Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Screening voor Thermotoga maritima -membraan afhankelijke Pyrofosfatase remmers

doi: 10.3791/60619 Published: November 23, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Hier presenteren we een screeningsmethode voor membraan-gebonden pyrofosfatase (van Thermotoga maritima) remmers op basis van de molybdeen blauwe reactie in een 96 goed plaat formaat.

Abstract

Het membraan gebonden pyrofosfatasen (mPPases) zijn dimere enzymen die voorkomen bij bacteriën, Archaea, planten en protist parasieten. Deze eiwitten klieven pyrofosfaat in twee orthofosfaatmoleculen, die gepaard gaat met proton en/of natriumionen die over het membraanpompen. Omdat er geen homologe eiwitten voorkomen bij dieren en mensen, zijn mPPases goede kandidaten in het ontwerp van potentiële geneesmiddel doelen. Hier presenteren we een gedetailleerd protocol voor het scherm voor mPPase-remmers met behulp van de molybdeen blauwe reactie in een 96 goed plaat systeem. We gebruiken mPPase van de thermofiele bacterie Thermo toga maritima (tmppase) als een model enzym. Dit protocol is eenvoudig en goedkoop en produceert een consistent en robuust resultaat. Het duurt slechts ongeveer een uur om het activity assay protocol te voltooien vanaf het begin van de assay tot de extinctie meting. Aangezien de blauwe kleur die in deze test wordt geproduceerd gedurende een lange periode stabiel is, kunnen de volgende test (s) onmiddellijk na de vorige batch worden uitgevoerd en kan de extinctie later voor alle batches tegelijk worden gemeten. Het nadeel van dit protocol is dat het handmatig wordt gedaan en dus kan worden vermoeiend en vereisen goede vaardigheden van pipetteren en tijd houden. Bovendien bevat de in deze bepaling gebruikte arseniet-citraatoplossing natrium arseniet, wat giftig is en met de nodige voorzorgsmaatregelen moet worden behandeld.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Ongeveer 25% van de totale cellulaire eiwitten zijn membraan eiwitten en ongeveer 60% van hen zijn drug targets1,2. Een van de potentiële drug targets3, membraangebonden pyrofosfatasen (mPPases), zijn dimere enzymen die proton en/of natrium ion over het membraanpompen door hydrolyse van pyrofosfaat in twee orthofosfaataten4. mPPases kan worden gevonden in verschillende organismen5 zoals bacteriën, Archaea, planten, en protist parasieten, met uitzondering van mensen en dieren4. Bij protist parasieten, bijvoorbeeld Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii en Trypanosoma brucei, zijn mppases essentieel voor de parasiet virulentie6 en Knockout van deze expressie in de parasieten leiden tot falen bij het handhaven van intracellulaire pH bij blootstelling aan de uitwendige basis pH7. Vanwege hun belang en gebrek aan homologe eiwitten die aanwezig zijn in gewervelde dieren, kunnen mPPases worden beschouwd als potentiële geneesmiddel doelen voor protistal ziekten3.

De in vitro screening van mPPase-remmers in dit werk is gebaseerd op een TmPPase-modelsysteem. TmPPase is een natrium-ion-pomp en kalium-ion-afhankelijke mPPase van T. maritima en heeft zijn optimale activiteit bij 71 °c8. Voordelen van dit enzym zijn bijvoorbeeld het gemak in de productie en zuivering, goede thermische stabiliteit en hoge specifieke activiteit. Tmppase vertoont zowel een hoge gelijkenis als de volledige instandhouding van de positie en de identiteit van alle katalytische residuen aan de protist mppases3,9 en aan de opgeloste structuur van Vigna radiata10 mppase. De beschikbare structuren van TmPPase in verschillende conformaties zijn ook nuttig voor structuur gebaseerde drug design experiment (als virtuele screening en de Novo ontwerp).

Hier rapporteren we een gedetailleerd protocol voor het screenen van TmPPase remmers in een 96 goed plaat formaat (Figuur 1). Het protocol is gebaseerd op de colorimetrische methode van de molybdeen-blauwe reactie, die voor het eerst werd ontwikkeld door Fiske en Subbarow11. Deze methode omvat de vorming van 12-fosforzuurzuur uit het ORTHOFOSFAAT en molybdaat onder zure omstandigheden, die vervolgens wordt gereduceerd tot karakteristieke blauw kleurige fosforolybdenum soorten12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. eiwit preparaat

Opmerking: de uitdrukking en zuivering van TmPPase is elders beschreven13.

  1. Bereid 10 ml van de reactiverings Bufferoplossing met 20 mm 2-(N-morpholino) ethanesulfoninezuur (mes) pH 6,5, 3,5% (v/v) glycerol, 2 mm dithiotreïtol (DTT) en 0,05% dodecyl maltoside (DDM).
  2. Bereid 10 mL van het reactiemengsel met 200 mM tris-cl pH 8,0, 8,0 mM MgCl2, 333 mm KCl en 67 mm NaCl.
    Opmerking: mg2 + is vereist om het pyrofosfaat te cheleren als het substraat van Mppase, K+ is nodig om de enzymactiviteit te verhogen, aangezien tmppase een kalium-afhankelijke mppase is en na+ nodig is voor de enzymactiviteit tijdens natriumiontranslocatie door tmppase.
  3. Bereid 30 mg/mL liposomen voor enzym reactivering.
    1. Voeg 10 mL 20 mM tris-HCl pH 8,0 toe met 1 mM DTT tot 0,3 g L-α-dunlaag van sojabonen tot 10 mL 20 mM tris-HCl pH 8,0 met 1 mM DTT.
    2. Zet het liposoom op ijs en sonificeren met 1 seconde puls interval gedurende 1 minuut, pauzeer gedurende 1 minuut en herhaal dit totdat de oplossing transparant geel wordt.
    3. Aliquot de liposomen, Vries in vloeibare stikstof en bewaar bij-80 °C tot gebruikt.
  4. Het enzym opnieuw activeren.
    1. Meng 40 μL van de liposomen oplossing met 22,5 μL van 20% DDM.
    2. Verwarm het mengsel gedurende 15 minuten bij 55 °C en laat het afkoelen tot kamertemperatuur.
    3. Voeg 36,5 μL van de reactiverings bufferoplossing toe, meng en voeg 1 μL geconcentreerd eiwit (13 mg/mL) toe om een totale concentratie van 0,13 mg/mL te maken.
      Opmerking: eiwitten worden gewoonlijk bevroren in 10 μL aliquots na zuivering en ontdooid op ijs voor gebruik.
  5. Neem 20 μL van het gereactiveerde enzym en voeg toe aan 1.480 μL van het reactiemengsel en meng vervolgens zachtjes.
    Opmerking: de toevoeging van het gereactiveerde enzym aan het reactiemengsel moet worden uitgevoerd vlak voordat het wordt gebruikt.

2. samengestelde preparaat

  1. Los de verbindingen in Dimethylfumaraat sulfoxide (DMSO) op om stamoplossingen van 25 − 100 mM te maken in 50 − 200 μL, op basis van de beschikbaarheid van de verbindingen.
    Opmerking: alle verbindingen die hier worden gebruikt (afbeelding 2A) zijn eerder gepubliceerd9. Als de samengestelde oplosbaarheid laag is, kan de voorraad concentratie dienovereenkomstig worden aangepast.
  2. Bereid drie verschillende concentraties van elke verbinding in water.
    NB: de uiteindelijke concentraties in het reactiemengsel zijn respectievelijk 1, 5 en 50 micromolar of 1,5 en 20 micromolaire voor oplosbare en slecht oplosbare verbindingen.
    1. Verdun de stamoplossing met water tot 1 mL in microbuisjes om 2 μM, 10 μM en 100 μM te geven voor oplosbare verbindingen, of als alternatief 2 μM, 10 μM en 40 μM voor slecht oplosbare verbindingen.
    2. Vortex de samengestelde oplossing onmiddellijk na verdunning van de stamoplossing voor een goede menging.
  3. Controleer op samengestelde aggregatie met behulp van een nephelometer.
    Opmerking: dit werd bestudeerd als triplicaten in drie concentraties (1 μM, 5 μM en 20 μM) en genormaliseerd naar de blanco in een 96 goed plaat.
    1. Verdeel 75 μL van het reactiemengsel in elke put met behulp van een multikanaalspipet.
    2. Voeg 75 μL van elke stof toe (voor de blanco, gebruik in plaats daarvan 75 μL water) en meng door pipetteren op en neer 5 ×.
    3. Meet elk goed op 300 V met behulp van een microplaat nephelometer.

3. reagentia voor de bereiding van de assay

  1. Bereid de arseniet-citraat oplossing.
    1. Weeg 5 g natrium arseniet en 5 g triatriumcitraat dihydraat af.
      VOORZICHTIG: natrium arseniet is giftig, dus gebruik de juiste beschermende uitrusting en handvat met speciale zorg. Behandel als voorzorgsmaatregel niet voordat alle noodzakelijke veiligheidsmaatregelen zijn gelezen en begrepen. Behandel alleen in een rook afzuigkap om stof/dampen van de stof of de oplossing (en) niet te inhaleren. Bij inademing, naar de frisse lucht gaan en medische hulp inroepen. Draag een geschikte chemische veiligheidsbril, beschermende handschoenen en kleding om inslikken en ogen/huidcontact te voorkomen. Bij inslikken onmiddellijk een Antigifcentrum of een arts raadplegen. Als het op de huid of in het oog (s), wassen met veel water en het verkrijgen van medische hulp.
    2. Los in 100 mL water.
    3. Voeg 5 mL ijsazijn, meng, en voeg water toe aan 250 mL.
    4. Bewaren bij kamertemperatuur beschermd tegen licht.
      Opmerking: de oplossing is langer dan een jaar stabiel.
  2. Oplossing A en oplossing B voorbereiden.
    1. Voeg voor oplossing A 10 mL ijskoude 0,5 M HCl toe aan 0,3 g ascorbinezuur. Los het ascorbinezuur op door vortexing.
    2. Voeg voor oplossing B 1 mL ijskoud water toe aan 70 mg ammonium heptamolybdaat tetrahydraat en Vortex om op te lossen.
      Opmerking: Bewaar beide oplossingen op ijs tot het gebruik. Voor de consistentie van het testresultaat kunnen beide oplossingen maximaal één week op ijs worden opgeslagen.
  3. Bereid de fosfaat (Pi) standaard met de concentratie van 0 μM, 62,5 μm, 250 μm en 500 μm voor kalibratie.
    1. Voeg 0 μL, 25 μL, 50 μL en 100 μL van 5 mM na2HPO4 dihydraat toe aan vier microbuisjes met 370 μl van het reactiemengsel.
    2. Top tot 1 mL met water.

4. activiteitstest voor 1 96 well plate

Opmerking: Zie afbeelding 1 voor de schematische workflow van de assay.

  1. Voeg 1 ml oplossing B toe aan 10 ml oplossing A, Meng door grondig en bewaar de oplossing op ijs.
    Opmerking: deze oplossing moet transparant en geel zijn. Houd de oplossing A + B op ijs gedurende ten minste 30 minuten vóór gebruik. Echter, gebruik de oplossing binnen 3 h als het slecht zal gaan na lange termijn opslag.
  2. Voeg met een multikanaalspipet 40 μL van 0 μM, 62,5 μM, 250 μM en 500 μM Pi standaard toe aan de buis stroken in drievat.
    Opmerking: het reactiemengsel met geen PIk toegevoegd zal worden gebruikt als een blanco.
  3. Voeg met een meerkanaalspipet 25 μL samengestelde oplossing toe aan de buis stroken.
    Opmerking: elke verbinding heeft drie verschillende concentraties in drievat wat voldoende is voor de initiële schatting van de halve maximale remmende concentratie (IC50). Voor een nauwkeurigere IC50 bepaling kunnen acht verschillende samengestelde concentraties worden gebruikt. Voor het niet-geremde enzym wordt de samengestelde oplossing vervangen door gelijke hoeveelheid water. Als positieve controles werden 2,5 μM, 25 μM en 250 μM van imidodifosfaat (IDP) natriumzout gebruikt.
  4. Voeg met behulp van een meerkanaalspipet 15 μL mPPase-oplossing mengsel toe aan de buisstrips (behalve aan de buizen die Pi -standaard bevatten).
  5. Sluit de buis stroken af met een zelfklevende afdichtings plaat. Snijd de afdichtings plaat om elke buis strook te scheiden.
  6. Pre-incuberen de monsters gedurende 5 min bij 71 °C. Plaats de monsters op het verwarmingsblok met een interval van 20 s tussen elke strook om het tijdverbruik tijdens de volgende stappen te minimaliseren.
  7. Open de zelfklevende afdichting voor elke strook. Voeg 10 μL van 2 mM Natriumpyrofosfaat dibasisch toe met behulp van een multikanaalspipet en meng door pipetteren op en neer gedurende 5 ×. Sluit de buis strook opnieuw met dezelfde afdichting.
    Opmerking: deze stap kan in eerste instantie moeilijk te bereiken zijn in 20 s; echter, het zal gemakkelijker worden na sommige assays.
  8. Incuberen bij 71 °C gedurende 5 min.
  9. Plaats de monsters op het koelapparaat met een interval van 20 s tussen elke strook. Laat ze 10 min afkoelen, maar Centrifugeer elke strook kort na 5 min afkoeling, gietwater druppels onder de afdichtings plaat, zet het terug naar het koelapparaat en verwijder de afdichting.
    Opmerking: het koelapparaat kan eenvoudig worden gemaakt door het plaatsen van een 96 goed PCR-plaat op een polystyreen Petri schaal (maat 150 mm × 15 mm) gevuld met water en bevroren gedurende ten minste 1 uur. Het apparaat moet ongeveer 5 minuten vóór het begin van de test uit de vriezer worden gehaald. Haal het koelapparaat niet uit het midden voordat u het monster afkoelt, omdat het het reactiemengsel blokkeert en de kleurontwikkeling belemmert.
  10. Voeg na 10 min van de koeling 60 μL oplossing A + B toe, Meng door pipetteren op en neer gedurende 5 × en houd de buis stroken op het koelapparaat gedurende 10 minuten.
  11. Voeg 90 μL van de arseniet citraat oplossing toe en houd gedurende ten minste 30 minuten op kamertemperatuur om een stabiele blauwe kleur te produceren.
    Let op: vanwege de toxiciteit moeten alle oplossingen die natrium arseniet bevatten, te allen tijde met extra verzorging worden behandeld. Zo moet de toevoeging van arseniet-citraatoplossing worden gedaan in een rook afzuigkap.
  12. Verdeel 180 μL van elk reactiemengsel in een heldere 96 goed polystyreen microplaat.
  13. Meet de extinctie van elke put bij 860 nm met behulp van een microplaat spectrofotometer.

5. resultaat analyse

  1. Gemiddelde van de triplicaten van elk monster en de Pi -normen. Vervolgens aftrekken met de blanco om het achtergrond signaal te elimineren.
  2. Maak een ijkcurve door het uitzetten van de extinctie (A860) waarden ten opzichte van de hoeveelheid Pi standaard (nmol) en voer een lineaire regressie uit om de trendlijn functie te verkrijgen met behulp van de volgende formule:
    Equation 1
  3. Bereken de fosfaat hoeveelheid (nmol) die vrijkomt uit de enzymatische reactie op basis van de bovenstaande lineaire regressie formule.
  4. Bereken de specifieke activiteit met behulp van de volgende formule:
    Equation 2
    waar NPi de hoeveelheid fosfaat is die vrijkomt uit de reactie (nmol), t is de reactietijd (min), en mTmPPase is de hoeveelheid zuivere tmppase die wordt gebruikt in de assay (mg).
  5. Bereken de procentuele activiteit voor elke concentratie van de remmer met behulp van de volgende formule:
    Equation 3
    waar saiis de specifieke activiteit van een monster met remmer en saun is de specifieke activiteit van de onbevangen monster.
  6. Bereken de logica50 (raming) en IC50 (raming) met een niet-lineaire regressie die past bij de 4-parameter dosis-responscurve met behulp van de volgende formule:
    Equation 4
    waar X is log van concentratie (μM), Y is activiteit (%), boven en onder zijn plateaus in dezelfde eenheid als Y (100% en 0%, respectievelijk), logica50 heeft dezelfde log eenheden als X, en Hill slope = helling factor of heuvel helling, die unitless is.
    Opmerking: de software (tabel met materialen) wordt gebruikt voor de montage. Gebruik de concentratie van 0,01 μM (in plaats van 0,00 μM) voor het monster zonder remmer, aangezien de logaritme van nul niet is gedefinieerd.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

In dit protocol werden acht verbindingen (1 − 8) getest (Figuur 2a) samen met IDP, een gemeenschappelijke remmer van pyrofosfatasen, als een positieve controle. Elke verbinding werd getest in drie verschillende concentraties (1 μM, 5 μM en 20 μM) in drievat. De workflow van de screening wordt afgebeeld in Figuur 1, beginnend bij monster-en reagens voorbereiding tot de extinctie meting bij 860 nm.

Aan het einde van dit protocol, na de toevoeging van oplossing A + B en arseniet citraat, ontwikkelen de oplossingen een stabiele blauwe kleur met de maximale absorptie bij 709 nm en 860 nm14 als gevolg van de complexe vorming van fosfaat ionen met molybdaat die kan worden waargenomen en toont het optreden van de enzymatische reactie. Voor dit experiment gebruiken we de extinctie bij 860 nm voor de meting van de Pi -hoeveelheid die wordt vrijgegeven omdat deze een betere detectielimiet en gevoeligheid heeft ten opzichte van de extinctie bij 709 nm15. De blauwe kleur is volledig ontwikkeld in 30 minuten incubatie bij kamertemperatuur en stabiel gedurende ten minste 5 h14. De test heeft de gevoeligheid tot Pi -concentratie van 10 μM en de extinctie is lineair over een concentratiebereik van 10 − 800 μm14. In het representatieve resultaat hier bevat Wells E1 − E3 (figuur 2c) het reactiemengsel zonder remmer en de blauwe oplossing kan aan het einde van de test worden waargenomen. Dit kan ook worden waargenomen bij lage samengestelde concentraties waarbij volledige remming niet is bereikt, zoals in Wells F1 − F3 voor IDP en Wells A4 − A6 voor compound 1 (ATC, een recentelijk bekende niet-concurrerende remmer van TmPPase9) bij de concentratie van 2,5 μm en 1 μm, respectievelijk. De hogere concentratie van IDP en compound 1, de minder tot geen blauwe kleur kan worden waargenomen (G1 − G3 en H1 − H3 voor IDP en B4 − B6 en C4 − C6 voor compound 1) die de remming van de enzymatische activiteit aangeven. Alle drie concentraties van niet-remmende verbindingen (2, 3en 8) weergegeven dezelfde blauwe kleurintensiteit als Wells E1 − E3 zonder enige remmer (figuur 2c).

Na de extinctie meting bij 860 nm kunnen de gegevens worden verwerkt en geanalyseerd (zie protocol rubriek 5). Figuur 2D toont het kalibratie-plot van Pi standaard met zijn lineaire fitting (y = 0.0576 x + 0,0019; r2 = 0,999). Figuur 3 toont het plot van enzymatische activiteit (%) tegen de concentratie van elke geteste stof. Voor verbindingen met remmings activiteit wordt ook een niet-lineaire curve fitting getoond. IDP, gebruikt als een positieve controle, toont duidelijk een afname van de activiteit bij hogere concentratie. De IC50 (schatting) berekend op basis van drie verschillende concentraties is 88,2 ΜM (tabel 1), wat vergelijkbaar is met de vorige meting (80,0 μM) met acht concentratie punten14. De verbindingen 1, 4, 5, 6en 7 vertoonden een vergelijkbare trend als IDP, aangezien de concentratie toenam met de IC50 (schatting) van ongeveer 1,3 μM, 7,4 μm, 19,0 μm, 37,4 μm en 156,1 μm, respectievelijk (tabel 1). Voor verbindingen 2, 3en 8 kan geen vermindering van de activiteit of remming worden waargenomen bij de concentraties van de assay. Een aanvullende test met acht concentratie punten kan worden gedaan om precieze IC50te genereren. Figuur 4 toont de remmings curve voor de verbindingen 1, 5, 6, 7 en 8 met een IC50 van 1,7 μm, 21,4 μm, 58,8 μM, 239,0 μm en > 500 μM, respectievelijk9.

Figure 1
Figuur 1: een schematische workflow van TmPPase remming assay in een 96 goed plaat formaat. De rode nummering toont de stappen van de assay volgens het protocol en de blauwe pijlen geven de interval volgorde weer. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 2
Figuur 2: monsters, hun opstelling en kleurontwikkeling in een 96 goed plaat. A) de structuren van de verbindingen 18 die voor de bepaling worden gebruikt. De remming activiteit van deze verbindingen is gemeld in Vidilaseris et al.9. B) de bemonsterings regeling. C) kleurontwikkeling, 30 min na toevoeging van arseniet-citraat oplossing. De concentraties van de controle remmer (IDP) en de gebruikte monsters, gerangschikt van boven naar beneden, zijn respectievelijk 2,5 μM, 25 μM en 250 μM en een concentratie van 1 μM, 5 μM en 20 μM. De intensiteit van de blauwe kleur komt overeen met dehoeveelheid P die wordt vrijgegeven als gevolg van de enzymatische reactie en het gebrek aan kleur komt overeen met geen enzymatische reactie. D) ijkcurve voor Pi -norm (nmol) tegen een860 met lineaire fitting (y = 0.0576 x + 0,0019; r2 = 0,999). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 3
Figuur 3: curve van de activiteit van TmPPase procent voor drie verschillende remmers concentraties. De niet-lineaire regressie curves voor de berekening van de IC50 (schatting) worden weergegeven voor IDP evenals voor verbindingen 1, 4, 5, 6 en 7 , maar niet voor verbindingen 2, 3en 8 omdat ze geen remming van tmppase activiteit bij de concentraties van de assay waren. De logica50 en IC50 (schatting) van elke verbinding wordt weergegeven in tabel 1. Alle gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD met drie replicaten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Figure 4
Figuur 4: Remmings curve van acht concentratie punten van verbindingen 1, 5, 6, 7 en 8. Dit cijfer is afkomstig van Vidilaseris et al.9 met lichte modificatie. Alle gegevens worden weergegeven als gemiddelde ± SD met drie replicaten. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Monster LogIC50 IC50 (schatting) (μM)
Idp 1,95 ± 0,0142 87,9 ± 2,46
1 0,112 ± 0,0274 1,29 ± 0,0816
2 geen remming
3 geen remming
4 0,870 ± 0,0447 7,39 ± 0,760
5 1,28 ± 0,0296 19,0 ± 1,29
6 1,57 ± 0,0846 37,4 ± 7,29
7 2,19 ± 0,366 156 ± 131
8 geen remming

Tabel 1: logica50 en IC50 (schatting) van IDP en verbindingen 1 − 8 op basis van de gegevens uit Figuur 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Hier rapporteren we een gedetailleerd protocol voor eenvoudige screening van remmers voor membraan-gebonden pyrofosfatase van T. maritima in een 96 goed plaat formaat op basis van Vidilaseris et al.14. Dit protocol is goedkoop en gebaseerd op 12-fosforolybdisch zuur, dat wordt gevormd uit ORTHOFOSFAAT en molybdaat onder zure omstandigheden en gereduceerd tot fosforolybdenum soorten met een duidelijke blauwe kleur12. Deze methode heeft de voorkeur boven andere protocollen, zoals de meer gevoelige Malachiet groene assay16, omdat deze methode geen interferentie vertonen in de aanwezigheid van hoge fosfolipide concentratie die nodig is voor TmPPase reactivatie14.

De workflow van het screening protocol wordt afgebeeld in Figuur 1 en dit proces kan volledig worden uitgevoerd in 1 uur. Dit protocol is geoptimaliseerd voor TmPPase met de optimale werktemperatuur bij 71 °C en een reactietijd van 5 min. Aangezien water bij deze temperatuur uit het reactiemengsel verdampte, wordt een zelfklevende afdichtings plaat (gesneden om te passen en bedekken van de strips) aangebracht om de verdamping te voorkomen14 en het verdampte water wordt eenvoudig opnieuw opgevangen met centrifugeren. De incubatietijd van 5 minuten wordt gekozen omdat deze nog steeds in het lineaire bereik van het enzymatisch vrijgegeven fosfaat ligt en voldoende is voor een betrouwbare screening14. In dit protocol zijn de timing-en Pipetteer vaardigheden belangrijke factoren om een goed en betrouwbaar resultaat te verkrijgen. Toevoeging van reagentia tijdens de test met 20 s interval tussen strips is een geoptimaliseerde timing optie voor het gemak van het uitvoeren van de volgende stappen.

Voor verschillende mPPases dient de optimale temperatuur en incubatietijd afzonderlijk te worden bepaald vóór gebruik in de remmings test. Het bovenstaande enzym reactivatie protocol is geoptimaliseerd voor TmPPase en andere mPPases hebben mogelijk een ander reactiveringsprotocol nodig. Bijvoorbeeld, DDM moet niet worden toegevoegd voor reactivering van mPPase van Pyrobaculum aerophilum omdat het zijn enzymatische activiteit17zal afnemen. Aangezien het enzym minder actief zal worden als het ruim van tevoren wordt bereid, moet de toevoeging van gereactiveerd enzym worden toegevoegd aan het reactiemengsel kort voordat de test wordt gestart. Na toevoeging van de arseniet-citraatoplossing is het reactieproduct stabiel gedurende ten minste 5 h14. Daarom kan de volgende batch van de assay onmiddellijk worden uitgevoerd, en de absorptie meting kan later naar alle batches tegelijk worden gedaan.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

Dit werk werd gesteund door de subsidies van de Jane en Aatos Erkko Foundation en de BBSRC (BB/M021610) aan Adrian Goldman, de Academie van Finland (nr. 308105) aan Keni Vidilaseris, (nr. 310297) aan Henri Xhaard, en (nr. 265481) aan Jari Yli-Kauhaluoma, en de studie fondsen van de Universiteit van Helsinki aan Gustav boije af Gennäs. De auteurs danken Bernadette Gehl voor haar technische hulp tijdens het project.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adhesive sealing sheet Thermo Scientific AB0558
Ammonium heptamolybdate tetrahydrate Merck F1412481 636
Ascorbic acid Sigma-Aldrich 95212-250G
BioLite 96Well Multidish Thermo Scientific 130188
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Merck 1167431000
8-well PCR Tube Strips 0.2 ml without caps (120) Nippon genetics FG-028
Dodecyl maltoside (DDM) Melford B2010-100G
Ethanol Merck 1009901001
Glacial acetic acid Merck 1000631011
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148-500ML
Imidodiphosphate sodium salt Sigma-Aldrich I0631-1G
L-α-Phosphatidyl choline from soybean lecithin Sigma 429415-100GM
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 8147330500
Multiplate 96-Well PCR Plates Bio-Rad MLL9651
MultiSkan Go Thermo Scientific 10680879
Nepheloskan Ascent (Type 750) Labsystems
Polystyrene Petri dish (size 150 mm x 15 mm) Sigma-Aldrich P5981-100EA
Potassium chloride Merck 104936
Prism 6 software GraphPad
QBT2 Heating block Grant Instruments
Sodium meta-arsenite Fisher Chemical 12897692
Sodium phosphate dibasic (Pi) Sigma S0876-1KG
Sodium pyrophosphate dibasic Fluka 71501-100G
Trisodium citrate dihydrate Fluka 71404-1KG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Terstappen, G. C., Reggiani, A. In silico research in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 22, (1), 23-26 (2001).
  2. Rask-Andersen, M., Almen, M. S., Schioth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, (8), 579-590 (2011).
  3. Shah, N. R., Vidilaseris, K., Xhaard, H., Goldman, A. Integral membrane pyrophosphatases: a novel drug target for human pathogens. AIMS Biophysics. 3, (1), 171-194 (2016).
  4. Baykov, A. A., Malinen, A. M., Luoto, H. H., Lahti, R. Pyrophosphate-Fueled Na+ and H+ Transport in Prokaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77, (2), 267-276 (2013).
  5. Serrano, A., Perez-Castineira, J. R., Baltscheffsky, M., Baltscheffsky, H. H+-PPases: yesterday, today and tomorrow. IUBMB Life. 59, (2), 76-83 (2007).
  6. Liu, J., et al. A vacuolar-H+-pyrophosphatase (TgVP1) is required for microneme secretion, host cell invasion, and extracellular survival of Toxoplasma gondii. Molecular Microbiology. 93, (4), 698-712 (2014).
  7. Lemercier, G., et al. A pyrophosphatase regulating polyphosphate metabolism in acidocalcisomes is essential for Trypanosoma brucei virulence in mice. Journal of Biological Chemistry. 279, (5), 3420-3425 (2004).
  8. Belogurov, G. A., et al. Membrane-bound pyrophosphatase of Thermotoga maritima requires sodium for activity. Biochemistry. 44, (6), 2088-2096 (2005).
  9. Vidilaseris, K., et al. Asymmetry in catalysis by Thermotoga maritima membrane-bound pyrophosphatase demonstrated by a nonphosphorus allosteric inhibitor. Science Advances. 5, (5), (2019).
  10. Lin, S. M., et al. Crystal structure of a membrane-embedded H+-translocating pyrophosphatase. Nature. 484, (7394), 399-403 (2012).
  11. Fiske, C. H., Subbarow, Y. The colorimetric determination of phosphorus. Journal of Biological Chemistry. 66, (2), 375-400 (1925).
  12. Nagul, E. A., McKelvie, I. D., Worsfold, P., Kolev, S. D. The molybdenum blue reaction for the determination of orthophosphate revisited: Opening the black box. Analytica Chimica Acta. 890, 60-82 (2015).
  13. Kellosalo, J., Kajander, T., Palmgren, M. G., Lopez-Marques, R. L., Goldman, A. Heterologous expression and purification of membrane-bound pyrophosphatases. Protein Expression and Purification. 79, (1), 25-34 (2011).
  14. Vidilaseris, K., Kellosalo, J., Goldman, A. A high-throughput method for orthophosphate determination of thermostable membrane-bound pyrophosphatase activity. Analytical Methods. 10, (6), 646-651 (2018).
  15. He, Z. Q., Honeycutt, C. W. A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 36, (9-10), 1373-1383 (2005).
  16. Martin, B., Pallen, C. J., Wang, J. H., Graves, D. J. Use of fluorinated tyrosine phosphates to probe the substrate specificity of the low molecular weight phosphatase activity of calcineurin. Journal of Biological Chemistry. 260, (28), 14932-14937 (1985).
  17. Strauss, J., Wilkinson, C., Vidilaseris, K., Harborne, S. P. D., Goldman, A. A simple strategy to determine the dependence of membrane-bound pyrophosphatases on K+ as a cofactor. Methods in Enzymology. 607, 131-156 (2018).
Screening voor <em>Thermotoga maritima</em> -membraan afhankelijke Pyrofosfatase remmers
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vidilaseris, K., Johansson, N. G., Turku, A., Kiriazis, A., Boije af Gennäs, G., Yli-Kauhaluoma, J., Xhaard, H., Goldman, A. Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors. J. Vis. Exp. (153), e60619, doi:10.3791/60619 (2019).More

Vidilaseris, K., Johansson, N. G., Turku, A., Kiriazis, A., Boije af Gennäs, G., Yli-Kauhaluoma, J., Xhaard, H., Goldman, A. Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors. J. Vis. Exp. (153), e60619, doi:10.3791/60619 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter