Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Screening for Thermotoga Maritima membran bundne Pyrophosphatase hemmere

doi: 10.3791/60619 Published: November 23, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Her presenterer vi en screening metode for membran-bundet pyrophosphatase (fra Thermotoga Maritima) hemmere basert på molybden blå reaksjonen i en 96 brønn plateformat.

Abstract

Membran-bundet pyrophosphatases (mPPases) er dimeric enzymer som forekommer i bakterier, Archaea, planter, og protist parasitter. Disse proteinene Cleave geranylpyrofosfat i to ortofosfat molekyler, som er kombinert med proton og/eller natrium ion pumpe over membranen. Siden ingen homologe proteiner forekommer hos dyr og mennesker, mPPases er gode kandidater i utformingen av potensielle narkotika mål. Her presenterer vi en detaljert protokoll til skjermen for mPPase-hemmere utnytte molybden blå reaksjonen i en 96 brønn plate system. Vi bruker mPPase fra varmekjære bakterien Thermotoga Maritima (TmPPase) som en modell enzym. Denne protokollen er enkel og rimelig, og produserer et konsistent og robust resultat. Det tar bare en time å fullføre aktiviteten analysen protokollen fra starten av analysen til absorbansen måling. Siden den blå fargen som produseres i denne analysen er stabil i lang tid, etterfølgende analysen (e) kan utføres umiddelbart etter forrige batch, og absorbansen kan måles senere for alle partier på en gang. Ulempen med denne protokollen er at det er gjort manuelt, og dermed kan være utmattende, samt kreve gode ferdigheter av pipettering og tid å holde. Videre, den arsenite-citrate løsning som brukes i denne analysen inneholder natrium arsenite, som er giftig og bør håndteres med nødvendige forholdsregler.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Omtrent 25% av den totale cellulære proteiner er membran proteiner og ca 60% av dem er narkotika mål1,2. En av de potensielle stoffet mål3, membran-bundet Pyrophosphatases (mPPases), er dimeric enzymer som pumper proton og/eller natrium ion over membranen ved hydrolyse av geranylpyrofosfat i to orthophosphates4. mPPases kan finnes i ulike organismer5 som bakterier, Archaea, planter og protist parasitter, med unntak av mennesker og dyr4. I protist parasitter, for eksempel Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii og Trypanosoma brucei, mPPases er avgjørende for parasitten virulens6 og knockout av dette uttrykket i parasitter føre til svikt i å opprettholde intracellulære pH ved eksponering til den eksterne grunnleggende pH7. På grunn av deres viktighet og mangel på homologe protein tilstede i virveldyr, kan mPPases betraktes som potensielle narkotika mål for protistal sykdommer3.

Den in vitro screening av mPPase-hemmere i dette arbeidet er basert på en TmPPase modell system. TmPPase er et natrium ion pumping og kalium ion avhengig mPPase fra T. Maritima og har sin optimale aktivitet på 71 ° c8. Fordelene med dette enzymet er for eksempel dens lette i produksjon og rensing, god termisk stabilitet og høy spesifikk aktivitet. TmPPase viser både høy likhet i tillegg til fullstendig bevaring av stillingen samt identiteten til alle katalysatorer tilprotist mPPases og til den løste strukturen i Vigna radiata10 mPPase. De tilgjengelige strukturene i TmPPase i ulike konformasjonen er også nyttige for struktur BAS ert narkotika design eksperiment (som virtuell screening og de Novo design).

Her rapporterer vi en detaljert protokoll for screening av TmPPase-hemmere i en 96 brønn plateformat (figur 1). Protokollen er basert på fargemetrisk metoden for molybden blå reaksjon, som først ble utviklet av fiske og Subbarow11. Denne metoden innebærer dannelse av 12-phosphomolybdic syre fra ortofosfat og molybdat under Sure forhold, som deretter reduseres for å gi karakteristiske blå-fargede phosphomolybdenum arter12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. protein forberedelse

Merk: uttrykket og rensing av TmPPase har blitt beskrevet andre steder13.

  1. Klargjør 10 mL av bufferløsningen for reaktivering som inneholder 20 mM 2-(N-morpholino) ethanesulfonic syre (Mes) pH 6,5, 3,5% (v/v) glyserol, 2 mm DITHIOTREITOL (DTT) og 0,05% natriumdodecylsulfat MALTOSIDE (DDM).
  2. Forbered 10 mL av reaksjonsblandingen som inneholder 200 mM Tris-CL pH 8,0, 8,0 mM MgCl2, 333 mm KCl og 67 mm NaCl.
    Merk: mg2 + er nødvendig for å chelate geranylpyrofosfat som substrat for MPPase, K+ er nødvendig for å øke enzymaktiviteten som TmPPase er en kalium avhengig mPPase, og na+ er nødvendig for enzymet aktivitet under natrium ion translokasjon av TmPPase.
  3. Klargjør 30 mg/mL liposomer for reaktivering av enzym.
    1. Tilsett 10 mL 20 mM Tris-HCl pH 8,0 med 1 mM DTT til 0,3 g av L-α-phosphatidylcholine fra soyabønner til 10 mL 20 mM Tris-HCl pH 8,0 med 1 mM DTT.
    2. Sett liposome på is, og sonikere med 1 sekund puls intervall i 1 minutt, pause i 1 minutt, og gjenta til løsningen blir gjennomsiktig gul.
    3. Alikvot liposomer, fryse i flytende nitrogen og oppbevar ved-80 ° c til brukt.
  4. Reaktivere enzymet.
    1. Bland 40 μL av liposomer oppløsningen med 22,5 μL 20% DDM.
    2. Varm opp blandingen ved 55 ° c i 15 min og la den avkjøles til romtemperatur.
    3. Tilsett 36,5 μL av bufferløsningen for reaktivering, bland og tilsett 1 μL konsentrert protein (13 mg/mL) for å lage en total konsentrasjon på 0,13 mg/mL.
      Merk: protein er vanligvis frosset i 10 μL alikvoter etter rensing og tint på is før bruk.
  5. Ta 20 μL av reaktivert enzym og tilsett til 1 480 μL av reaksjonsblandingen, deretter bland forsiktig.
    Merk: tillegg av reaktivert enzymet til reaksjonsblandingen bør utføres like før den brukes.

2. sammensatte forberedelser

  1. Oppløse forbindelsene i dimethyl sulfoxide (DMSO) for å lage lager løsninger på 25 − 100 mM i 50-200 μL, basert på tilgjengeligheten av forbindelsene.
    Merk: alle forbindelser som brukes her (figur 2A) har blitt publisert tidligere9. Hvis den sammensatte løselighet er lav, kan lager konsentrasjonen justeres tilsvarende.
  2. Forbered tre ulike konsentrasjoner av hver sammensatte i vann.
    Merk: de endelige konsentrasjonene i reaksjonsblandingen vil være 1, 5 og 50 micromolar eller 1, 5 og 20 micromolar for henholdsvis oppløselige og sparsomt løselige forbindelser.
    1. Fortynne lager løsningen med vann til 1 mL i mikrorør for å gi 2 μM, 10 μM og 100 μM for løselige forbindelser, eller alternativt 2 μM, 10 μM og 40 μM for sparsomt løselige forbindelser.
    2. Vortex den sammensatte løsningen umiddelbart etter fortynning av lager løsningen for riktig miksing.
  3. Se etter sammensatt aggregering ved hjelp av en nephelometer.
    Merk: Dette ble studert som triplicates i tre konsentrasjoner (1 μM, 5 μM og 20 μM) og normalisert til blank i en 96 brønn plate.
    1. Dispensere 75 μL av reaksjonsblandingen i hver brønn ved hjelp av en flerkanals pipette.
    2. Tilsett 75 μL av hver forbindelse (for blank, bruk 75 μL av vann i stedet) og bland ved pipettering opp og ned 5 ×.
    3. Mål hver brønn på 300 V ved hjelp av en mikroplate nephelometer.

3. reagenser for analyse tilberedning

  1. Forbered arsenite-citrate løsning.
    1. Veie 5 g natrium arsenite og 5 g Trisodium citrate dinatriumfosfatdihydrat.
      FORSIKTIG: natrium arsenite er giftig, og bruker derfor riktig verneutstyr og håndtak med spesiell forsiktighet. Som forholdsregel må du ikke håndtere før alle nødvendige sikkerhetsforanstaltninger er lest og forstått. Må kun håndteres i en avtrekks hette for ikke å inhalere støv/damper av forbindelsen eller løsningen (e). Ved innånding, flytte til frisk luft og få legehjelp. Bruk egnede kjemikalie vernebriller, vernehansker og klær for å unngå svelging og øye-/hudkontakt. Ved svelging, ring umiddelbart et giftinformasjonssenter eller lege. Hvis det blir på huden eller i øyet (e), vask med rikelig med vann og få legehjelp.
    2. Oppløses i 100 mL vann.
    3. Tilsett 5 mL av isbre eddiksyre, bland, og tilsett vann til 250 mL.
    4. Oppbevares ved romtemperatur beskyttet mot lys.
      Merk: løsningen er stabil i mer enn ett år.
  2. Klargjør løsning A og løsning B.
    1. For løsning A, tilsett 10 mL iskald 0,5 M HCl til 0,3 g av askorbinsyre. Oppløse askorbinsyre av virvlingen.
    2. For løsning B, tilsett 1 mL iskaldt vann til 70 mg ammonium heptamolybdate-tetrahydrat og Vortex å oppløse.
      Merk: Oppbevar begge løsningene på isen til den brukes. For konsistensen av analysen resultatet, kan begge løsninger lagres på isen i maksimalt en uke.
  3. Klargjør fosfat (Pi)-standarden med konsentrasjonen av 0 μM, 62,5 μm, 250 μm og 500 μm for kalibrering.
    1. Tilsett 0 μL, 25 μL, 50 μL og 100 μL 5 mM na2HPO4 dinatriumfosfatdihydrat til fire mikrorør inneholdende 370 μL av reaksjonsblandingen.
    2. Topp opp til 1 mL med vann.

4. aktivitet analysen for 1 96 brønn plate

Merk: se figur 1 for skjematisk arbeidsflyt av analysen.

  1. Tilsett 1 mL løsning B til 10 mL løsning A, bland ved virvlingen og oppbevar løsningen på isen.
    Merk: denne løsningen skal være transparent og gul. Hold løsningen A + B på isen i minst 30 min før bruk. Men bruk løsningen innen 3 h som det vil gå dårlig etter langtidslagring.
  2. Tilsett 40 μL av 0 μM, 62,5 μM, 250 μM og 500 μM Pi -standarden til rør strimlene i tre eksemplarer ved hjelp av en flerkanals pipette.
    Merk: reaksjonen blandingen uten Pjeg lagt vil bli brukt som en blank.
  3. Tilsett 25 μL av sammensatt løsning på rør strimlene ved hjelp av en flerkanals pipette.
    Merk: hver forbindelse har tre ulike konsentrasjoner i tre eksemplarer som er nok for første estimering av halv maksimal hemmende konsentrasjon (IC50). For en mer nøyaktig IC50 bestemmelse, kan åtte ulike sammensatte konsentrasjoner brukes. For det uhemmet enzymet erstattes den sammensatte løsningen med like mye vann. Som positive kontroller 2,5 μM, 25 μM og 250 μM av imidodiphosphate (IDP) natrium salt ble brukt.
  4. Tilsett 15 μL av mPPase løsnings blanding i rør strimlene (unntatt rørene som inneholder Pi -standarden) ved hjelp av en flerkanals pipette.
  5. Forsegle rør strimlene med en selvklebende tetningsplate. Skjær tetnings arket for å skille hver tube stripe.
  6. Forhånds ruge prøvene i 5 min ved 71 ° c. Plasser prøvene på varme blokken med 20 s intervall mellom hver stripe for å minimere tidsforbruket i løpet av de påfølgende trinnene.
  7. For hver stripe, åpne limet tetting. Tilsett 10 μL av 2 mM natrium geranylpyrofosfat dibasic ved hjelp av en flerkanals pipette og bland med pipettering opp og ned i 5 ×. Forsegle rør strimmelen igjen med samme tetting.
    Merk: dette trinnet kan i utgangspunktet være vanskelig å oppnå i 20 s; det vil imidlertid bli lettere etter noen analyser.
  8. Ruge ved 71 ° c i 5 min.
  9. Plasser prøvene på kjøle apparatet med 20 s intervall mellom hver stripe. La dem avkjøles i 10 min, men sentrifuger hver stripe kort etter 5 min av kjøling, til Dekanter vanndråper under tetnings arket, og deretter sette den tilbake til kjøle apparatet og fjerne tetting.
    Merk: kjøle apparatet kan enkelt gjøres ved å plassere en 96 brønn PCR plate på en polystyren Petri parabol (størrelse 150 mm × 15 mm) fylt med vann og frosset i minst 1 time. Apparatet skal tas ut fra fryseren ca 5 min før begynnelsen av analysen. Ikke ta ut kjøle apparatet rett før prøvekjøling som det vil fryse reaksjonsblandingen og hindre farge utvikling.
  10. Etter 10 min kjøling, tilsett 60 μL av oppløsning A + B, bland ved pipettering opp og ned i 5 × og holde rør strimler på kjøle apparatet i 10 min.
  11. Tilsett 90 μL av arsenite-citrate løsning og hold i romtemperatur i minst 30 min for å produsere en stabil blå farge.
    FORSIKTIG: på grunn av sin toksisitet, bør alle oppløsninger som inneholder natrium arsenite håndteres med ekstra forsiktighet til enhver tid. Således, tilsetning av arsenite-citrate løsning bør gjøres i en avtrekks hette.
  12. Dispensere 180 μL av hver reaksjons blanding til en klar 96 brønn polystyren mikroplate.
  13. Mål absorbansen av hver brønn på 860 NM ved hjelp av en mikroplate spektrofotometer.

5. resultat analyse

  1. Gjennomsnittlig triplicates av hver prøve og Pjeg standarder. Deretter subtrahere med blank for å eliminere bakgrunns signal.
  2. Lag en kalibrerings kurve ved å plotte absorbansen (A860) verdier mot mengden Pi standard (nmol) og utføre en lineær regresjon for å få trendlinje funksjonen ved hjelp av følgende formel:
    Equation 1
  3. Beregn fosfat beløpet (nmol) ut fra enzymatisk reaksjonen basert på den lineære regresjon formelen ovenfor.
  4. Beregn den spesifikke aktiviteten ved hjelp av følgende formel:
    Equation 2
    hvor nPjeg er mengden av fosfat frigitt fra reaksjonen (nmol), t er reaksjonstiden (min), og mTmPPase er mengden av den rene TmPPase som brukes i analysen (mg).
  5. Beregn prosent aktiviteten for hver hemmer konsentrasjon ved hjelp av følgende formel:
    Equation 3
    der sajeger denspesifikke aktiviteten til en prøve med inhibitor og saun er den spesifikke aktiviteten av uhemmet prøven.
  6. Beregn logikken50 (estimat) og IC50 (estimat) med en ikke-lineær regresjon passer fra den fire parameteren dose-svar-kurve ved hjelp av følgende formel:
    Equation 4
    der X er Logg av konsentrasjon (μM), Y er aktivitet (%), topp og bunn er vidder i samme enhet som Y (100% og 0%, henholdsvis), logIC50 har samme logg enheter som X, og skråning = stigningstallet faktor eller bakkeskråningen, som er unitless.
    Merk: programvare (tabell av materialer) brukes til montering. Bruk konsentrasjonen av 0,01 μM (i stedet for 0,00 μM) for prøven uten inhibitor som logaritmen for null er ikke definert.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I denne protokollen ble åtte forbindelser (1 − 8) testet (figur 2a) sammen med IDP, en felles hemmer av pyrophosphatases, som en positiv kontroll. Hver forbindelse ble testet ved tre forskjellige konsentrasjoner (1 μM, 5 μM og 20 μM) i tre eksemplarer. Arbeidsflyten for screening er avbildet i figur 1, med start fra prøve-og reagens forberedelser til absorbansen målingen ved 860 NM.

På slutten av denne protokollen, etter tilsetning av løsningen A + B og arsenite-citrate, løsningene utvikle en stabil blå farge med maksimal absorpsjon ved 709 NM og 860 NM14 på grunn av kompleks dannelse av fosfat ioner med molybdat som kan observeres og viser forekomsten av enzymatisk reaksjon. For dette eksperimentet, bruker vi absorbansen på 860 NM for måling av Pjeg beløpet sluppet som den har bedre deteksjon grense og følsomhet i forhold til absorbansen på 709 NM15. Den blå fargen er fullt utviklet i 30 min av inkubasjons ved romtemperatur og stabil i minst 5 t14. Analysen har følsomheten ned til Pi konsentrasjonen av 10 μM og absorbansen er lineær over et konsentrasjons område på 10 − 800 μM14. I det representative resultatet her inneholder brønner E1 − E3 (figur 2C) reaksjonsblandingen uten hemmer, og den blå løsningen kan observeres på slutten av analysen. Dette kan også observeres ved lave sammensatte konsentrasjoner hvor fullstendig hemming ikke er nådd, som i brønner F1 − F3 for IDP og brønner a4-a6 for sammensatte 1 (ATC, en nylig kjent utkonkurrert-hemmer av TmPPase9) ved konsentrasjonen av 2,5 μM og 1 μM, henholdsvis. Den høyere konsentrasjonen av IDP og sammensatte 1, den mindre til ingen blå farge kan observeres (G1 − G3 og H1 − H3 for IDP og B4 − B6 og C4 − C6 for sammensatte 1) som indikerer hemming av enzymatisk aktivitet. Alle tre konsentrasjoner av ikke-hemmende forbindelser (2, 3og 8) viste samme blå farge intensitet som brønner E1 − E3 uten inhibitor (figur 2C).

Etter absorbansen måling ved 860 NM, kan dataene behandles og analyseres (se protokoll avsnitt 5). Figur 2D viser kalibrerings plottet Pi standard med sin lineære montering (y = 0.0576 x + 0,0019; r2 = 0,999). Figur 3 viser plottet av enzymatisk aktivitet (%) mot konsentrasjonen av hver testet sammensatte. For forbindelser med hemming aktivitet, en ikke-lineær kurve montering er også vist. IDP, brukes som en positiv kontroll, viser tydelig en nedgang i aktivitet ved høyere konsentrasjon. IC50 (estimat) beregnet basert på tre ulike konsentrasjoner er 88,2 ΜM (tabell 1), som er lik forrige måling (80,0 μM) med åtte konsentrasjons punkter14. Forbindelser 1, 4, 5, 6og 7 VISTE en lignende trend som IDP siden konsentrasjonen økte med IC50 (estimat) på ca 1,3 μM, 7,4 μm, 19,0 μM, 37,4 μM og 156,1 μm, henholdsvis (tabell 1). For forbindelser 2, 3og 8 ingen reduksjon i aktivitet eller hemming kan observeres ved analysen konsentrasjoner. En ekstra analysen med åtte konsentrasjon poeng kan gjøres for å generere presise IC50. Figur 4 viser hemming kurve for forbindelser 1, 5, 6, 7 og 8 med en IC50 på 1,7 μM, 21,4 μm, 58,8 μm, 239,0 μm og > 500 μM, henholdsvis9.

Figure 1
Figur 1: en skjematisk arbeidsflyt av TmPPase hemming analysen i en 96 brønn plateformat. Den røde nummereringen viser trinnene i analysen i henhold til protokollen, og de blå pilene viser intervall rekkefølgen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: prøver, deres ordning og farge utvikling i en 96 brønn plate. (A) strukturene i forbindelsene 18 som brukes til analysen. Hemming aktiviteten av disse forbindelsene er rapportert i Vidilaseris et al.9. (B) eksempel ordning. (C) farge utvikling, 30 min etter tilsetning av arsenite-citrate løsning. Konsentrasjonen av kontroll hemmer (IDP) og prøver som brukes, arrangert fra toppen til bunnen, er 2,5 μM, 25 μM og 250 μM konsentrasjon og 1 μM, 5 μM og 20 μM konsentrasjon, henholdsvis. Intensiteten av den blå fargen tilsvarer mengden av Pjeg sluppet på grunn av enzymatisk reaksjon og mangelen på farge tilsvarer ingen enzymatisk reaksjon. (D) kalibrerings kurve for Pi standard (nmol) mot en860 med lineær tilpassing (y = 0.0576 x + 0,0019; r2 = 0,999). Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: kurve for TmPPase prosent aktivitet for tre ulike hemmer konsentrasjoner. De ikke-lineære regresjon kurver å beregne IC50 (estimat) er vist for IDP samt for forbindelser 1, 4, 5, 6 og 7 , men ikke for forbindelser 2, 3og 8 som de ikke var hemme TmPPase aktivitet på analysen konsentrasjoner. LogIC50 og IC50 (estimat) for hver forbindelse vises i tabell 1. Alle data vises som gjennomsnittet ± SD med tre replikerer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: hemming kurve fra åtte konsentrasjon poeng av forbindelsene 1, 5, 6, 7 og 8. Dette tallet er Hentet fra Vidilaseris et al.9 med liten modifikasjon. Alle data vises som gjennomsnittet ± SD med tre replikerer. Vennligst klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Eksempel LogIC50 KI-50 (estimat) (μM)
Idp 1,95 ± 0,0142 87,9 ± 2,46
1 0,112 ± 0,0274 1,29 ± 0,0816
2 ingen hemming
3 ingen hemming
4 0,870 ± 0,0447 7,39 ± 0,760
5 1,28 ± 0,0296 19,0 ± 1,29
6 1,57 ± 0,0846 37,4 ± 7,29
7 2,19 ± 0,366 156 ± 131
8 ingen hemming

Tabell 1: LogIC50 og IC50 (estimat) av IDP og forbindelser 1 − 8 basert på dataene fra Figur 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Her rapporterer vi en detaljert protokoll for enkel screening av hemmere for membran-bundet pyrophosphatase fra T. Maritima i en 96 brønn plateformat basert på Vidilaseris et al.14. Denne protokollen er billig og basert på 12-phosphomolybdic syre, som dannes fra ortofosfat og molybdat under Sure forhold og redusert til phosphomolybdenum arter med en distinkt blå farge12. Denne metoden foretrekkes fremfor andre protokoller, for eksempel mer følsom malakitt grønn analysen16, fordi denne metoden ikke viser interferens i nærvær av høy fosfolipid konsentrasjon som er nødvendig for TmPPase reaktivering14.

Arbeidsflyten i screening-protokollen er avbildet i figur 1 , og denne prosessen kan oppnås fullt ut i 1 time. Denne protokollen er optimalisert for TmPPase med optimal arbeidstemperatur ved 71 ° c og en 5 min reaksjonstid. Ettersom vannet fordamper ved denne temperaturen fra reaksjonsblandingen, påføres en selvklebende tetningsplate (skiver for å passe og dekke strimler) for å hindre fordampning14 og fordampet vann er rett og slett recollected med sentrifugering. De 5 min inkubasjonstid er valgt som det fortsatt er i den lineære rekkevidden av enzymatisk sluppet fosfat og tilstrekkelig for pålitelig screening14. I denne protokollen er timing og pipettering ferdigheter viktige faktorer for å oppnå et godt og pålitelig resultat. Tilsetning av reagenser under analysen med 20 s intervall mellom strimler er en optimalisert timing alternativ for enkel å utføre de påfølgende trinnene.

For ulike mPPases, optimal temperatur og inkubasjonstid bør fastsettes separat før bruk i hemming analysen. Det enzym reaktivere protokollen over er optimert for TmPPase og annet mPPases kunne nød en annerledes reaktivere protokollen. For eksempel bør DDM ikke legges for reaktivering av mPPase fra Pyrobaculum aerophilum som det vil redusere sin enzymatisk aktivitet17. Som enzymet vil bli mindre aktive hvis forberedt i god tid, tillegg av reaktivert enzym bør legges til reaksjonsblandingen kort tid før analysen er igangsatt. Etter tilsetning av arsenite-citrate løsning er reaksjons produktet stabilt i minst 5 t14. Derfor kan neste batch av analysen utføres umiddelbart, og absorbansen måling kan gjøres senere til alle partier samtidig.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd fra Jane og langgong Erkko Foundation og BBSRC (BB/M021610) til Adrian Goldman, Academy of Finland (nr. 308105) til Keni Vidilaseris, (nr. 310297) til Henri Xhaard, og (nr. 265481) til Jari Yli-Kauhaluoma, og Universitetet i Helsingfors Forskningsfond til Gustav Boije AF Gennäs. Forfatterne takker Bernadette Gehl for sin tekniske hjelp i løpet av prosjektet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adhesive sealing sheet Thermo Scientific AB0558
Ammonium heptamolybdate tetrahydrate Merck F1412481 636
Ascorbic acid Sigma-Aldrich 95212-250G
BioLite 96Well Multidish Thermo Scientific 130188
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Merck 1167431000
8-well PCR Tube Strips 0.2 ml without caps (120) Nippon genetics FG-028
Dodecyl maltoside (DDM) Melford B2010-100G
Ethanol Merck 1009901001
Glacial acetic acid Merck 1000631011
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148-500ML
Imidodiphosphate sodium salt Sigma-Aldrich I0631-1G
L-α-Phosphatidyl choline from soybean lecithin Sigma 429415-100GM
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 8147330500
Multiplate 96-Well PCR Plates Bio-Rad MLL9651
MultiSkan Go Thermo Scientific 10680879
Nepheloskan Ascent (Type 750) Labsystems
Polystyrene Petri dish (size 150 mm x 15 mm) Sigma-Aldrich P5981-100EA
Potassium chloride Merck 104936
Prism 6 software GraphPad
QBT2 Heating block Grant Instruments
Sodium meta-arsenite Fisher Chemical 12897692
Sodium phosphate dibasic (Pi) Sigma S0876-1KG
Sodium pyrophosphate dibasic Fluka 71501-100G
Trisodium citrate dihydrate Fluka 71404-1KG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Terstappen, G. C., Reggiani, A. In silico research in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 22, (1), 23-26 (2001).
  2. Rask-Andersen, M., Almen, M. S., Schioth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, (8), 579-590 (2011).
  3. Shah, N. R., Vidilaseris, K., Xhaard, H., Goldman, A. Integral membrane pyrophosphatases: a novel drug target for human pathogens. AIMS Biophysics. 3, (1), 171-194 (2016).
  4. Baykov, A. A., Malinen, A. M., Luoto, H. H., Lahti, R. Pyrophosphate-Fueled Na+ and H+ Transport in Prokaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77, (2), 267-276 (2013).
  5. Serrano, A., Perez-Castineira, J. R., Baltscheffsky, M., Baltscheffsky, H. H+-PPases: yesterday, today and tomorrow. IUBMB Life. 59, (2), 76-83 (2007).
  6. Liu, J., et al. A vacuolar-H+-pyrophosphatase (TgVP1) is required for microneme secretion, host cell invasion, and extracellular survival of Toxoplasma gondii. Molecular Microbiology. 93, (4), 698-712 (2014).
  7. Lemercier, G., et al. A pyrophosphatase regulating polyphosphate metabolism in acidocalcisomes is essential for Trypanosoma brucei virulence in mice. Journal of Biological Chemistry. 279, (5), 3420-3425 (2004).
  8. Belogurov, G. A., et al. Membrane-bound pyrophosphatase of Thermotoga maritima requires sodium for activity. Biochemistry. 44, (6), 2088-2096 (2005).
  9. Vidilaseris, K., et al. Asymmetry in catalysis by Thermotoga maritima membrane-bound pyrophosphatase demonstrated by a nonphosphorus allosteric inhibitor. Science Advances. 5, (5), (2019).
  10. Lin, S. M., et al. Crystal structure of a membrane-embedded H+-translocating pyrophosphatase. Nature. 484, (7394), 399-403 (2012).
  11. Fiske, C. H., Subbarow, Y. The colorimetric determination of phosphorus. Journal of Biological Chemistry. 66, (2), 375-400 (1925).
  12. Nagul, E. A., McKelvie, I. D., Worsfold, P., Kolev, S. D. The molybdenum blue reaction for the determination of orthophosphate revisited: Opening the black box. Analytica Chimica Acta. 890, 60-82 (2015).
  13. Kellosalo, J., Kajander, T., Palmgren, M. G., Lopez-Marques, R. L., Goldman, A. Heterologous expression and purification of membrane-bound pyrophosphatases. Protein Expression and Purification. 79, (1), 25-34 (2011).
  14. Vidilaseris, K., Kellosalo, J., Goldman, A. A high-throughput method for orthophosphate determination of thermostable membrane-bound pyrophosphatase activity. Analytical Methods. 10, (6), 646-651 (2018).
  15. He, Z. Q., Honeycutt, C. W. A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 36, (9-10), 1373-1383 (2005).
  16. Martin, B., Pallen, C. J., Wang, J. H., Graves, D. J. Use of fluorinated tyrosine phosphates to probe the substrate specificity of the low molecular weight phosphatase activity of calcineurin. Journal of Biological Chemistry. 260, (28), 14932-14937 (1985).
  17. Strauss, J., Wilkinson, C., Vidilaseris, K., Harborne, S. P. D., Goldman, A. A simple strategy to determine the dependence of membrane-bound pyrophosphatases on K+ as a cofactor. Methods in Enzymology. 607, 131-156 (2018).
Screening for <em>Thermotoga Maritima</em> membran bundne Pyrophosphatase hemmere
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vidilaseris, K., Johansson, N. G., Turku, A., Kiriazis, A., Boije af Gennäs, G., Yli-Kauhaluoma, J., Xhaard, H., Goldman, A. Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors. J. Vis. Exp. (153), e60619, doi:10.3791/60619 (2019).More

Vidilaseris, K., Johansson, N. G., Turku, A., Kiriazis, A., Boije af Gennäs, G., Yli-Kauhaluoma, J., Xhaard, H., Goldman, A. Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors. J. Vis. Exp. (153), e60619, doi:10.3791/60619 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter