Denne artikkelen presenterer metoder for å generere, rense og kvantifisere Caenorhabditis elegans ekstracellulære vesikler.
Utskillelse av små membranbundne vesikler i det ytre miljøet er en grunnleggende fysiologisk prosess for alle celler. Disse ekstracellulære vesiklene (EV-er) fungerer utenfor cellen for å regulere globale fysiologiske prosesser ved å overføre proteiner, nukleinsyrer, metabolitter og lipider mellom vev. EV-er gjenspeiler den fysiologiske tilstanden til deres opprinnelsesceller. EV-er er innblandet i å ha grunnleggende roller i nesten alle aspekter av menneskers helse. Dermed blir EV-protein og genetiske laster i økende grad analysert for biomarkører av helse og sykdom. Ev-feltet mangler imidlertid fortsatt et håndsdyrmodellsystem som tillater studiet av EV-lastsammensetning. C. elegans er godt egnet for EV-forskning fordi det aktivt utskiller EV-er utenfor kroppen i sitt ytre miljø, slik at facile isolasjon. Denne artikkelen gir all nødvendig informasjon for å generere, rense og kvantifisere disse miljøutskillede C. elegans-EV-ene, inkludert hvordan man arbeider kvantitativt med svært store populasjoner av alderssynkroniserte ormer, rensende EV-er og en flytcytometriprotokoll som direkte måler antall intakte EV-er i den rensede prøven. Dermed kan det store biblioteket av genetiske reagenser tilgjengelig for C. elegans forskning bli tappet inn for å undersøke virkningene av genetiske veier og fysiologiske prosesser på EV last sammensetning.
Utskillelse av membranbundne ekstracellulære vesikler (EV-er) forenkler de globale fysiologiske prosessene ved aktivt å transportere spesifikt protein, nukleinsyre, metabolitter og lipidlaster mellom celle1. Celler utskiller EV-er som spenner over et kontinuum av størrelser fra 2 μm eller større til så små som 20 nm2. Små EV-er (<200 nm) studeres i økende grad på grunn av deres implikasjon i patologiske prosesser, inkludert metabolske forstyrrelser, kreft, kardiovaskulær sykdom og nevrodegenerative sykdommer3,4,5. Disse patologiene har også vist seg å påvirke proteinet og den genetiske sammensetningen av EV-laster av små EV-er. Derfor blir biomarkørsignaturer av patologien i økende grad avdekket gjennom EV-lastoppdagelsesmetoder som LC-MS-MS og RNAseq6,,7,8,9.
C. elegans har vært en nyttig virvelløse modell for å identifisere evolusjonært bevarte EV-signalveier. For eksempel ble en C. elegans flippase først vist å indusere EV biogenesis i C. elegans embryoer, og den menneskelige homolog ble vist å påvirke EV utgivelse i menneskelige celler10,11. C. elegans EV ble rapportert å bære Hedgehog signaler som er nødvendige for cuticle utvikling. Leveringen av Pinnsvin og andre morfoogener ble vist å spille en stor utviklingsrolle for EV-er, og det er bevart i sebrafisk, mus og mennesker12,,13,14,15. C. elegans er godt egnet for EV biomarkør oppdagelse fordi det utskiller EV utenfor kroppen som fungerer i dyr-til-dyr kommunikasjon16,17 (Figur 1A). Metodikken som er etablert gjennom en tidligere studie, kan imidlertid ikke brukes fordi nematodenes E. coli-matkilde også utskiller EV-er18. I denne metoden består det meste av prøven av E. coli-kontaminering, noe som begrenser kraften til proteomiske eller RNAseq tilnærminger for oppdagelsen av C. elegans EV-laster. Metodene som er beskrevet her ble utviklet for å gi svært rene C. elegans EV-er på overflodnivåer som er karakteristiske for typiske cellekultureksperimenter og dermed lette omics tilnærminger for EV biomarkør oppdagelse.
Store bestander av ormer er nødvendig for å generere et tilstrekkelig antall EV-er for lastanalyse. Derfor er metoder for å gjennomføre kvantitativ dyrking av store populasjoner av utviklingssynkroniserte C. elegans også inkludert. Vanligvis, når et stort antall ormer er nødvendig for eksperimenter, blir de dyrket i flytende medier. Mens dette er effektivt for å generere store populasjoner av ormer, er dyrenes fysiologi betydelig forskjellig fra ormer dyrket under standardforhold på nematodevekstmedium (NGM) agarplater. Dyr dyrket i væske vokser saktere, er tynnere, viser utviklingsheterogenitet, og blir utsatt for en høy grad av batch variabilitet. Derfor presenterer vi et enkelt, men effektivt middel for kvantitativ dyrking av store populasjoner av utviklingssynkroniserte C. elegans ved hjelp av 10 cm høye vekstplater. Mediesammensetningen av høyvekstplater inkluderer mer peptone enn vanlige NGM-plater og seedes med E. coli-stammen NA22 som vokser mer robust enn OP50.
Fremskritt i flow cytometri teknologi (FACS) har aktivert direkte analyse av individuelle EV20,21, tillater kvantifisering av EV uten de iboende begrensninger i andre metoder. Tidligere arbeid har vist at protein ikke er en nyttig proxy for EV overflod fordi ulike rensemetoder resulterer i betydelig forskjellige EV-til-protein forhold22. Ekstremt rene EV-fraksjoner inneholder relativt lite protein, noe som gjør det vanskelig å kvantifisere prøver med BCA eller Coomassie geler. Vestlig analyse kan identifisere relative forskjeller av individuelle proteiner, men kan ikke identifisere hvor mange EV-er som er i prøven. Robust kvantifisering av EV-nummer ved nanopartikkelsporingsanalyse hemmes av sitt smale signal-til-støy-område, manglende evne til å skille mellom EV-er og solide aggregater, og mangelen på overføringsevne av metoder mellom instrumenter med forskjellige spesifikasjoner23. Derfor inneholder denne artikkelen også en generell flyt cytometrisk prosedyre for diskriminering og kvantifiserende EV-er.
En grunnleggende utfordring for EV-feltet er å skille det brede utvalget av EV-undertyper2. Metodene som er beskrevet her, bruker filtrering, differensentrifugering og størrelsesekskluderingskromatografi for å generere en ren populasjon av små EV-er fordi ~ 100 nm EV-er tidligere ble vist seg å være utskilt i det ytre miljø og funksjon i fysiologisk relevante kommunikasjonsveier16. EV-er renset gjennom størrelsesekskluderingskromatografi kan fortsatt være en blanding av eksosomer og små mikrovesikler fordi disse EV-underklassene er tilsvarende store. Virveldyr EV underklasser er vanligvis atskilt med immunnedbør fordi denne metoden isolerer EV gjennom binding til selektive membranproteinmarkører. Metodene som er beskrevet letter identifiseringen av C. elegans EV membranmarkørproteiner. Derfor kan det i fremtiden være mulig å ytterligere skille små EV-underklasser gjennom analoge immunnedbørsmetoder. I teorien kan immunnedbør isolere EV-er fra godt matet ormer fordi E. coli-EV-er ikke bør samhandle med antistoffet. Forskere som er interessert i å identifisere protein og genetisklaster av større EV underklasser (> 200 nm) kan gjøre det ved å hoppe over 0,22 μm filtrering trinn og deretter analysere pellet i stedet for supernatant. Avdekke protein og genetisk last overflod av store EV-er vil etablere en mer omfattende forståelse av fysiologiske prosesser som fungerer gjennom C. elegans secretome. I tillegg til å bli utskilt i miljøet, overføres C. elegans-EV-er internt mellom vev. Derfor isolerer disse metodene bare et delsett av totale C. elegans-EV-er. Lastoppdagelse av interne EV-er er imidlertid ikke mulig fordi det ikke finnes noen metode for å skille EV-er fra lysed ormer. Lastanalyse av denne eksternt utskillede EV-undergruppen gir også et middel til å identifisere potensielle generelle EV-proteinmarkører som kan merke interne EV-er.
Omfanget av EV-preparatet vil avhenge av kravene til eksperimentet. Totalt 500 000 unge voksne gir nok EV-er til å gjennomføre flow cytometri, LC-MS-MS og RNAseq analyse parallelt. Dette tallet kan skaleres opp eller ned avhengig av de eksperimentelle behovene. Den største praktiske faktoren for oppskalering er antall 10 cm høye vekstplater som kreves. Høye vekstplater tilberedt med 500 μL av 20x konsentrert over natten NA22 kultur vil støtte en befolkning på ~ 50.000 voksne fra L1 larval scenen til den første dagen i voksen alder. Derfor, for å gjennomføre et eksperiment med 500.000 voksne, er det nødvendig med 13 høyvekstplater: en tallerken for å generere befolkningen i L1s, to plater for å generere de voksne for bleking, og 10 plater for veksten av de eksperimentelle dyrene. Disse beregningene er betinget av seeding og bakteriellvekst forhold av høy vekst plater. Derfor anbefales det å lage alle platene på en standardisert måte og deretter kalibrere med kjente mengder dyr.
Ormer telles på to stadier under dyrkingsprosessen: 1) før seeding ormer på plater og 2) før du genererer de betingede mediene. Dyredyrkingstetthet har vist seg å påvirke atferd, utvikling og stressrespons15,16,17,18 og kan derfor også påvirke EV-laster. Derfor, for konsekvent dyrking tetthet er det nødvendig å nøyaktig estimere orm populasjoner. Kvantifisere antall ormer i ni dråper gir statistisk tillit til populasjonsestimeringer. Det er viktig å behandle hver dråpe individuelt, virvlende mellom hver dråpe og sette pipetten samme avstand inn i ormsuspensjonen. Å ta disse forholdsreglene vil sikre S.E.M. verdier på ~ 5-10% av den totale befolkningen. Hvis S.E.M. for en orm populasjon er høyere enn 20%, så noe gikk galt.
Etter den 24 h bakteriefrie inkubasjonsperioden kryper unge, ville type C. elegans umiddelbart etter tillegg til en bakteriell plen. Dette indikerer at inkubasjonen ikke alvorlig påvirker helsen deres. Dette trinnet påvirker imidlertid dyrenes fysiologi og kan derfor påvirke sammensetningen av EV-lastene. Derfor, når du arbeider med svært syke genotyper eller eldre dyr, er det viktig å sjekke levedyktighet etter inkubasjonstrinnet. Hvis alle dyr ikke overlever inkubasjonen, øker du den eksperimentelle populasjonsstørrelsen og reduserer inkubasjonstiden. Når du arbeider med store mengder av betingede medier, er det mer praktisk å bruke en rørt cellekonsentrator med et filter laget av regenerert nitrocellulose. EV-er binder seg ikke til denne filterkjemien like sterkt som andre filtertyper14.
Forholdet mellom det totale proteinet som er gjenvunnet fra de betingede mediene til antall dyr som ruges for å gjøre preparatet er en nyttig beregning. Hvis dette forholdet er mye høyere enn forventet, er det mulig at populasjonsestimeringene var av eller at dyr døde og forverret seg i de betingede mediene. Hvis dette forholdet er mye lavere enn forventet, kan noe protein ha gått tapt på filtrene under konsentrasjonsprosessen. Mens FACS-metodene direkte kvantifiserer EV-ene i preparatet, er denne målingen nyttig fordi den kan markere eksempelavvik tidlig i prosessen. En annen nyttig metode for å verifisere kvaliteten på EV-preparatet er overføringselektronmikroskopi, som vist i figur 4D. Selv om protokollen for overføring elektron mikroskopi ikke er formelt inkludert i denne metoden artikkelen på grunn av lengde, det kan utføres av standardmetoder. Det anbefales å gjennomføre denne typen analyse, i hvert fall i utgangspunktet, som en gratis metode til FACS for å vurdere kvaliteten på EV-preparater. For best resultat bruk nyutladet formvar-karbongitter og beis prøvene med 2% fosforsyre i stedet for uranylacetat.
DI-8-ANEPPS ble valgt fordi det har vist seg å kvantitativt merke EV membraner, outperforming andre generelle EV fargestoffer med menneskelige biopsi prøver og liposomer25. Målingene er raske, og tar bare 3 min innsamlingstid for hver prøve. Kvantifiseringen av vaskemiddelfølsomme EV-er har direkte funksjonell betydning fordi den utnytter et grunnleggende fysisk skille mellom EV-er og solide lipoproteinaggregater. Viktigere, denne metoden påvirkes ikke av mengden av totalt protein eller antall ikke-EV aggregater og kan derfor kvantifisere EV-er oppnådd gjennom ulike rensemetoder på en objektiv måte. FACS-verifisert EV-målingen vi beskriver her, vil være spesielt nyttig for studier som viser fysiologiske konsekvenser av rensede EV-er. Det kan også være til nytte for EV-feltet generelt å etablere en FACS-metodikk som en universell beregning, slik at absolutte EV-overfloder kan sammenlignes direkte på tvers av studier. Vitale fargestoffer kan også merke C. elegans EV,men de er ikke så lyse som EV-er merket med Di-8-ANEPPS.
Denne rensetilnærmingen utnytter den aktive sekresjonen av EV-er utenfor kroppene til intakte, levende ormer. Dette gjør det mulig for C. elegans EV-er å isoleres ved sammenlignbar renhet og overflod som fra cellekultur, spesifikasjoner som er tilstrekkelige for å identifisere hundrevis av protein- og RNA-laster via LC-MS- ms- og RNAseq-analyse26. Dermed kan det store biblioteket av reagenser tilgjengelig for C. elegans forskning utnyttes for å undersøke påvirkning av den genetiske og fysiologiske perturbasjonen på EV-lastsammensetning.
The authors have nothing to disclose.
Vi anerkjenner takknemlig Nick Terzopoulos for ormplater og reagenser; Caenorhabditis Genetics Center (CGC) ved NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) for N2 nematode linjen; Lucia Vojtech, PhD, for hjelp med nanopartikkelsporingsanalysen; Jessica Young, PhD, og Marie Claire, MD, PhD, for hiPSC-avledet nevronal betinget cellemedia; Wai Pang for å få hjelp med TEM-bildebehandling. Dette arbeidet ble støttet av NIH-stipendet P30AG013280 til MK og NIH-bevilgning AG054098 til JCR.
0.22 filters units | Genesee | 25-233 | For clairifying the conditioned media from debris |
1% solution of Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | Add this to 0.05 % to lyse EVs |
10 cm high growth plates | N/A | N/A | For cultivating large populations of worms |
2-liter bottom baffled flasks | ThermoFisher | 4110-2000PK | For conducting size exclusion separation of EVs |
40 μm mesh | Amazon | CMY-0040-C/5PK-05 | Use this to separate adult worms from larval stages |
5 μm mesh | Amazon | CMN-0005-C | Use this to separate L1s from other worm stages |
6 cm normal growth medium worm cultivation plate | N/A | N/A | For cultivating small populations of worms |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter 10 kD mwco | MilliporeSigma | C7715 | For concentrating the size exclusion elute |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter 10 kD mwco | MilliporeSigma | C78144 | For concentrating the conditioned media |
Apogee A50 flow cytometer | Apogee | This flow cytometer is specialized for resolving nanometer size particles | |
ApogeeMix | Apogee | 1493 | Assess light scatter and fluorescence performance of FACS |
DI-8-ANEPPS | ThermoFisher | D3167 | Add this at 20 uM to label EVs |
Disposable chromatography Column | BioRad | 7321010 | For conducting size exclusion separation of EVs |
Geletin | MilliporeSigma | G9391-100G | To treat pipette tips so that worms do not stick |
HALT protease inhibitor | ThermoFisher | 87785 | Add to EV sample to prevent protein degradation |
Low-protein binding collection tubes | ThermoFisher | 90410 | Use these for EV samples |
NaCl | Sigma | S7653-1KG | For sucrose floatation of worms |
S Basal buffer | N/A | N/A | Recipe in WormBook |
Sepharose CL-2B resin | MilliporeSigma | CL2B300-100ML | For conducting size exclusion separation of EVs |
Small orbital shaker | ABC Scientific | 83211301 | Use this for worm S Basal incubation |
Sucrose | Sigma | S8501-5KG | For sucrose floatation of worms |