Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

تنقية وتحليل Caenorhabditis elegans خارج الخلية الحويصلات

Published: March 31, 2020 doi: 10.3791/60596
Automatic Translation
1, 1, 1, 1, 1
1Department of Pathology, University of Washington

Summary

تعرض هذه المقالة أساليب لتوليد وتنقية وقياس الحويصلات Caenorhabditis elegans خارج الخلية.

Abstract

إفراز الحويصلات الصغيرة المرتبطة بالغشاء في البيئة الخارجية هو عملية فسيولوجية أساسية لجميع الخلايا. تعمل هذه الحويصلات خارج الخلية (EVs) خارج الخلية لتنظيم العمليات الفسيولوجية العالمية عن طريق نقل البروتينات والأحماض النووية والأيض والدهون بين الأنسجة. تعكس المركبات الإلكترونية الحالة الفسيولوجية لخلايا المنشأ الخاصة بها. والمركبات الكهربائية متورطة في أن لها أدواراً أساسية في كل جانب من جوانب صحة الإنسان تقريباً. وهكذا، يتم تحليل بروتين EV والشحنات الوراثية بشكل متزايد للعلامات الحيوية للصحة والمرض. ومع ذلك، لا يزال حقل EV يفتقر إلى نظام نموذج لافقاري قابل للمسار يسمح بدراسة تكوين البضائع EV. C. elegans مناسبة تماما لأبحاث EV لأنه يفرز بنشاط المركبات الكهربائية خارج جسمها في بيئتها الخارجية، مما يسمح العزلة سهلة. توفر هذه المقالة جميع المعلومات اللازمة لتوليد وتنقية وقياس هذه المركبات الكهربائية C. elegans التي تفرزها البيئة بما في ذلك كيفية العمل كميًا مع مجموعات كبيرة جدًا من الديدان المتزامنة مع العمر ، وتنقية المركبات الكهربائية ، وبروتوكول قياس الخلايا التدفقي الذي يقيس مباشرة عدد المركبات الكهربائية السليمة في العينة المنقىة. وهكذا، يمكن استغلال المكتبة الكبيرة من الكواشف الوراثية المتاحة لبحوث C. elegans للتحقيق في آثار المسارات الجينية والعمليات الفسيولوجية على تكوين البضائع EV.

Introduction

إفراز الحويصلات خارج الخلية المرتبطة بالغشاء (EVs) يسهل العمليات الفسيولوجية العالمية من خلال نقل بروتين معين وحمض نوي ومستقلب وشحنات من الدهون بين الخلايا1بنشاط. تفرز الخلايا EVs التي تمتد سلسلة متصلة من الأحجام تتراوح بين 2 ميكرومتر أو أكبر إلى صغيرة مثل 20 نانومتر2. تتم دراسة المركبات الكهربائية الصغيرة (<200 نانومتر) بشكل متزايد بسبب تأثيرها في العمليات المرضية ، بما في ذلك الاضطرابات الأيضية والسرطان وأمراض القلب والأوعية الدموية والأمراض العصبية3،4،5. وقد ثبت أيضا هذه الأمراض للتأثير على البروتين والتكوين الوراثي للمركبات الكهربائية الشحنات من المركبات الكهربائية الصغيرة. لذلك ، يتم الكشف بشكل متزايد عن توقيعات العلامات الحيوية للأمراض من خلال طرق اكتشاف البضائع EV مثل LC-MS-MS و RNAseq6و7و8و9.

C. elegans كان نموذجا غير فقاري مفيد لتحديد مسارات إشارات EV المحفوظة بشكل تطوري. على سبيل المثال، تم أول عرض لـ C. elegans flippase للحث على النشأة الحيوية EV في أجنة C. elegans، وأظهر أن التجانس البشري يؤثر على إطلاق EV في الخلايا البشرية10،11. C. elegans EVs تم الإبلاغ عن حمل إشارات القنفذ اللازمة لتطوير cuticle. وقد تبين تسليم القنفذ وغيرها من المورفوجين للعب دور تنموي رئيسي من السيارات الكهربائية، ويتم الحفاظ عليه في حمار وحشي، الفئران، والبشر12،13،14،15. C. elegans هو مناسبة تماما لاكتشاف المؤشرات الحيوية EV لأنه يفرز المركبات الكهربائية خارج جسمها التي تعمل في الاتصالات بين الحيوان والحيوان16،17 (الشكل 1A). ومع ذلك ، لا يمكن استخدام المنهجية التي تم تحديدها من خلال دراسة سابقة لأن مصدر الأغذية E. coli النيماتوديس يفرز أيضًا EVs18. في هذه الطريقة ، تتكون معظم العينة من تلوث الإشريكية القولونية ، مما يحد من قوة نهج البروتيوميات أو RNAseq لاكتشاف شحنات C. elegans EV. تم تطوير الأساليب الموصوفة هنا لإنتاج EVs C. elegans نقية للغاية عند مستويات الوفرة المميزة لتجارب ثقافة الخلايا النموذجية وبالتالي تسهيل نهج omics لاكتشاف المؤشرات الحيوية EV.

وهناك حاجة إلى أعداد كبيرة من الديدان لتوليد عدد كاف من المركبات الكهربائية لتحليل البضائع. ولذلك، فإن أساليب إجراء الزراعة الكمية لأعداد كبيرة من السكان المتزامنين من الناحية الإنمائية C. elegans مدرجة أيضا. عادة ، عندما تكون هناك حاجة إلى عدد كبير من الديدان للتجارب ، يتم استزراعها في وسائل الإعلام السائلة. في حين أن هذا فعال لتوليد أعداد كبيرة من الديدان ، فإن فسيولوجيا الحيوانات تختلف إلى حد كبير عن الديدان المزروعة في ظل الظروف القياسية على لوحات agar المتوسطة لنمو النيماتودا (NGM). الحيوانات المستزرعة في السائل تنمو ببطء أكبر، وأرق، وتظهر عدم التجانس التنموي، وتخضع لدرجة عالية من تقلب دفعة. لذلك ، نقدم وسيلة بسيطة ولكنها فعالة للزراعة الكمية لأعداد كبيرة من C. elegans المتزامنة تنمويًا باستخدام لوحات نمو عالية 10 سم. يتضمن التركيب الإعلامي للوحات النمو العالي المزيد من البُرَب من لوحات NGM العادية ويتم زرعها بسلالة الإشريكية القولونية NA22 التي تنمو بقوة أكبر من OP50.

وقد مكنت أوجه التقدم في تكنولوجيا قياس الخلايا تدفق (FACS) التحليل المباشر للمركبات الكهربائية الفردية20،21، مما يسمح بالقياس الكمي للمركبات الكهربائية دون القيود المتأصلة في أساليب أخرى. وقد أظهرت الأعمال السابقة أن البروتين ليس وكيلا مفيدا لوفرة EV لأن منهجيات تنقية مختلفة تؤدي إلى نسب EV إلى البروتين مختلفة بشكل ملحوظ22. تحتوي كسور EV النقية للغاية على بروتين قليل نسبيًا ، مما يجعل من الصعب قياس العينات باستخدام BCA أو المواد الهلامية Coomassie. يمكن للتحليل الغربي تحديد الاختلافات النسبية للبروتينات الفردية ولكن لا يمكن تحديد عدد المركبات الكهربائية الموجودة في العينة. ويعوق التحديد الكمي القوي لعدد EV عن طريق تحليل تتبع الجسيمات النانوية نطاقه الضيق من الإشارة إلى الضوضاء، وعدم القدرة على التمييز بين المركبات الكهربائية والمجاميع الصلبة، وعدم إمكانية نقل الأساليب بين الأدوات ذات المواصفات المختلفة23. لذلك، تحتوي هذه المقالة أيضاً على إجراء قياس خلايا التدفق القابل للتعميم للتمييز وتحديد المركبات الكهربائية كمياً.

Protocol

1- التحضير

  1. أضف 2 غرام من الجيلاتين إلى 100 مل من dH2O والحرارة في الميكروويف حتى يبدأ في الغليان. ثم يحرك وندعه يبرد لمدة 20 دقيقة.
  2. تمرير الحل من خلال مرشح 0.22 ميكرون والاستغناء في أنابيب معقمة. علاج نصائح ماصة مع الجيلاتين مباشرة قبل استخدام عن طريق الأنابيب وطرد حل الجيلاتين. يمكن استخدام النصائح المعالجة إما على الفور أو تخزينها.
  3. قطع الغشاء من مرشح غطاء معقم.
  4. الرطب 20 سم مربع من 5 ميكرومتر نسيج شبكة النايلون ووضع حول الجزء العلوي من مرشح غطاء معقم. تأمينه مع عدة أشرطة مطاطية سميكة.
    تنبيه: فحص النسيج بعناية للتأكد من عدم وجود أي تجعد. هذه تجعل الفجوات الهوائية التي تعوق الشفط.

2. حساب أعداد كبيرة من الديدان(الشكل 1أ)

  1. دوامة وpipette 10 μL من تعليق دودة على غطاء لوحة زراعة دودة أو شريحة زجاجية. كرر هذه العملية 3x. سجل عدد الحيوانات في كل قطرة.
  2. ضبط تعليق الدودة إلى اثنين من الحيوانات لكل ميكرولتر.
  3. دوامة التعليق وpipette تسع قطرات (10 μL) على شريحة أو غطاء لوحة. عد يدويا عدد الحيوانات. سجل عدد الحيوانات في كل قطرة.
  4. حساب الخطأ المتوسط والقياسي للمتوسط (S.E.M.) كنسبة مئوية من كل مجموعة من الديدان.
  5. حساب العدد الإجمالي للحيوانات في كل مجموعة من السكان عن طريق تقسيم متوسط القيمة إلى 10 ميكرولتر ومن ثم ضرب على الحجم الإجمالي لتعليق الدودة في μL.

Figure 1
الشكل 1: لمحات عامة عن الإجراءات لتوليد والقياس الكمي وتنقية C. elegans EVs. (أ)التخطيطي لحساب أعداد كبيرة من الحيوانات. (ب)التخطيطي لتوليد الديدان لحصاد المركبات الكهربائية. (C)التخطيطي لتنقية السيارات الكهربائية من C. elegans supernatent. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

3. زراعة C. elegans لتنقية EV

  1. توليد عدد كبير من السكان متزامنة التنمية C. elegans. للقيام بذلك، اتبع الخطوات التالية.
    1. إضافة الحيوان واحد على 6 سم لوحة وسائل الإعلام النمو العادي. احتضان لمدة جيلين ومن ثم غسل الحيوانات على اثنين من لوحات متوسطة النمو عالية النمو.
    2. احتضان حتى الديدان قد استنفدت الطعام.
    3. تصفية الديدان L1 مع شبكة النايلون 5 ميكرون أعدت في الخطوة 1.4. ضع غطاء المسمار على الزجاجة المعقمة ، وابدأ الفراغ ، وصب الديدان على الفلتر. تمرير نفس حجم المتوسط عبر مجاميع الدودة على عامل التصفية.
    4. قياس الديدان وحساب العدد الإجمالي (انظر الخطوة 2). الجوع مؤخرا (<24 ح) الديدان نمت على لوحة نمو عالية تؤدي إلى حوالي 80،000 يرقات L1.
    5. اليرقات L1 الطرد المركزي في 2000 × ز لمدة 3 دقيقة. إعادة تعليق إلى ~ 100،000 الحيوانات لكل مل.
    6. مكان ~ 50،000 الحيوانات في لوحة النمو العالي. زراعة الحيوانات في 20 درجة مئوية حتى تكون من البالغين gravid (حوالي 72 ساعة).
    7. تبييض البالغين gravid بوسائل قياسية والسماح للأجنة يفقس في 10 مل من محلول S Basal مع 2.5 ميكروغرام / مل الكوليسترول.
    8. قياس يرقات L1 (انظر الخطوة 2) ثم إضافة 50،000 الديدان إلى كل لوحة نمو عالية.
    9. زراعة الأطباق عند درجة حرارة 20 درجة مئوية حتى تصبح الحيوانات شابة.
  2. إعداد C. elegans لجيل secretome.
    1. غسل الديدان من لوحات بإضافة 15 مل من M9 مع قمة معقمة مع 50 ميكروغرام / مل carbenicillin إلى كل لوحة نمو عالية. دع الأطباق المشبعة الجلوس لمدة 5 دقيقة. إزاحة الديدان عن طريق الدوران حول الحاجز حول اللوحة. تجنب sloshing. صب المخزن المؤقت من كل لوحة في أنبوب مخروطي 50 مل منفصلة. كرر خطوة الغسيل 2x أكثر لما مجموعه 45 مل من المخزن المؤقت لكل لوحة.
    2. السماح للديدان تسوية لمدة 15 دقيقة. Decant supernatant وإضافة 50 مل من العازلة M9 الطازجة إلى الأنبوب. كرر لما مجموعه 4x.
    3. تعويم الديدان على رأس 30٪ السكروز خطوة التدرج واسترداد الحيوانات في الحل القاعديS24.
      1. لفترة وجيزة إعادة تعليق الديدان في 15 مل من الجليد الباردة 100 mM NaCl، إضافة 15 مل من الجليد الباردة 60٪ السكروز، وعكس لخلط. مع ماصة زجاجية بلطف طبقة 5 مل من الجليد الباردة 100 mM NaCl على الجزء العلوي من خليط السكروز.
      2. وستركز أجهزة الطرد المركزي عند 500 1 × غرام لمدة 5 دقيقة، وستتركز الديدان عند الوصلة البينية بين الـ NaCl والسكروز.
      3. بلطف pipette من الحيوانات من واجهة في أنبوب مخروطي 50 مل جديدة. إضافة S الحل القاعدي إلى 50 مل. السماح للديدان لتسوية 5 دقيقة.
      4. Decant supernatant وإضافة جديدة 50 مل من الحل القاعديS. كرر هذا على الأقل 3x.
    4. تحديد عدد الديدان على النحو المبين في الخطوة 2.
    5. إعادة تعليق الديدان إلى كثافة واحدة لكل ميكرولتر مع محلول س القاعدي المعقم الذي يحتوي على 2.5 ميكروغرام/مل من الكوليسترول و50 ميكرومتر من كارببينسيلين.
    6. لإعداد العينة لتوليد secretome، إضافة ما يصل إلى 400 مل من التعليق إلى قارورة 2 L الحيرة أسفل المعقمة.
    7. ضع القوارير على الدوار الدائري في حاضنة 20 درجة مئوية عند 100 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة.

4. EV تنقية

  1. الحصاد والتجزئة
    1. إزالة قارورة 2L من الديدان من الحاضنة وبيليه الحيوانات في قوارير مخروطية 50 مل (500 × ز لمدة 2 دقيقة).
    2. صب supernatant من خلال مرشح فراغ 0.22 ميكرون لإزالة أي حطام الجسيمات.
      ملاحظة: عند هذه النقطة، يمكن تخزين supernatant التي تمت تصفيتها التي تحتوي على السروم والحويصلات عند -80 درجة مئوية.
    3. عد عدد الحيوانات كما هو موضح في الخطوة 2.
    4. تحديد جدوى الديدان عن طريق وضع قطرة من الديدان المعلقة على العشب البكتيري. انتظر لمدة 15 دقيقة ثم يسجل الحيوانات على أنها تتحرك أو مشلولة أو ميتة.
    5. تركيز 0.22 ميكرومتر تصفيتها supernatant إلى 700 μL باستخدام تجديد النيتروسيلولوز 10 وحدات تصفية كيلوه. إضافة 150 μL S S محلول القاعدية ومن ثم ماصة على مرشح ودوامة. كرر 2x.
    6. طرد مركزي supernatant المركزة في 18،000 × ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية ونقل supernatant إلى أنبوب جديد. هذه الخطوة يزيل أي حطام محتمل أو الجسيمات الكبيرة التي قد تراكمت أثناء المناولة.
    7. إضافة كوكتيل مثبطات البروتياز + EDTA لكل تعليمات الشركة المصنعة.
      ملاحظة: عند هذه النقطة يمكن تخزين supernatant المركزة التي تحتوي على secretome والحويصلات في -80 درجة مئوية.
  2. حجم اللوني الاستبعاد
    1. صب 80-200 ميكرون راتنج أروز (نطاق تقسيم حجم المسام من 70،000 إلى 40،000،000 كيلود للبروتينات الكروية) في خرطوشة عمود تدفق الجاذبية فارغة. تدفق S الحل القاعدي حتى يتم تعبئة سرير الراتنج في حجم النهائي من 10 مل.
      ملاحظة: إذا تم سكب الكثير من الراتنج في خرطوشة العمود، فقم بتفريق الجزء العلوي من العمود وإزالة الفائض باستخدام ماصة.
    2. تمرير 40 مل من حل S Basal المعقمة المصفاة من خلال العمود والسماح لها بالتدفق تحت الجاذبية.
      تنبيه: تأكد من عدم إزعاج الراتنج.
    3. دع تدفق المخزن المؤقت حتى لا يتم غمر الجزء العلوي من الراتنج ثم قم بغطاء الجزء السفلي من خرطوشة العمود. ضع أنبوب تجميع أسفل العمود.
    4. قم بإزالة الغطاء الموضوع على الخرطوشة. إضافة secretome المركزة التي تم الحصول عليها في الخطوة 2.1 dropwise إلى أعلى السرير العمود. Pipette 1 مل من S حل القاعدية dropwise. ضع أنبوب تجميع جديد تحت العمود.
    5. ملء ببطء خزان العمود العلوي مع 5 مل S المحلول القاعدي ة لعدم الإخلال الراتنج. جمع أول 2 مل من eluate ثم تغيير الأنابيب بسرعة وجمع المقبل 4 مل. هذا هو الكسر الذي يتم تخصيبه لـ EVs.
    6. تركيز الإلجيل إلى 300 ميكرولتر مع النيتروسيللوز المتجدد 10 كيلودا قطع الوزن الجزيئي (MWCO) مرشح ونقل retentate إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيقة منخفضة ملزمة.
    7. غسل غشاء مرشح 2x مع 100 ميكرولتر من المحلول القاعدي S عن طريق الدوامة لمدة 20 ق وpipetting المخزن المؤقت عبر مرشح. إضافة إلى العينة الأولية لحجم نهائي من 500 ميكرولتر.
    8. إضافة كوكتيل مثبطات البروتياز لكل تعليمات الشركة المصنعة.
    9. إجراء تجارب المصب على الفور (RNAseq، LC-MS-MS، GC-MS-MS، الغربية، FACS، الخ) أو تخزين في -80 درجة مئوية.

5. تدفق قياس الخلايا القياس الكمي من وفرة EV

  1. إعداد صبغ
    1. إعداد مخزون 10 mM من DI-8-ANEPPS باستخدام DMSO الطازجة. توزيع هاوية على 10 ميكرولتر وتخزينها عند -20 درجة مئوية.
    2. إعداد حل عمل 1 mM عن طريق إضافة 90 ميكرولتر من PBS المعقم ة المصفاة إلى أنبوب مع 10 ميكرولتر من مخزون الصبغة.
  2. إعداد عينة تجريبية
    1. أضف 840 ميكرولتر من محلول S Basal إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. ثم أضف 60 ميكرولتر من المركبات الكهربائية النقية المتولدة في القسم 4.2 والدوامة.
    2. Aliquot 300 ميكرولتر من العينة إلى أنبوبين جديدين للطرد المركزي الدقيق. وهناك الآن مجموعة تجريبية من ثلاثة أنابيب تحتوي على 300 ميكرولتر من المركبات الكهربائية المخففة لكل منها. تسمية الأنابيب #1-3. لعينات #2 #3 إضافة 7 ميكرولتر من المخزون DI-8-ANEPPS أعدت في 5.1.2. ثم إضافة 7 ميكرولتر من 1٪ تريتون-X 100 إلى أنبوب #3. اخلطي كل أنبوب عن طريق الدوامة.
    3. سونيكات عينة #3 عن طريق وضع طرف sonicator في منتصف العينة والنبض 10 مرات في 20٪ السلطة 30٪ دورة واجب.
      تنبيه: تأكد من أن غيض من مسبار سونيكاتور في منتصف العينة بحيث يتم الاحتفاظ بتوليد الرغوة إلى الحد الأدنى. قد الرغوة تعريض العينة للخطر عن طريق التسبب في المركبات الكهربائية لتجميع.
    4. أضف 300 ميكرولتر من محلول S Basal إلى أنبوبين للطرد المركزي الدقيق. إضافة 7 μL من الكاشف DI-8-ANNEPS العمل أعدت في الخطوة 5.1 إلى الأنبوب الثاني وتسمية "صبغ فقط". تسمية الأنبوب الآخر "المخزن المؤقت فقط".
      ملاحظة: إعداد عينات التحكم في الصبغة فقط والمخزن المؤقت فقط والعينات التجريبية بنفس المصدر القاعدي S.
    5. احتضان العينات بعيدا عن الضوء المباشر وفي درجة حرارة الغرفة لمدة 1 ساعة.
  3. إجراء تجارب FACS.
    1. تعيين مرشح الإثارة FACS إلى 488 نانومتر (الأزرق) ومرشح الانبعاثات إلى 605 نانومتر (برتقالي). تعيين معدل التدفق إلى 1.5 ميكرولتر لكل دقيقة.
    2. تشغيل nanobead FACS مزيج المعايرة (اختياري ولكن الموصى بها).
    3. تشغيل كل عينة على جهاز FACS لمدة 3 دقيقة (180 s). لاحظ أوقات التشغيل الدقيقة بالثواني.
  4. تحليل بيانات FACS.
    1. افتح الملفات باستخدام برنامج تحليل FACS.
    2. قم بتبديل المحور Y إلى 488-Org (المنطقة) بالنقر على المحور،وتحديد من القائمة المنسدلة.
    3. تعيين بوابة مستطيلة بدءا من الجزء العلوي من المؤامرة، وتمتد من مستوى SALS 102 إلى 104 (<300 نانومتر الحجم الجسيمات). قم بتمديد البوابة لأسفل حتى تحتوي على 2.5٪ من إجمالي الأحداث. اسم البوابة "DI-8-ANEPPS+" الأحداث.
  5. القياس الكمي لوفرة EV العينة
    1. نسخ هذه البوابة ولصقها على عينتين آخرين في المجموعة التجريبية الخاصة بك، فضلا عن المخزن المؤقت فقط وصبغ الضوابط فقط. تصدير التحليل إلى جدول بيانات.
    2. إذا لم يتم تشغيل عينات FACS للـ 3 دقيقة الموصى بها (180 s)، قم بتطبيع كافة أعداد الأحداث في العينة إلى الأحداث لكل 180 s. على سبيل المثال، إذا تم تشغيل عينة لـ 250 s، يتم تحجيم رقم الحدث DI-8-ANEPPS+ بمقدار 250 s/180 s.
    3. قم بإزالة أحداث خلفية الصبغة عن طريق طرح عدد أحداث DI-8-ANEPPS+ في عنصر التحكم في الصبغة فقط من تلك الموجودة في #2 العينة.
    4. إزالة أحداث الخلفية isotype عن طريق طرح عدد أحداث DI-8-ANEPPS+ في عينة #1.
    5. قم بإزالة الأحداث غير الحساسة للمنظفات عن طريق طرح عدد أحداث DI-8-ANEPPS+ في #3 العينة. هذه القيمة هي عدد السيارات الكهربائية الحسنة النية.
    6. حساب عدد المركبات الكهربائية في 1 ميكرولتر من العينة عن طريق تقسيم القيمة المحسوبة في الخطوة 5.5.5 على الحجم الذي تم تحليله بميكرولتر (4.5 ميكرولتر تم تحليلها على النحو المبين في الخطوة 5.3) والضرب بعامل التخفيف (10x كما هو موضح في الخطوة 2.5). ضرب هذه القيمة في عدد μL المتبقية في إعداد EV. هذا هو عدد المركبات الكهربائية المتاحة لتحليل المصب.

Figure 2
الشكل 2: التخطيطي لإعداد عينة قياس الخلايا المتدفقة لقياس وفرة EV. (أ)ينقسم إعداد EV إلى ثلاث عينات متطابقة. عينة # 1 هو عنصر التحكم السلبي لا صبغ. ثم يتم إضافة DI-8-ANEPPS إلى عينات #2 #3. ثم يتم إضافة تريتون-X 100 إلى عينة #3. يشير السهم الأخضر إلى أن العينة #3 فقط هي سونيكاتيد في وقت لاحق. تساعد البيانات المستمدة من التدفق على تحديد العدد المطلق للمركبات الكهربائية الحساسة للمنظفات في عينات FACS ثم تحسب وفرة المركبات الكهربائية في الإعداد الإجمالي. يتم تعيين بوابة لتحديد الأحداث إيجابية الصبغ مع عينة #1، والتي لا تحتوي على صبغة. الكتابة الحمراء على بيانات جدول البيانات هو لتوضيح أن الأحداث إيجابية الصبغة من العينة المعالجة بالمنظفات يتم طرحها من العينة مع صبغة. (ب)معادلات لقياس المركبات الكهربائية في عينة تحليل FACS وحساب العدد الإجمالي للمركبات الكهربائية في العينة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Representative Results

ويرد تخطيطي للعمليات اللازمة لتوليد وتنقية المركبات الكهربائية في الشكل 1. يتم عرض الأوقات النموذجية المطلوبة لإكمال كل خطوة أسفل. ويبين الشكل 2 تخطيطياً لإعداد عينات لتحليل نظام مراقبة الأصول الميدانية باستخدام DI-8-ANEPPS(الشكل 2A)وكذلك الحسابات اللازمة لتقدير العدد الإجمالي للمركبات الكهربائية في عينة(الشكل 2B).

وترد النتائج التمثيلية من 10 يكرر البيولوجية في الشكل 3ألف. التباين بين النسخ المتماثلة ليس كبيراً وS.E.M. النموذجي لحجم السكان هو ما يزيد قليلاً عن 10٪(الشكل 3B). تصفية الديدان وزراعة على لوحات النمو العالي الطازجة سوف تولد مجموعة كبيرة من البالغين gravid مناسبة لتزامن التبييض. لوحة واحدة جوعا معالجتها بهذه الطريقة يمكن أن تنتج مجموعة تجريبية من 1 × 106 أو أكثر من ذرية متزامنة لأن كل الكبار gravid سوف تحتوي على حوالي 10 بيضات. من الممكن الحفاظ على أعداد كبيرة من السكان المتزامنين تنمويًا عن طريق تصفية البيض واليرقات من خلال فلتر 40 ميكرومتر للحصول على المركبات الكهربائية من الحيوانات القديمة. يتم نقل البالغين المحتفظ بهم إلى لوحات نمو عالية جديدة بكثافة 20،000 الحيوانات لكل لوحة. وتكررت هذه العملية كل يومين. ويبين الشكل 3جيم ثلاث نسخ بيولوجية من مجموعات الديدان التي يجري نقلها عبر ثلاث عمليات نقل للألواح. يؤدي نقل الحيوانات بين اللوحات إلى فقدان الحيوانات بنسبة 10٪ تقريبًا(الشكل 3C)بينما يتم فقدان حوالي 20٪ من الحيوانات في خطوة تعويم السكروز(الشكل 3D).

Figure 3
الشكل 3: القياس الكمي لأعداد كبيرة من C. elegans لتحليل EV. (أ)مقارنة بين عدد الديدان مرحلة اليرقات L1 معزولة عن واحد يتضور جوعا مؤخرا (<24 ح) لوحة النمو العالي. يتم رسم قيم كل من النسخ المتماثلات البيولوجية 10. كما يتم تقديم تجميع جميع نقاط البيانات في النسخ المتماثلة العشرة كمؤامرة كمان وبار مع S.E.M. وهذا يدل على أن لوحة واحدة من الديدان جوعا مؤخرا سوف تسفر عن ~ 80،000 L1 اليرقات المرحلة الديدان المرحلة. (ب)S.E.M. من 15 قياسات مختلفة للسكان لوحة في لوحة A رسمت كنقاط فردية. بشكل عام، S.E.M. أكبر قليلاً من 10٪. (ج)تم تقدير ثلاث نسخ بيولوجية من مجموعات الديدان بعد كل نقلمن بين الصفائح كل 4 ساعات. ولم يسفر هذا النقل للحيوانات بين الصفائح عن انخفاض كبير في حجم السكان. وهذا يشير إلى أن المنهجية المعروضة هنا للديدان المتحركة لا تؤدي إلى خسارة كبيرة للحيوانات. (د)قياسات السكان التي اتخذت على طول مسار ثلاثة EV التجريبية يكرر: أعداد الحيوانات التي قدرت ليرقات L1 الأصلي الذي بدأ التجربة، وعدد الحيوانات البالغة الشباب تعافى من تعويم السكروز وجاهزة لفترة الحضانة 24 ح، وعدد الحيوانات التي تحسب من إعداد EV عند استرداد السروم. هناك انخفاض صغير ولكن ليس كبيرا في حجم السكان بين التقدير الأولي للسكان في مرحلة اليرقات L1 وبعد ذلك عندما تكون الحيوانات من الشباب البالغين. تم تعيين متوسط قياس السكان L1 على أنه 100٪ وتم قياس جميع القياسات الأخرى من خلال علاقتها بهذه القيمة. أشرطة الخطأ S.E.M. * = p قيمة < 0.05، N.S. = ليست كبيرة في اختبار t المقترنة parametric. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

نسبة البروتين إلى الحيوان هو مقياس مفيد لتوصيف إعداد EV. يمكن أن يوفر هذا المقياس وسيلة سريعة لتحديد الاتساق بين الاستعدادات EV. في المتوسط ، 1000 الحيوانات البرية من النوع البالغين الشباب سيفرز 1 ميكروغرام من البروتينات أكبر من 10 كيلو دا في بيئتها(الشكل 4ألف). عندما يتم فصل هذا الكسر كذلك من قبل الكروماتوغرافيا استبعاد حجم, ملف البروتين الكلي elution يظهر ذروة البروتين الصغيرة بين 2-6 مل وذروة كبيرة بعد 8 مل. وترد المركبات الكهربائية في أول 5 مل من eluate العمود(الشكل 4B). تحليل تتبع الجسيمات النانوية أول 5 مل من eluate العمود يحتوي على عدد أحادي التشتت من السيارات الصغيرة ، ~ 150 نانومتر(الشكل 4C). يكشف المجهر الإلكتروني للإرسال من كسور استبعاد الحجم عن مركبات EVs وفيرة في الجزء 2-6 مل من الإلجيل ولكن ليس في أحجام eluate اللاحقة. ومن المعروف EVs لشكلها مثل كوب، وبالتالي من السهل التمييز من الجسيمات الصلبة التي تظهر كنقاط مشرقة punctate عند إعدادها تحت ظروف تلطيخ سلبية(الشكل 4D).

Figure 4
الشكل 4: تنقية السيارات الكهربائية C. elegans من الكتلة الحيوية التفرز بالكامل. (أ)تم رسم نسبة البروتينات الإجمالية أكبر من 10 كيلودا إلى عدد الديدان المحتضنة في التحضير لـ 10 يكرر البيولوجية. وتحتوي معظم المستحضرات على ميكروغرام واحد من البروتين لكل 000 1 من الحيوانات. (ب)ملف تعريف اليويون البروتين يُعنى بعمود راتنج يُمَمَّم بـ 1 مل من السرايوم المركز. يتم وضع الأجزاء التي يتم دمجها في مزيد من التحليلات في مجموعات. (C)تحليل تتبع الجسيمات النانوية للكسرات الموحدة الراتنج توصف 2-6 مل. فترة الثقة 95% هي رمادية المعلّمة. (D)تحليل TEM للكسور الراتنج الموحدة. كان لدى مادة البداية جسيمات تشبه الحويصلات وجسيمات غير حوسية. تم إثراء الكسر الإلوطي الموحد الذي كان 2-6 مل للحويصل اتّذي بجزيئات قليلة غير الحويصلات. تحتوي الكسور الموحدة 7-11 مل على جزيئات قليلة تشبه الحويصلات ولكن العديد من الجسيمات غير الحويصلات. تحتوي الكسور الelution 12-15 مل فقط على جزيئات غير الحويصلات. يتم عرض جميع الميكروغرافيات في نفس التكبير. شريط مقياس = 200 نانومتر. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

لمقارنة مباشرة خصائص التدفق الخلوي بين C. elegans وEVs الإنسان، ونحن تنقية EVs من وسائل الإعلام مكيفة من الخلايا الثقافات من الخلايا العصبية البشرية مع هذا الأسلوب. ويفصل قياس الخلايا التدفق الجسيمات على أساس تشتت الضوء. يرتبط تشتت الضوء ذو الزاوية الصغيرة (SALS) تقريبًا بالحجم ، ويرتبط تشتت الضوء طويل الزاوية (LALS) ببنية الغشاء الداخلي. وتركز معظم الأحداث عينة مجموع من كل من ثقافة الخلية وC. elegans EV الاستعدادات بإحكام في مجموعة تركزت حول 103 SALS و 104 LALS(الشكل 5A). ويبين الرسم البياني لأحداث عينة C. elegans EV التي تم فرزها بواسطة SALS أن جميع الاستعدادات تصل إلى ذروتها عند ~ 103 (الشكل 5B).

Figure 5
الشكل 5: يتم تعريف C. elegans EVs بوضوح من خلال خصائصها تشتت الضوء. (أ)الرسم البياني لأحداث SALS في ثلاث نسخ بيولوجية من C. elegans EVs. ~ 80 ٪ من مجموع الأحداث عينة ترد داخل ضيق ، والسكان محددة بوضوح. على غرار تحليل تتبع الجسيمات النانوية ، فإنه يظهر أن توزيع حجم C. elegans EVs هو أحادي التشتت. يتم عرض الرسم البياني للمخزن المؤقت القاعدي S المستخدم لتخفيف العينات للمقارنة. (ب)مقارنة الخصائص الانكسارية لـ C. elegans وEVs ثقافة الخلايا البشرية المنقاة بالطرق الموضحة في هذا النص. كلا النوعين EV باستمرار عرض توزيعات التشتت ضوء قصيرة وطويلة الزاوية مماثلة (SALS و LALS). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

وDI-8-ANEPPS تسميات قوية C. elegans EVs، وتسليط الضوء باستمرار على غالبية من مجموع الأحداث في كل من Elegans C. وثقافة الخلية عينات مشتقة. يتم تقديم حبات المعايرة وعناصر التحكم في الشكل 6A. يتم عرض قطع الأراضي الفردية المتناثرة FACS من عينة C. elegans أعدت من 200،000 الحيوانات (#1) واثنين من أعدت من 500،000 الحيوانات(الشكل 6باء). كما تم تحليل المركبات الكهربائية من 100 مل (#1) أو 200 مل (#2،3) من ثقافة الخلية(الشكل 6C). وأظهرت كل من C. elegans وثقافة الخلايا عينات مشتقة الأحداث الفلورية وفيرة التي اختفت عند التعامل مع 0.05٪ تريتون X 100 وسونيكيشن الخفيفة. وهذا يدل على أن الأحداث المسماة هي هياكل فوسفوليبيد المنظفات (الحويصلات) بدلا من المنظفات غير الحساسة المجاميع البروتين الدهني الصلب. يتم حساب وفرة EV كالفرق بين عدد الأحداث في بوابة DI-8-ANEPPS+ بين الكسور بدون منظفات (-) ومع المنظفات (+) ناقص الأحداث في عنصر التحكم Dye فقط. وللوضوح، تُلخص البيانات المقدمة بشكل فردي في الشكل 6باء والشكل 6جيم كرسوم بيانية شريطية في الشكل 6دال والشكل 6هاء. وفرة من السيارات الكهربائية المنقى لم يكن مختلفا بشكل ملحوظ بين C. elegans وثقافة الخلية المستمدة الاستعدادات(الشكل 6واو).

Figure 6
الشكل 6: أمثلة على بيانات قياس الخلايا المتدفقة المستخدمة لحساب وفرة EV. (أ)لضمان أن عدد الأحداث يمكن مقارنته مباشرة بين العينات، يجب تشغيل عناصر التحكم المخزن المؤقت والصبغة فقط بنفس معدل التدفق ووقت التجميع مثل كسور عينة EV. هناك عدد قليل جدا من الأحداث في بوابة DI-8-ANEPPS. (ب)النتائج التمثيلية لDI-8-ANEPPS وبروتوكول معالجة المنظفات من C. elegans. وتظهر ثلاث يكرر البيولوجية. وقد تم إعداد #1 البيولوجية المتكررة من 000 200 من الحيوانات في حين تم إعداد #2 #3 من 000 500 من الحيوانات. اختفاء المركبات الكهربائية مع علاج المنظفات واضح في جميع الحالات. (C)النتائج التمثيلية لDI-8-ANEPPS وبروتوكول معالجة المنظفات باستخدام الوسائط المكيفة لثقافة الخلايا البشرية. تم إعداد اليكرر البيولوجي #1 #2 من 200 مل من الوسائط المكيفة بينما تم إعداد #3 التكرار البيولوجي من 100 مل. (D)شريط الرسم البياني للبيانات التي تم جمعها من النسخ البيولوجية الثلاث من السيارات الكهربائية C. elegans. أشرطة الخطأ = S.E.M. إقران اثنين من الذيل تي الاختبارات بين العلاجات. = قيمة p < 0.001. (E)شريط الرسم البياني للبيانات التي تم جمعها من النسخ البيولوجية الثلاثة من ثقافة الخلية المستمدة EVs. إقران اختبارات تي ذيلتين بين العلاجات. = قيمة p < 0.001(F)تم حساب عدد الأحداث الحساسة للمنظفات المسماة بالصبغة لكل ميكرولتر لجميع النسخ البيولوجية لـ C. elegans وثقافة الخلايا. القيم بين مصدري عينة EV لا تختلف بشكل ملحوظ. إقران اختبارات t ذيلين بين قيمة العلاجات p = 0.685. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يحتوي الجدول 1 على القيم التجريبية الخام للـ 4.5 ميكرولتر كاملة من كل نوع عينة تم تحليلها. كان العدد الإجمالي للأحداث التي تم جمعها من كسور EV المنقى من 500,000 الحيوانات 10-20x على عدد الخلفية من الجسيمات التي تم جمعها عن طريق المخزن المؤقت وحده في حين أن الكسر المنقى من 200,000 الحيوانات يحتوي على حوالي 2x كما العديد من الأحداث كما عازلة وحدها. كما يظهر عدد الأحداث داخل بوابة DI-8-ANEPPS+ لكل عينة. يمكن استيراد هذه المقاييس إلى جدول بيانات لحساب عدد المركبات الكهربائية الإيجابية للصبغة والمنظفات الحساسة كما هو موضح أعلاه. على سبيل المثال، سيتم حساب عدد المركبات الكهربائية في 1 مل من التكرار البيولوجي C. elegans المبين ة على هذا النحو:

(18,974 – 3,853 - 1,487) × (10/4.5) × 1,000 = 30,297,778.

الجدول 1: بيانات قياس الخلايا المتدفقة المجدولة. يتم تقديم البيانات المعروضة في الشكل 6 كجدول بيانات. لكل عينة يتم عرض إجمالي الأحداث والأحداث المسورة DI-8-ANEPPS+ . يتم ترتيب كل تكرار بيولوجي بترتيب العينات #1-3 في البروتوكول. تكشف هذه المقاييس أن العدد الإجمالي للأحداث التي تم جمعها من عينات C. elegans التي تم إعدادها من 500,000 الحيوانات أو 200 مل من الوسائط المكيفة في ثقافة الخلايا كان 10-20x على عدد الخلفية من الجسيمات التي تم جمعها عن طريق المخزن المؤقت وحده في حين أن التكرار البيولوجي المنقى من 200,000 الحيوانات يحتوي على حوالي 2xمثل العديد من الأحداث الإجمالية كعازل وحده. كما يظهر عدد الأحداث داخل بوابة DI-8-ANEPPS+ لكل عينة. يمكن تصدير هذه المقاييس إلى جدول بيانات لحساب العدد الإجمالي للمركبات الكهربائية. يرجى الضغط هنا لعرض هذا الجدول (انقر على الحق للتحميل).

Discussion

التحدي الأساسي للحقل EV هو فصل مجموعة واسعة من الأنواع الفرعية EV2. تستخدم الأساليب الموصوفة هنا الترشيح، والطرد المركزي التفاضلي، والكروماتوغرافيا الإقصاء للحجم لتوليد مجموعة نقية من المركبات الكهربائية الصغيرة لأن ~ 100 نانومتر EVs ثبت سابقا أن تفرز في البيئة الخارجية ووظيفة في مسارات الاتصال ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية16. قد لا تزال المركبات الكهربائية المنقاة من خلال الكروماتوغرافيا الإقصاء الحجمية مزيجًا من الاكسوزوسومات والميكروفيسيخالصغيرة الصغيرة لأن هذه الفئات الفرعية EV متشابهة الحجم. عادة ما يتم فصل الفئات الفرعية EV الفقارية عن طريق الترسيب المناعي لأن هذه الطريقة تعزل المركبات الكهربائية من خلال ربط علامات بروتين الغشاء الانتقائي. الطرق الموصوفة تسهيل التعرف على بروتينات علامة غشاء EV C. elegans EV. لذلك ، في المستقبل قد يكون من الممكن زيادة فصل الفئات الفرعية EV الصغيرة من خلال أساليب مماثلة لهطول المناعة. من الناحية النظرية، يمكن أن يعزل الترسيب المناعي المركبات الكهربائية عن الديدان التغذية بشكل جيد لأن E. Coli EVs لا ينبغي أن تتفاعل مع الأجسام المضادة. يمكن للباحثين المهتمين بتحديد البروتين والشحنات الوراثية للفئات الفرعية الأكبر EV (> 200 نانومتر) القيام بذلك عن طريق تخطي خطوة الترشيح 0.22 ميكرومتر ثم تحليل بيليه بدلاً من supernatant. الكشف عن وفرة البروتين والبضائع الوراثية من السيارات الكهربائية الكبيرة سوف يؤسس لفهم أكثر شمولا للعمليات الفسيولوجية التي تعمل من خلال سي elegans secretome. بالإضافة إلى كونها تفرز في البيئة، يتم نقل السيارات الكهربائية C. elegans داخليا بين الأنسجة. لذلك، هذه الأساليب عزل مجموعة فرعية فقط من إجمالي C. elegans EVs. ومع ذلك ، فإن اكتشاف البضائع من المركبات الكهربائية الداخلية غير ممكن لأنه لا توجد طريقة لفصل المركبات الكهربائية عن الديدان الملبدة. تحليل البضائع من هذه المجموعة الفرعية EV تفرز خارجيا يوفر وسيلة لتحديد علامات البروتين EV العامة المحتملة قادرة على وضع العلامات الكهربائية الداخلية كذلك.

يعتمد حجم إعداد EV على متطلبات التجربة. يوفر ما مجموعه 500,000 شاب من البالغين ما يكفي من المركبات الكهربائية لإجراء قياس خلايا التدفق وLC-MS-MS وتحليل RNAseq بالتوازي. يمكن توسيع هذا العدد لأعلى أو لأسفل حسب الاحتياجات التجريبية. أكبر عامل عملي لزيادة هو عدد لوحات النمو 10 سم عالية المطلوبة. لوحات النمو العالي أعدت مع 500 ميكرولتر من 20x مركزة بين عشية وضحاها NA22 الثقافة سوف تدعم السكان من حوالي 50،000 البالغين من مرحلة اليرقات L1 حتى اليوم الأول من مرحلة البلوغ. لذلك ، لإجراء تجربة مع 500،000 شخص بالغ ، هناك حاجة إلى 13 لوحة نمو عالية: لوحة واحدة لتوليد عدد سكان L1s ، ولوحتين لتوليد البالغين للتبييض ، و 10 لوحات لنمو الحيوانات التجريبية. هذه المقاييس هي التي تتوقف على ظروف البذر والنمو البكتيري لوحات النمو العالي. لذلك ، يوصى بصنع جميع اللوحات بطريقة موحدة ثم معايرتها بكميات معروفة من الحيوانات.

يتم حساب الديدان على مرحلتين أثناء عملية الزراعة: 1) قبل البذر الديدان على لوحات و 2) قبل توليد وسائل الإعلام مكيفة. وقد ثبت كثافة زراعة الحيوان للتأثير على السلوك، والتنمية، والاستجابات الإجهاد15،16،17،18 ، وبالتالي ، قد تؤثر أيضا على الشحنات EV. لذلك ، من أجل كثافة زراعة متسقة ، من الضروري تقدير أعداد الديدان بدقة. إن تحديد عدد الديدان في تسع قطرات يعطي الثقة الإحصائية للتقديرات السكانية. من الضروري علاج كل قطرة على حدة ، والدوامة بين كل قطرة وإدراج ماصة نفس المسافة في تعليق الدودة. إن اتخاذ هذه الاحتياطات سيضمن قيم S.E.M. من حوالي 5-10٪ من إجمالي السكان. إذا كانت S.E.M. للمجموعة الدودة أعلى من 20٪، ثم شيء ما ذهب منحرف.

بعد فترة الحضانة خالية من البكتيريا 24 ساعة ، يزحف الشباب من النوع البري C. elegans فورًا بالإضافة إلى العشب البكتيري. وهذا يشير إلى أن الحضانة لا تؤثر بشدة على صحتهم. ومع ذلك ، فإن هذه الخطوة تؤثر على فسيولوجيا الحيوانات وبالتالي قد تؤثر على تكوين شحنات EV. لذلك ، عند العمل مع الأنماط الجينية المريضة جدًا أو الحيوانات القديمة ، من الضروري التحقق من الجدوى بعد خطوة الحضانة. إذا لم تنجو جميع الحيوانات من الحضانة ، فقم بزيادة حجم السكان التجريبي وتقليل وقت الحضانة. عند العمل مع كميات كبيرة من الوسائط المكيفة ، فمن العملي أكثر استخدام مكثف الخلايا التحريكية مع مرشح مصنوع من النيتروسيللوز المتجدد. لا ترتبط المركبات الكهربائية بكيمياء التصفية هذه بقوة مثل أنواع التصفية الأخرى14.

نسبة البروتين الكلي المسترد من وسائل الإعلام مكيفة لعدد الحيوانات المحتضنة لجعل إعداد هو مقياس مفيد. إذا كانت هذه النسبة أعلى بكثير مما كان متوقعا، فمن الممكن أن التقديرات السكانية كانت قبالة أو أن الحيوانات ماتت وتدهورت في وسائل الإعلام مكيفة. إذا كانت هذه النسبة أقل بكثير مما كان متوقعا، ثم بعض البروتين قد فقدت على المرشحات أثناء عملية التركيز. وفي حين أن أساليب نظام مراقبة الأصول الميدانية سوف تحدد مباشرة المركبات الكهربائية في الإعداد، فإن هذا المقياس مفيد لأنه يمكن أن يسلط الضوء على شذوذ العينة في وقت مبكر من العملية. طريقة أخرى مفيدة للتحقق من جودة إعداد EV هو المجهر الإلكتروني انتقال، كما هو مبين في الشكل 4D. على الرغم من أن بروتوكول المجهر الإلكتروني الإرسال لم يتم تضمينها رسميا في هذه المادة أساليب بسبب طول، فإنه يمكن أن يتم بالطرق القياسية. ويوصى بإجراء هذا النوع من التحليل، في البداية على الأقل، كطريقة مجانية لنظام مراقبة الأصول الميدانية لتقييم نوعية مستحضرات EV. للحصول على أفضل النتائج استخدام شبكات formvar الكربون ية حديثا ووصمة عار العينات مع حمض فوسفوالتنغستن 2٪ بدلا من خلات uranyl.

تم اختيار DI-8-ANEPPS لأنه ثبت أن تسمية الأغشية EV كميا، متفوقا على غيرها من الأصباغ EV العامة مع عينات خزعة الإنسان والليبوزومات25. القياسات سريعة ، مع 3 دقيقة فقط من وقت جمع كل عينة. إن التحديد الكمي للمركبات الكهربائية الحساسة للمنظفات له أهمية وظيفية مباشرة لأنه يستفيد من التمييز المادي الأساسي بين المركبات الكهربائية ومجاميع البروتين الدهني الصلبة. الأهم من ذلك، لا تتأثر هذه الطريقة بكمية البروتين الكلي أو عدد المجاميع غير EV، وبالتالي يمكن تحديد كمية المركبات الكهربائية التي تم الحصول عليها من خلال طرق تنقية مختلفة بطريقة غير متحيزة. سيكون مقياس EV الذي تم التحقق منه من FACS الذي نصفه هنا مفيدًا بشكل خاص للدراسات التي توضح الآثار الفسيولوجية للمركبات الكهربائية المنقىة. كما يمكن أن يفيد مجال EV بشكل عام لوضع منهجية FACS كمقياس عالمي بحيث يمكن مقارنة وفرة EV المطلقة مباشرة عبر الدراسات. يمكن أن تسمية الأصباغ الحيوية C. elegans EVs ، ولكنها ليست مشرقة مثل السيارات الكهربائية المسماة مع Di-8-ANEPPS.

يستفيد هذا النهج التنقية من الإفراز النشط للمركبات الكهربائية خارج أجسام الديدان الحية السليمة. وهذا يسمح C. elegans EVs لتكون معزولة في نقاء ووفرة مماثلة اعتبارا من ثقافة الخلية, المواصفات التي هي كافية لتحديد مئات من البروتين وشحنات الحمض النووي الريبي عبر LC-MS-MS وRNAseq تحليل26. وهكذا، يمكن الاستفادة من المكتبة الكبيرة من الكواشف المتاحة لبحوث C. elegans للتحقيق في تأثير الاضطراب الوراثي والفسيولوجي على تكوين البضائع EV.

Disclosures

ولا يعلن صاحبا البلاغ عن مصالح متنافسة.

Acknowledgments

ونحن ننوه بامتنان لـ"نك تيرزوبولوس" للوحات الديدان والكواشف؛ ونقدّم امتناننا لـ"نَكِر" "ب"الديدان" و"الكواشف" مركز علم الوراثة Caenorhabditis (CGC) في مكتب المعاهد القومية للصحة لبرامج البنية التحتية للبحوث (P40 OD010440) لخط النيماتودا N2؛ لوسيا فويتك، دكتوراه، للمساعدة في تحليل تتبع الجسيمات النانوية؛ جيسيكا يونغ, دكتوراه, وماري كلير, دكتوراه, دكتوراه, دكتوراه, لhiPSC المستمدة من وسائل الإعلام الخلية مكيفة; واي بانغ للمساعدة في التصوير تيم. تم دعم هذا العمل من قبل منحة المعاهد القومية للصحة P30AG013280 إلى MK وNIH منحة AG054098 إلى JCR.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.22 μm filters units Genesee 25-233 For clairifying the conditioned media from debris
1% solution of Triton X-100 ThermoFisher HFH10 Add this to 0.05% to lyse EVs
10 cm high growth plates N/A N/A For cultivating large populations of worms
2 L bottom baffled flasks ThermoFisher 4110-2000PK For conducting size exclusion separation of EVs
40 μm mesh Amazon CMY-0040-C/5PK-05 Use this to separate adult worms from larval stages
5 μm mesh Amazon CMN-0005-C Use this to separate L1s from other worm stages
6 cm normal growth medium worm cultivation plate N/A N/A For cultivating small populations of worms
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter 10 kD mwco MilliporeSigma C7715 For concentrating the size exclusion elute
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter 10 kD mwco MilliporeSigma C78144 For concentrating the conditioned media
Apogee A50 flow cytometer Apogee This flow cytometer is specialized for resolving nanometer size particles
ApogeeMix Apogee 1493 Assess light scatter and fluorescence performance of FACS
DI-8-ANEPPS ThermoFisher D3167 Add this at 20 uM to label EVs
Disposable chromatography Column BioRad 7321010 For conducting size exclusion separation of EVs
Geletin MilliporeSigma G9391-100G To treat pipette tips so that worms do not stick
HALT protease inhibitor ThermoFisher 87785 Add to EV sample to prevent protein degradation
Low-protein binding collection tubes ThermoFisher 90410 Use these for EV samples
NaCl Sigma S7653-1KG For sucrose floatation of worms
S Basal buffer N/A N/A Recipe in WormBook
Sepharose CL-2B resin MilliporeSigma CL2B300-100ML For conducting size exclusion separation of EVs
Small orbital shaker ABC Scientific 83211301 Use this for worm S Basal incubation
Sucrose Sigma S8501-5KG For sucrose floatation of worms

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Maas, S. L. N., Breakefield, X. O., Weaver, A. M. Extracellular Vesicles: Unique Intercellular Delivery Vehicles. Trends in Cell Biology. 27, 172-188 (2017).
  2. Raposo, G., Stoorvogel, W. Extracellular vesicles: exosomes, microvesicles, and friends. The Journal of Cell Biology. 200, 373-383 (2013).
  3. Lakhter, A. J., Sims, E. K. Minireview: Emerging Roles for Extracellular Vesicles in Diabetes and Related Metabolic Disorders. Molecular Endocrinology. 29, 1535-1548 (2015).
  4. Anderson, H. C., Mulhall, D., Garimella, R. Role of extracellular membrane vesicles in the pathogenesis of various diseases, including cancer, renal diseases, atherosclerosis, and arthritis. Laboratory Investigation; a Journal of Technical Methods and Pathology. 90, 1549-1557 (2010).
  5. Lai, C. P. -K., Breakefield, X. O. Role of exosomes/microvesicles in the nervous system and use in emerging therapies. Frontiers in Physiology. 3, 228 (2012).
  6. Duijvesz, D., et al. Proteomic profiling of exosomes leads to the identification of novel biomarkers for prostate cancer. PLoS One. 8, 82589 (2013).
  7. Zhou, H., et al. Exosomal Fetuin-A identified by proteomics: a novel urinary biomarker for detecting acute kidney injury. Kidney International. 70, 1847-1857 (2006).
  8. Cheng, L., Sharples, R. A., Scicluna, B. J., Hill, A. F. Exosomes provide a protective and enriched source of miRNA for biomarker profiling compared to intracellular and cell-free blood. Journal of Extracellular Vesicles. 3, (2014).
  9. Michael, A., et al. Exosomes from human saliva as a source of microRNA biomarkers. Oral Diseases. 16, 34-38 (2010).
  10. Wehman, A. M., Poggioli, C., Schweinsberg, P., Grant, B. D., Nance, J. The P4-ATPase TAT-5 inhibits the budding of extracellular vesicles in C. elegans embryos. Current Biology. 21, 1951-1959 (2011).
  11. Naik, J., et al. The P4-ATPase ATP9A is a novel determinant of exosome release. PLoS One. 14, 0213069 (2019).
  12. Liégeois, S., Benedetto, A., Garnier, J. -M., Schwab, Y., Labouesse, M. The V0-ATPase mediates apical secretion of exosomes containing Hedgehog-related proteins in Caenorhabditis elegans. Journal of Cell Biology. 173, 949-961 (2006).
  13. Simon, E., Aguirre-Tamaral, A., Aguilar, G., Guerrero, I. Perspectives on Intra- and Intercellular Trafficking of Hedgehog for Tissue Patterning. Journal of Developmental Biology. 4, (2016).
  14. Qi, J., et al. Exosomes Derived from Human Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells Promote Tumor Growth Through Hedgehog Signaling Pathway. Cellular Physiology and Biochemistry. 42, 2242-2254 (2017).
  15. Sigg, M. A., et al. Evolutionary Proteomics Uncovers Ancient Associations of Cilia with Signaling Pathways. Developmental Cell. 43, 744-762 (2017).
  16. Wang, J., et al. C. elegans ciliated sensory neurons release extracellular vesicles that function in animal communication. Current Biology. 24, 519-525 (2014).
  17. Beer, K. B., Wehman, A. M. Mechanisms and functions of extracellular vesicle release in vivo-What we can learn from flies and worms. Cell Adhesion and Migration. 11, 135-150 (2017).
  18. Deatherage, B. L., Cookson, B. T. Membrane vesicle release in bacteria, eukaryotes, and archaea: a conserved yet underappreciated aspect of microbial life. Infection and Immunity. 80, 1948-1957 (2012).
  19. Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. C. elegans. 2, 51-67 (1999).
  20. Kibria, G., et al. A rapid, automated surface protein profiling of single circulating exosomes in human blood. Scientific Reports. 6, 36502 (2016).
  21. Rose, J. A., et al. Flow cytometric quantification of peripheral blood cell β-adrenergic receptor density and urinary endothelial cell-derived microparticles in pulmonary arterial hypertension. PLoS One. 11, 0156940 (2016).
  22. Lobb, R. J., et al. Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma. Journal of Extracellular Vesicles. 4, 27031 (2015).
  23. Gardiner, C., Ferreira, Y. J., Dragovic, R. A., Redman, C. W. G., Sargent, I. L. Extracellular vesicle sizing and enumeration by nanoparticle tracking analysis. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
  24. Fernandez, A. G., et al. High-throughput fluorescence-based isolation of live C. elegans larvae. Nature Protocols. 7, 1502-1510 (2012).
  25. de Rond, L., et al. Comparison of Generic Fluorescent Markers for Detection of Extracellular Vesicles by Flow Cytometry. Clinical Chemistry. 64 (4), 680-689 (2018).
  26. Russell, J. C., et al. Isolation and characterization of extracellular vesicles from Caenorhabditis elegans for multi-omic analysis [Internet]. bioRxiv. , (2018).

Tags

علم الأحياء، العدد 157، قياس الخلايا التدفق، DI-8-ANEPPS، حجم استبعاد الكروماتوغرافيا، قياس التدفق الخلوي، عدد كبير من السكان C. elegans الصيانة
تنقية وتحليل <em>Caenorhabditis elegans</em> خارج الخلية الحويصلات
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Russell, J. C., Postupna, N.,… More

Russell, J. C., Postupna, N., Golubeva, A., Keene, C. D., Kaeberlein, M. Purification and Analysis of Caenorhabditis elegans Extracellular Vesicles. J. Vis. Exp. (157), e60596, doi:10.3791/60596 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter