Denna artikel presenterar metoder för att generera, rena och kvantifiera Caenorhabditis elegans extracellulära blåsor.
Utsöndringen av små membranbundna vesiklar i den yttre miljön är en grundläggande fysiologisk process av alla celler. Dessa extracellulära blåsor (EVs) fungerar utanför cellen för att reglera globala fysiologiska processer genom att överföra proteiner, nukleinsyror, metaboliter och lipider mellan vävnader. Elbilar återspeglar det fysiologiska tillståndet hos deras ursprungsceller. Elfordon är inblandade för att ha grundläggande roller i praktiskt taget alla aspekter av människors hälsa. Således analyseras EV-protein och genetiska laster alltmer för biomarkörer för hälsa och sjukdom. Ev-fältet saknar dock fortfarande ett tarmvräknat ryggradslösa modellsystem som gör det möjligt att studera EV-lastsammansättning. C. elegans lämpar sig väl för EV-forskning eftersom den aktivt utsöndrar elbilar utanför kroppen i sin yttre miljö, vilket möjliggör lättisolering. Denna artikel innehåller all nödvändig information för att generera, rena och kvantifiera dessa miljömässigt utsöndrade C. elegans EVs inklusive hur man arbetar kvantitativt med mycket stora populationer av ålderssynkroniserad maskar, renande elbilar och ett flödescytometriprotokoll som direkt mäter antalet intakta elbilar i det renade provet. Det stora biblioteket av genetiska reagenser som finns tillgängliga för C. elegans forskning kan utnyttjas för att undersöka effekterna av genetiska vägar och fysiologiska processer på EV lastsammansättning.
Utsöndringen av membranbundna extracellulära blåsor (EVs) underlättar de globala fysiologiska processerna genom att aktivt transportera specifikt protein, nukleinsyra, metabolit och lipidlaster mellan cellerna1. Celler utsöndrar elbilar som spänner över ett kontinuum av storlekar från 2 μm eller större till så små som 20 nm2. Små elbilar (<200 nm) studeras alltmer på grund av deras implikation i patologiska processer, inklusive metabola sjukdomar, cancer, hjärt-kärlsjukdom, och neurodegenerativa sjukdomar3,4,5. Dessa patologier har också visat sig påverka protein och genetisk sammansättning av elbilar laster av små elbilar. Därför är biomarkör signaturer av patologin alltmer avslöjas genom EV last upptäckt metoder såsom LC-MS-MS och RNAseq6,7,8,9.
C. elegans har varit en användbar ryggradslös modell för att identifiera evolutionärt bevarade EV signalering vägar. Till exempel visades en C. elegans flippas först att inducera EV-biogenesen i C. elegans embryon, och den mänskliga homologen visade sig påverka EV-utsläpp i mänskliga celler10,11. C. elegans EVs rapporterades bära Igelkott signaler som är nödvändiga för nagelband utveckling. Leveransen av Igelkott och andra morfoogener visade sig spela en viktig utvecklingsroll av elbilar, och det bevaras i zebrafisk, möss och människor12,13,14,15. C. elegans lämpar sig väl för ev biomarkör upptäckt eftersom det utsöndrar elbilar utanför sin kropp som fungerar i djur-till-djur kommunikation16,17 (Figur 1A). Den metod som fastställts genom en tidigare studie kan dock inte användas eftersom nematodernas E. coli-näringskälla också utsöndrar elbilar18. I denna metod består det mesta av provet av E. coli-kontaminering, vilket begränsar kraften hos proteomiska eller RNAseq-metoder för upptäckten av C. elegans EV-laster. De metoder som beskrivs här har utvecklats för att ge mycket ren C. elegans EVs på överflöd nivåer som är karakteristiska för typiska cellkultur experiment och därmed underlätta omics metoder för EV biomarkör upptäckt.
Stora populationer av maskar behövs för att generera ett tillräckligt antal elbilar för lastanalys. Därför ingår också metoder för kvantitativ odling av stora populationer av utvecklingsmässigt synkroniserade C. elegans. Vanligtvis, när ett stort antal maskar behövs för experiment, de odlas i flytande media. Även om detta är effektivt för att generera stora populationer av maskar, är fysiologi av djuren skiljer sig avsevärt från maskar odlas under normala förhållanden på nematod tillväxt medium (NGM) agar plattor. Djur odlade i vätska växer långsammare, är tunnare, visar utvecklingsmässig heterogenitet och utsätts för en hög grad av batchvariation. Därför presenterar vi ett enkelt men effektivt sätt för kvantitativ odling av stora populationer av utvecklingsmässigt synkroniserade C. elegans med 10 cm högtillväxtplattor. Mediesammansättningen av högtillväxtplattor innehåller mer pepton än vanliga NGM-plattor och sås med E. coli-stammen NA22 som växer mer robust än OP50.
Framsteg inom flödescytometriteknik (FACS) har möjliggjort en direkt analys av enskilda elbilar20,,21,vilket möjliggör kvantifiering av elfordon utan de inneboende begränsningarna i andra metoder. Tidigare arbete har visat att protein inte är en användbar proxy för EV överflöd eftersom olika reningsmetoder resultera i betydligt olika EV-till-protein nyckeltal22. Extremt rena EV-fraktioner innehåller relativt lite protein, vilket gör det svårt att kvantifiera prover med BCA- eller Coomassie-geler. Västerländsk analys kan identifiera relativa skillnader i enskilda proteiner men kan inte identifiera hur många elbilar som ingår i provet. Robust kvantifiering av EV-nummer genom nanopartikelspårningsanalys hämmas av dess smala signal-till-brus-intervall, oförmåga att skilja mellan elbilar och fasta aggregat och bristen på överförbarhet av metoder mellan instrument med olika specifikationer23. Därför innehåller den här artikeln också ett generaliserbart flöde cytometriskt förfarande för att diskriminera och kvantifiera elbilar.
En grundläggande utmaning för EV-fältet är att skilja det stora utbudet av EV-undertyper2. De metoder som beskrivs här använder filtrering, differentialcentrifugering och storleksbeskluderingkromatografi för att generera en ren population av små elbilar eftersom ~100 nm EVs tidigare visat sig vara utsöndrade i den yttre miljön och funktion i fysiologiskt relevanta kommunikationsvägar16. Elfordon renas genom storlek-uteslutning kromatografi kan fortfarande vara en blandning av exosomer och små mikrovesicles eftersom dessa EV underklasser är lika stora. Ryggradsdjur EV underklasser är ofta åtskilda av immunprecipitation eftersom denna metod isolerar EVs genom bindning till selektiva membranproteinmarkörer. De beskrivna metoderna underlättar identifieringen av C. elegans EV-membranmarkörproteiner. Därför kan det i framtiden vara möjligt att ytterligare separera små EV-underklasser genom liknande immunoprecipitationsmetoder. I teorin kan immunprecipitation isolera elbilar från välmatade maskar eftersom E. coli EVs inte bör interagera med antikroppen. Forskare som är intresserade av att identifiera protein och genetiska laster av större EV-underklasser (>200 nm) kan göra det genom att hoppa över filtreringssteget på 0,22 μm och sedan analysera pelleten snarare än supernatanten. Att upptäcka protein- och genetiska lastförekomster av stora elbilar kommer att skapa en mer omfattande förståelse av de fysiologiska processer som fungerar genom C. elegans secretome. Förutom att utsöndras i miljön överförs C. elegans eVs internt mellan vävnader. Därför isolerar dessa metoder endast en delmängd av totala C. elegans EVs. Det går dock inte att upptäcka interna elbilar eftersom det inte finns någon metod för att separera elbilar från lysed maskar. Cargo analys av denna externt utsöndras EV delmängd ger ett sätt att identifiera potentiella allmänna EV protein markörer som kan märka interna elbilar också.
Omfattningen av EV-preparatet beror på kraven i experimentet. Totalt 500.000 unga vuxna ger tillräckligt med elbilar för att genomföra flöde cytometri, LC-MS-MS och RNAseq analys parallellt. Detta nummer kan skalas upp eller ned beroende på försöksbehoven. Den största praktiska faktorn för uppskalning är antalet 10 cm högtillväxtplattor som krävs. Hög tillväxt plattor beredda med 500 μL av 20x koncentrerad över natten NA22 kultur kommer att stödja en befolkning på ~ 50.000 vuxna från L1 larvstadiet fram till den första dagen i vuxen ålder. Därför, för att utföra ett experiment med 500.000 vuxna, 13 hög tillväxt plattor behövs: en platta för att generera befolkningen av L1s, två plattor för att generera de vuxna för blekning, och 10 plattor för tillväxten av försöksdjur. Dessa mått är beroende av sådd och bakteriell tillväxt villkor för hög tillväxt plattor. Därför rekommenderas att alla plattor görs på ett standardiserat sätt och sedan kalibrera med kända mängder djur.
Maskar räknas i två steg under odlingsprocessen: 1) före såddmaskar på tallrikar och 2) innan de genererar det konditionerade mediet. Djurodlingstäthet har visat sig påverka beteende, utveckling och stresssvar15,16,17,18 och kan därför också påverka EV-laster. Därför, för konsekvent odling densitet är det nödvändigt att exakt uppskatta maskpopulationer. Att kvantifiera antalet maskar i nio droppar ger statistiskt förtroende för befolkningsuppskattningar. Det är viktigt att behandla varje droppe individuellt, virvla mellan varje droppe och sätta in pipetten på samma avstånd i maskfjädringen. Att vidta dessa försiktighetsåtgärder kommer att säkerställa S.E.M. värden på ~ 5-10% av den totala befolkningen. Om S.E.M. för en maskpopulation är högre än 20%, så gick något snett.
Efter den 24 h bakteriefria inkubationstiden kryper ung, vild typ C. elegans omedelbart efter tillägg till en bakteriematta. Detta tyder på att inkubationen inte allvarligt påverkar deras hälsa. Detta steg påverkar dock djurens fysiologi och kan därför påverka ev-lastens sammansättning. Därför, när man arbetar med mycket sjuka genotyper eller äldre djur, är det viktigt att kontrollera lönsamheten efter inkubationssteget. Om alla djur inte överlever inkubationen, öka sedan den experimentella populationens storlek och minska inkubationstiden. När man arbetar med stora volymer konditionerade medier är det mer praktiskt att använda en omrörd cellkoncentrator med ett filter av regenererad nitrocellulosa. Elbilar binder inte till denna filterkemi lika starkt som andra filtertyper14.
Förhållandet mellan det totala protein som återvinns från det konditionerade mediet och antalet djur som inkuberas för att göra preparatet är ett användbart mått. Om detta förhållande är mycket högre än väntat, då är det möjligt att befolkningen uppskattningar var avstängd eller att djur dog och försämrades i de konditionerade medierna. Om detta förhållande är mycket lägre än väntat, då något protein kan ha gått förlorade på filtren under koncentrationsprocessen. Medan FACS-metoderna direkt kvantifierar eVs i beredningen, är det här måttet användbart eftersom det kan markera exempelavvikelser tidigt i processen. En annan användbar metod för att kontrollera kvaliteten på EV-preparatet är transmissionselektronmikroskopi, som visas i figur 4D. Även om protokollet för transmissionselektronmikroskopi inte formellt ingår i denna metodartikel på grund av längd, kan det utföras med standardmetoder. Det rekommenderas att denna typ av analys, åtminstone inledningsvis, genomförs som en kostnadsfri metod för FACS för att bedöma kvaliteten på ev-preparat. För bästa resultat använd nyurladdade formvar-kol galler och fläckproverna med 2% fosfotungstic syra istället för uranylacetat.
DI-8-ANEPPS valdes eftersom det har visat sig kvantitativt märka EV membran, bättre än andra allmänna EV färgämnen med mänskliga biopsi prover och liposomer25. Mätningarna är snabba och tar bara 3 minuter av insamlingstiden för varje prov. Kvantifieringen av tvättmedelskänsliga elfordon har direkt funktionell betydelse eftersom den drar nytta av en grundläggande fysisk distinktion mellan elbilar och fasta lipoproteinaggregat. Viktigt är att denna metod inte påverkas av mängden totalt protein eller antal icke-EV aggregat och därför kan kvantifiera elbilar som erhållits genom olika reningsmetoder på ett opartiskt sätt. Den FACS-verifierade EV-metriska vi beskriver här skulle vara särskilt användbart för studier som visar fysiologiska effekter av renade elbilar. Det skulle också kunna gynna EV-fältet i allmänhet att etablera en FACS-metod som ett universellt mått så att absolut EV-överflöd kan jämföras direkt mellan studierna. Vitala färgämnen kan också märka C. elegans EVs, men de är inte lika ljusa som elbilar märkta med Di-8-ANEPPS.
Denna reningsmetod kapitaliserar på den aktiva utsöndringen av elbilar utanför kropparna av intakta, levande maskar. Detta gör det möjligt att isolera C. elegans EVs med jämförbar renhet och överflöd från cellodling, specifikationer som är tillräckliga för att identifiera hundratals protein- och RNA-laster via LC-MS-MS och RNAseq-analys26. Det stora biblioteket av reagenser som finns tillgängliga för C. elegans-forskning kan därför utnyttjas för att undersöka påverkan av den genetiska och fysiologiska störningen på EV-lastsammansättningen.
The authors have nothing to disclose.
Vi erkänner tacksamt Nick Terzopoulos för maskplattor och reagenser; Caenorhabditis Genetics Center (CGC) vid NIH Office of Research Infrastructure Programs (P40 OD010440) för N2-nematodlinjen. Lucia Vojtech, PhD, för hjälp med nanopartikelspårningsanalys; Jessica Young, PhD, och Marie Claire, MD, PhD, för hiPSC-härledda neuronala konditionerade cellmedia; Wai Pang för hjälp med TEM imaging. Detta arbete stöddes av NIH-bidraget P30AG013280 till MK och NIH-bidrag AG054098 till JCR.
0.22 filters units | Genesee | 25-233 | For clairifying the conditioned media from debris |
1% solution of Triton X-100 | ThermoFisher | HFH10 | Add this to 0.05 % to lyse EVs |
10 cm high growth plates | N/A | N/A | For cultivating large populations of worms |
2-liter bottom baffled flasks | ThermoFisher | 4110-2000PK | For conducting size exclusion separation of EVs |
40 μm mesh | Amazon | CMY-0040-C/5PK-05 | Use this to separate adult worms from larval stages |
5 μm mesh | Amazon | CMN-0005-C | Use this to separate L1s from other worm stages |
6 cm normal growth medium worm cultivation plate | N/A | N/A | For cultivating small populations of worms |
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter 10 kD mwco | MilliporeSigma | C7715 | For concentrating the size exclusion elute |
Amicon Ultra-4 Centrifugal Filter 10 kD mwco | MilliporeSigma | C78144 | For concentrating the conditioned media |
Apogee A50 flow cytometer | Apogee | This flow cytometer is specialized for resolving nanometer size particles | |
ApogeeMix | Apogee | 1493 | Assess light scatter and fluorescence performance of FACS |
DI-8-ANEPPS | ThermoFisher | D3167 | Add this at 20 uM to label EVs |
Disposable chromatography Column | BioRad | 7321010 | For conducting size exclusion separation of EVs |
Geletin | MilliporeSigma | G9391-100G | To treat pipette tips so that worms do not stick |
HALT protease inhibitor | ThermoFisher | 87785 | Add to EV sample to prevent protein degradation |
Low-protein binding collection tubes | ThermoFisher | 90410 | Use these for EV samples |
NaCl | Sigma | S7653-1KG | For sucrose floatation of worms |
S Basal buffer | N/A | N/A | Recipe in WormBook |
Sepharose CL-2B resin | MilliporeSigma | CL2B300-100ML | For conducting size exclusion separation of EVs |
Small orbital shaker | ABC Scientific | 83211301 | Use this for worm S Basal incubation |
Sucrose | Sigma | S8501-5KG | For sucrose floatation of worms |