación de la carga. La viscosidad del polímero se modificó así aumentando la concentración del polímero. Una concentración más alta (1000 mg/ml) fue suficiente para aumentar la viscosidad de PLGADA. Sin embargo, la viscosidad de PCL/PCLTA no era adecuada para retener la carga en el medio. Por lo tanto, K2CO3 que se aisló después de la reacción de finalización de PCLTA se utilizó para aumentar la viscosidad de PCLTA.
Lanzamiento retrasado de novela
Se observó la liberación de ráfaga retrasada de los estudios de liberación realizados utilizando las poliburbujas con carga centrada. La molécula pequeña (acriflavina) se utilizó como carga centrada en las poliburbujas para estudiar el perfil de liberación. Se observaron perfiles de liberación únicos basados en el poliéster utilizado debido a la diferencia en el tiempo de degradación de los polímeros. La liberación de ráfaga se observó anteriormente en poliburbujas PLGADA en comparación con la de las poliburbujas PCL/PCLTA. La liberación temprana de carga se observó en poliburbujas PLGADA porque PLGA se degrada más rápido en comparación con PCL13. Tras una modulación exitosa de la cinética de liberación con dos tipos de poliésteres, queríamos diseñar la poliburbuja para permitir potencialmente la liberación bajo demanda de la carga.
Activación NIR de poliburbujas
La liberación bajo demanda de la carga con respecto al momento de las necesidades de los pacientes ha sido difícil de lograr utilizando las estrategias de entrega actuales14. Hipotetizamos que acelerar la liberación de carga bajo demanda podría ser posible acelerando la degradación del polímero mediante el uso de agentes sensibles a NIR (es decir, que permiten la teranostica). AuNRs han sido ampliamente estudiados por su capacidad para ser activados usando láser NIR que puede viajar unos pocos centímetros a través de la piel15. Así, los AuNR estabilizados por CTAB se prepararon sobre la base del protocolo de Kittler, S, et al. y fueron hidrofbicizados basándose en los métodos publicados por Solimon, M.G., et al. Las poliburbujas con AuNR hidrofbicizados en la cáscara fueron irradiadas con láser NIR en los puntos de tiempo deseados durante 5 minutos para observar el cambio de temperatura. Las temperaturas antes y después del láser se midieron en función de las imágenes FLIR. La cáscara de polímero curado ayudó a preservar la forma de los AuNR durante la activación láser, permitiendo así múltiples activaciones NIR de poliburbujas. Esta es una observación interesante porque en la literatura anterior, a menudo se ha sabido que los AuNRs pierden su forma similar a una varilla (crucial para la activación de NIR) debido a la activación láser16. La activación láser exitosa de las poliburbujas con AuNRs podría allanar el camino para controlar la liberación bajo demanda de la carga en la próxima generación de poliburbujas.
Importancia y aplicaciones futuras
Los resultados obtenidos de este estudio muestran así que las poliburbujas tienen el potencial de ser utilizadas como una nueva plataforma de administración de vacunas. La preparación de poliburbujas descrita en este documento permitirá además a otros investigadores utilizar las poliburbujas como plataforma de entrega para otras aplicaciones terapéuticas. Por ejemplo, además de la administración de vacunas, las poliburbujas también se pueden utilizar potencialmente para administrar agentes terapéuticos sinérgicos con cinética de liberación variable. Además, las poliburbujas están hechas de poliésteres que son biodegradables y se han utilizado en muchos dispositivos médicos aprobados por la FDA. Además, validamos la seguridad de las poliburbujas al demostrar que el cloro liberado de las poliburbujas está dentro de los niveles de seguridad recomendados por la EPA17. Por lo tanto, nuestra novedosa plataforma de poliburbujas inyectable y curable por UV tiene el potencial de ser utilizada como una plataforma de entrega de medicamentos segura y eficaz para una variedad de tipos de carga.
Limitaciones de esta tecnología
La tecnología de la plataforma de poliburbujas se puede utilizar como una plataforma de administración de vacunas que potencialmente permite la liberación controlada. Nuestros estudios destacan la versatilidad de esta plataforma capaz de entregar diferentes tipos de carga, incluyendo antígenos y moléculas pequeñas. Sin embargo, una de las limitaciones actuales de esta tecnología es que la carga se está inyectando manualmente. Para fines de escalado, actualmente estamos diseñando una plataforma automatizada que permitirá la inyección (es decir, como una matriz) de carga dentro de la poliburbuja y potencialmente ayudará a aliviar las preocupaciones con respecto a la traducibilidad de esta tecnología.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Nos gustaría dar las gracias al Dr. Bryan E. Tomlin afiliado al laboratorio de análisis elemental dentro del departamento de química de TAMU que ayudó con el análisis de activación de neutrones (NAA).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-Step Ultra Tetramethylbezidine (TMB)-Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) Substrate Solution | Thermo scientific | 34028 | |
| 2-Hydroxy-2-methylpropiophenone | TCI AMERICA | H0991 | |
| 450 nm Stop Solution for TMB Substrate | Abcam | ab17152 | |
| Acryloyl chloride | Sigma Aldrich | A24109-100G | |
| Acriflavine | Chem-Impex International | 22916 | |
| Anhydrous ethyl ether | Fisher Chemical | E138-500 | |
| Anti-HIV1 gp120 antibody conjugated to horseradish peroxidase (HRP) | |||
| Bovine serum albumin (BSA) | Fisher BioReagents | BP9700100 | |
| BSA-CF488 dye conjugates | Invitrogen | A13100 | |
| Bromosalicylic acid | Acros Organics | AC162142500 | |
| Carboxymethylcellulose (CMC) | Millipore Sigma | 80502-040 | |
| Centrimonium bromide (CTAB) | MP Biomedicals | ICN19400480 | |
| Chloroform | Fisher Chemical | C2984 | |
| Coating buffer | Abcam | ab210899 | |
| Dichloromethane (DCM) | Sigma Aldrich | 270997-1L | |
| Diethyl ether | Fisher Chemical | E1384 | |
| Dodeacyl Amine | Acros Organics | AC117665000 | |
| Doxorubicin hydrochloride | Fisher BioReagents | BP251610 | |
| L-ascorbic acid | Acros Organics | A61 100 | |
| Legato 100 Syringe Pump | KD Scientific | 14 831 212 | |
| mPEG thiol | Laysan Bio | NC0702454 | |
| Nonfat dry milk | Andwin Scientific | NC9022655 | |
| Potassium carbonate | Acros Organics | AC424081000 | |
| Phosphate saline buffer | Fisher BioReagents | BP3991 | |
| (Poly(caprolactone) | Sigma Aldrich | 440744-250G | |
| (Poly(caprolactone) triol | Acros Organics | AC190730250 | |
| Poly (lactic-co-glycolic acid) diacrylate | CMTec | 280050 | |
| Potassium carbonate | Acros Organics | AC424081000 | |
| Recombinant HIV1 gp120 + gp41 protein | Abcam | ab49054 | |
| Silver nitrate | Acros Organics | S181 25 | |
| Sodium borohydride | Fisher Chemical | S678 10 | |
| Tetrachloroauric acid | Fisher Chemical | G54 1 | |
| Trehalose | Acros Organics | NC9022655 | |
| Triethyl amine | Acros Organics | AC157910010 |
References
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