Summary

Screening per inibitori di Pirofosofasi rilegati a Thermotoga

Published: November 23, 2019
doi:

Summary

Qui presentiamo un metodo di screening per gli inibitori di pyrophosphatase legati alla membrana (da Thermotoga maritima) basato sulla reazione blu molybdenum in un formato 96 pozzo piastra.

Abstract

I piifofosti legati alla membrana (mPPases) sono enzimi dimerici che si verificano nei batteri, negli arcai, nelle piante e nei parassiti protisti. Queste proteine si sciolgono il pirofosfato in due molecole di ortopofosde, che è accoppiato con protone e/o ione di sodio che pompa attraverso la membrana. Poiché non si verificano proteine omologhe negli animali e negli esseri umani, gli mPPasi e sono buoni candidati nella progettazione di potenziali bersagli farmacologici. Qui presentiamo un protocollo dettagliato per lo screening per gli inibitori mPPase utilizzando la reazione blu molybdenum in un sistema di piastra 96. Usiamo mPPase dal batterio termofilo Thermotoga maritima (TmPPase) come enzima modello. Questo protocollo è semplice ed economico, producendo un risultato coerente e robusto. Ci vuole solo circa un’ora per completare il protocollo di analisi dell’attività dall’inizio del saggio fino alla misurazione dell’assorbimento. Poiché il colore blu prodotto in questo saggio è stabile per un lungo periodo di tempo, il saggio successivo può essere eseguito immediatamente dopo il lotto precedente e l’assorbimento può essere misurato in un secondo momento per tutti i lotti contemporaneamente. Lo svantaggio di questo protocollo è che è fatto manualmente e quindi può essere estenuante così come richiedono buone abilità di pipettaggio e di mantenimento del tempo. Inoltre, la soluzione arsenite-citrate utilizzata in questo saggio contiene arsenite di sodio, che è tossico e deve essere maneggiato con le precauzioni necessarie.

Introduction

Circa il 25% del totale delle proteine cellulari sono proteine di membrana e circa il 60% di esse sono bersagli farmacologici1,2. Uno dei potenziali bersagli farmacologici3, pirofofosasi legati alla membrana (mPPases), sono enzimi dimero che pompano protone e/o ione di sodio attraverso la membrana da idrolisi di piofosfato in due ortoposfati4. mPPases può essere trovato in vari organismi5 come batteri, archea, piante e parassiti protisti, con l’eccezione di esseri umani e animali4. Nei parassiti protisti, per esempio Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii e Trypanosoma brucei, mPPases sono essenziali per la virulenza del parassita6 e knockout di questa espressione nei parassiti portano al fallimento nel mantenimento del pH intracellulare dopo l’esposizione al pH di base esterno7. A causa della loro importanza e della mancanza di proteine omologhe presenti nei vertebrati, mPPases può essere considerato come potenziali bersagli farmacologici per le malattie protische3.

Lo screening in vitro degli inibitori di mPPase in questo lavoro si basa su un sistema modello TmPPase. TmPPase è un mPPasi dipendente dagli ioni di sodio e ioscio da T. maritima e ha la sua attività ottimale a 71 gradi centigradi8. I benefici di questo enzima sono ad esempio la sua facilità di produzione e purificazione, una buona stabilità termica e un’elevata attività specifica. TmPPase mostra sia un’elevata somiglianza oltre alla completa conservazione della posizione, sia l’identità di tutti i residui catalitici al protista mPPases3,9 e la struttura risolta di Vigna radiata10 mPPase. Le strutture disponibili di TmPPase in diverse conformazioni sono utili anche per l’esperimento di progettazione di farmaci basati sulla struttura (come screening virtuale e progettazione de novo).

Qui segnaliamo un protocollo dettagliato per lo screening degli inibitori di TmPPase in un formato 96 ben piatto (Figura 1). Il protocollo si basa sul metodo colorimetrico della reazione blu molybdenum, che è stato sviluppato per la prima volta da Fiske e Subbarow11. Questo metodo comporta la formazione di 12-ciclomolistici da ortopofosfato e molybdate in condizioni acide, che viene poi ridotto per dare caratteristiche specie di fosfomilybdenum di colore blu12.

Protocol

1. Preparazione delle proteine NOTA: l’espressione e la purificazione di TmPPase è stata descritta altrove13. Preparare 10 mL della soluzione di buffer di riattivazione contenente 20 mM 2-(N-morpholino)ethanesulfonico acid (MES) pH 6.5, 3,5% (v/v) glicerol, 2 mM dithiothreitol (DTT) e 0,05% dodecyl maltoside (DDM). Preparare 10 mL della miscela di reazione contenente 200 mM Tris-Cl pH 8.0, 8,0 mM MgCl2, 333 mM KCl e 67 mM NaCl.<b…

Representative Results

In questo protocollo, sono stati testati otto composti (Figura 2A) insieme a IDP, un inibitore comune di pirofofosofasi, come controllo positivo. Ogni composto è stato testato in triplice copia a tre diverse concentrazioni (1 M, 5 M e 20 M) in triplice copia. Il flusso di lavoro dello screening è illustrato nella Figura 1, a partire dalla preparazione del campione e del reagente fino alla misurazione dell’assorbimento a 860 nm. Alla…

Discussion

Qui riportiamo un protocollo dettagliato per lo screening semplice degli inibitori per la pirofosasi legata alla membrana da T. maritima in un formato 96 pozzo basato su Vidilaseris et al.14. Questo protocollo è poco costoso e basato su 12-acido fosforolismibdico, che è formato da ortopofosfato e molybdate in condizioni acide e ridotto a specie di fosfomilybdenum con un colore blu distinto12. Questo metodo è preferito rispetto ad altri protocolli, come il più s…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Questo lavoro è stato sostenuto dalle sovvenzioni della Jane and Aatos Erkko Foundation e della BBSRC (BB/M021610) ad Adrian Goldman, l’Accademia di Finlandia (n. 308105) a Keni Vidilaseris, (n. 310297) a Henri Xhaard, e (n. 265481) a Jari Yli-Kauhaluoma, e l’Università di Helsinki Fondi di Ricerca a Gustav Boije af Gennàs. Gli autori ringraziano Bernadette Gehl per il suo aiuto tecnico durante il progetto.

Materials

Adhesive sealing sheet Thermo Scientific AB0558
Ammonium heptamolybdate tetrahydrate Merck F1412481 636
Ascorbic acid Sigma-Aldrich 95212-250G
BioLite 96Well Multidish Thermo Scientific 130188
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Merck 1167431000
8-well PCR Tube Strips 0.2 ml without caps (120) Nippon genetics FG-028
Dodecyl maltoside (DDM) Melford B2010-100G
Ethanol Merck 1009901001
Glacial acetic acid Merck 1000631011
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148-500ML
Imidodiphosphate sodium salt Sigma-Aldrich I0631-1G
L-α-Phosphatidyl choline from soybean lecithin Sigma 429415-100GM
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 8147330500
Multiplate 96-Well PCR Plates Bio-Rad MLL9651
MultiSkan Go Thermo Scientific 10680879
Nepheloskan Ascent (Type 750) Labsystems
Polystyrene Petri dish (size 150 mm x 15 mm) Sigma-Aldrich P5981-100EA
Potassium chloride Merck 104936
Prism 6 software GraphPad
QBT2 Heating block Grant Instruments
Sodium meta-arsenite Fisher Chemical 12897692
Sodium phosphate dibasic (Pi) Sigma S0876-1KG
Sodium pyrophosphate dibasic Fluka 71501-100G
Trisodium citrate dihydrate Fluka 71404-1KG

References

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Vidilaseris, K., Johansson, N. G., Turku, A., Kiriazis, A., Boije af Gennäs, G., Yli-Kauhaluoma, J., Xhaard, H., Goldman, A. Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors. J. Vis. Exp. (153), e60619, doi:10.3791/60619 (2019).

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