Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Biochemistry

Screening för Thermotoga maritima membran-bundna Pyrofosfatashämmare

doi: 10.3791/60619 Published: November 23, 2019
* These authors contributed equally

Summary

Här presenterar vi en screeningmetod för membran bunden pyrofosfatas (från Thermotoga maritima) hämmare baserat på molybden blå reaktionen i en 96 väl plåtformat.

Abstract

Membran-bundna pyrofoshataser (mppases) är dimeriskt enzymer som förekommer i bakterier, Archaea, växter, och protistiska parasiter. Dessa proteiner klyva pyrofosfat i två ortofosfat molekyler, som är tillsammans med Proton och/eller natrium Jon pumpar över membranet. Eftersom inga homolog proteiner förekommer hos djur och människor är Mppaser bra kandidater i utformningen av potentiella läkemedelsmål. Här presenterar vi ett detaljerat protokoll till Screen för mPPase hämmare utnyttjar molybden blå reaktionen i en 96 väl plattan system. Vi använder mPPase från den termofila bakterien Thermotoga maritima (tmppase) som ett modell enzym. Detta protokoll är enkelt och billigt, vilket ger ett konsekvent och robust resultat. Det tar bara ungefär en timme att slutföra den Activity assay Protocol från början av analysen tills absorbans mätningen. Eftersom den blå färgen som produceras i denna analys är stabil under en lång tidsperiod, kan efterföljande analys (er) utföras omedelbart efter den föregående omgången, och absorbansen kan mätas senare för alla partier på en gång. Nackdelen med detta protokoll är att det görs manuellt och därmed kan vara ansträngande samt kräver god kompetens för pipettering och tidhållning. Vidare, den arsenite-citrat lösning som används i denna analys innehåller natriumarsenit, som är giftigt och bör hanteras med nödvändiga försiktighetsåtgärder.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Cirka 25% av de totala cellulära proteinerna är membranproteiner och omkring 60% av dem är drog mål1,2. En av de potentiella drogen mål3, membran-bundna pyrofoshataser (mppases), är dimeriskt enzymer som pumpar Proton och/eller natrium Jon över membranet genom hydrolys av pyrofosfat i två ortofosfat4. Mppaser kan hittas i olika organismer5 såsom bakterier, Archaea, växter, och protistiska parasiter, med undantag för människor och djur4. I protist parasiter, till exempel Plasmodium falciparum, Toxoplasma gondii och Trypanosoma rhodesiense, mppases är viktiga för parasiten virulens6 och knockout av detta uttryck i parasiterna leda till misslyckande i att upprätthålla intracellulära pH vid exponering för den yttre grundläggande pH7. På grund av deras betydelse och brist på homolog protein som finns i ryggradsdjur, kan Mppaser betraktas som potentiella läkemedelsmål för protistal sjukdomar3.

In vitro-screening av Mppashämmare i detta arbete är baserad på ett TmPPase-modellsystem. TmPPase är en natrium Jon pumpning och kalium Jon beroende mPPase från T. maritima och har sin optimala aktivitet vid 71 ° c8. Fördelarna med detta enzym är till exempel dess lätthet i produktion och rening, bra termisk stabilitet och hög specifik aktivitet. Tmppase visar både en hög likhet utöver det fullständiga bevarandet av positionen samt identiteten hos alla katalytiska rester till de protistiska mppases3,9 och den lösta strukturen av Vigna radiata10 mppase. De tillgängliga strukturerna för TmPPase i olika konformationer är också användbara för strukturbaserade läkemedel design experiment (som virtuell screening och de Novo design).

Här rapporterar vi ett detaljerat protokoll för screening av Tmppashämmare i en 96 väl plåtformat (figur 1). Protokollet är baserat på den kolorimetriska metoden i den molybdenblå reaktionen, som först utvecklades av fiske och Subbarow11. Denna metod innebär bildandet av 12-phosphomolybdic syra från ortofosfat och molybdat under sura förhållanden, som sedan reduceras för att ge karakteristiska blå-färgade foshomolybdenum arter12.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. protein beredning

Anmärkning: uttrycket och reningen av TmPPase har beskrivits någon annanstans13.

  1. Bered 10 mL av reaktiveringsbuffertlösningen som innehåller 20 mM 2-(N-morpholino) ETANSULFONSYRA (MES) pH 6,5, 3,5% (v/v) glycerol, 2 mm ditiothreitol (dTT) och 0,05% dodecylgallat maltosid (DDM).
  2. Förbered 10 mL reaktionsblandningen som innehåller 200 mM Tris-cl pH 8,0, 8,0 mM MgCl2, 333 mm KCL och 67 mm NaCl.
    Anmärkning: mg2 + krävs för att kelat pyrofosfat som substrat för mppase, K+ krävs för att öka enzymaktiviteten som tmppase är en kalium beroende mppase, och na+ behövs för enzymaktiviteten under natrium Jon flyttning av tmppase.
  3. Bered 30 mg/mL liposomer för enzym reaktivering.
    1. Tillsätt 10 mL 20 mM Tris-HCl pH 8,0 med 1 mM DTT till 0,3 g L-α-fosfatidylkolin från sojabönor till 10 mL 20 mM Tris-HCl pH 8,0 med 1 mM DTT.
    2. Sätt Liposom på is, och Sonikera med 1 sekunders puls intervall för 1 minut, pausa i 1 minut, och upprepa tills lösningen blir transparent gul.
    3. Alikvot liposomer, frysa i flytande kväve och förvara vid-80 ° c tills den används.
  4. Återaktivera enzymet.
    1. Blanda 40 μL av liposomlösningen med 22,5 μL 20% DDM.
    2. Värm blandningen vid 55 ° c i 15 min och låt den svalna till rumstemperatur.
    3. Tillsätt 36,5 μL av reaktiveringsbuffertlösningen, blanda och tillsätt 1 μL koncentrerat protein (13 mg/mL) för att göra en total koncentration på 0,13 mg/mL.
      Anmärkning: protein är vanligtvis fryst i 10 μL alikvoter efter rening och tinat på is före användning.
  5. Ta 20 μL av det återaktiverade enzymet och tillsätt 1 480 μL av reaktionsblandningen och blanda sedan försiktigt.
    Anmärkning: tillägget av det återaktiverade enzymet till reaktionsblandningen bör utföras precis innan det används.

2. sammansatt beredning

  1. Lös upp föreningarna i dimetylsulfoxid (DMSO) för att göra lagerlösningar av 25 − 100 mM i 50 − 200 μL, baserat på tillgången på föreningarna.
    Anmärkning: alla föreningar som används här (figur 2A) har publicerats tidigare9. Om den sammansatta lösligheten är låg kan lager koncentrationen justeras i enlighet med detta.
  2. Bered tre olika koncentrationer av varje förening i vatten.
    Anmärkning: de slutliga koncentrationerna i reaktionsblandningen kommer att vara 1, 5 och 50 mikromolära eller 1, 5 och 20 mikromolar för lösliga och sparsamt lösliga föreningar, respektive.
    1. Späd stamlösningen med vatten till 1 mL i mikrorör för att ge 2 μM, 10 μM och 100 μM för lösliga föreningar, alternativt 2 μM, 10 μM och 40 μM för sparsamt lösliga föreningar.
    2. Vortex den sammansatta lösningen omedelbart efter spädning av stamlösningen för korrekt blandning.
  3. Kontrollera om sammansatta aggregering med en Nephelometer.
    Anmärkning: detta studerades som tripletter i tre koncentrationer (1 μm, 5 μm och 20 μm) och normaliserades till den tomma i en 96 väl tallrik.
    1. Fördela 75 μL av reaktionsblandningen i varje brunn med hjälp av en multikanalpipett.
    2. Tillsätt 75 μL av varje förening (för blind, Använd 75 μL vatten istället) och blanda genom att Pipettera upp och ner 5 ×.
    3. Mät varje brunn vid 300 V med en mikroplattans Nephelometer.

3. reagenser för beredning av analysen

  1. Bered arsenite-citratlösningen.
    1. Väg 5 g natriumarsenit och 5 g Trinatriumcitratdihydrat.
      FÖRSIKTIGHET: Natriumarsenit är giftigt, på så sätt använda lämplig skyddsutrustning och hantera med särskild omsorg. Som försiktighetsåtgärd, inte hantera innan alla nödvändiga säkerhetsåtgärder har lästs och förstått. Handtaget får endast hanteras i en draghuv för att inte inandas damm/ångor från föreningen eller dess lösning (ar). Vid inandning, flytta till frisk luft och få läkarvård. Använd lämpliga kemikalie skyddsglasögon, skyddshandskar och kläder för att undvika förtäring och ögon-/hudkontakt. Vid förtäring, ring genast GIFTINFORMATIONSCENTRAL eller läkare. Om det blir på huden eller i ögat (s), tvätta med mycket vatten och få läkarvård.
    2. Lös i 100 mL vatten.
    3. Tillsätt 5 mL koncentrerad ättiksyra, blanda och tillsätt vatten till 250 mL.
    4. Förvaras i rumstemperatur skyddat från ljus.
      Obs: lösningen är stabil i mer än ett år.
  2. Bered lösning A och lösning B.
    1. För lösning A, tillsätt 10 mL iskall 0,5 M HCl till 0,3 g askorbinsyra. Lös askorbinsyran genom vortexing.
    2. För lösning B, tillsätt 1 mL iskallt vatten till 70 mg ammoniumheptamolybdate tetrahydrat och Vortex för att lösa upp.
      Obs: Förvara båda lösningarna på is tills de används. För konsekvens av analysresultatet kan båda lösningarna lagras på is i högst en vecka.
  3. Bered fosfat (Pi)-standarden med koncentrationen 0 μm, 62,5 μm, 250 μm och 500 μm för kalibrering.
    1. Tillsätt 0 μL, 25 μL, 50 μL och 100 μL 5 mM na2HPO4 -dihydrat till fyra mikrotuber innehållande 370 μl av reaktionsblandningen.
    2. Upp till 1 mL med vatten.

4. aktivitetsanalys för 1 96 bra skylt

Anm.: se figur 1 för analysens schematiska arbetsflöde.

  1. Tillsätt 1 ml lösning B till 10 ml lösning A, blanda genom vortexa och förvara lösningen på is.
    Obs: denna lösning ska vara transparent och gul. Förvara lösningen A + B på is i minst 30 minuter före användning. Emellertid, använda lösningen inom 3 h eftersom det kommer att gå dåligt efter långtidslagring.
  2. Tillsätt 40 μL av 0 μM, 62,5 μM, 250 μM och 500 μM Pi -standard till rör remsorna i tre exemplar med en multikanalpipett.
    Anmärkning: reaktionsblandningen med ingen Pjag La kommer att användas som en tom.
  3. Tillsätt 25 μL sammansatt lösning till rör remsorna med en multikanalpipett.
    Anmärkning: varje förening har tre olika koncentrationer i tre exemplar som är tillräckligt för en första uppskattning av den halva maximala inhibitoriska koncentrationen (IC50). För en noggrannare bestämning av IC50 kan åtta olika sammansatta koncentrationer användas. För det ohämmade enzymet ersätts den sammansatta lösningen med lika mycket vatten. Som positiva kontroller användes 2,5 μM, 25 μM och 250 μM av imidodifosfat (IDP) natriumsalt.
  4. Tillsätt 15 μL mPPase-lösningsblandning till rör remsorna (förutom rören som innehåller Pi -standard) med en multikanalpipett.
  5. Täta rör remsorna med ett självhäftande tätnings blad. Skär tätnings plåten för att separera varje rör remsa.
  6. Förinkubera proverna i 5 minuter vid 71 ° c. Placera proverna på värmeblocket med 20 s intervall mellan varje remsa för att minimera tidsåtgången under de efterföljande stegen.
  7. För varje remsa, öppna den adhesiva tätningen. Tillsätt 10 μl 2 mm natriumpyrofosfat dibasiskt med en multikanalpipett och blanda genom att Pipettera upp och ner för 5 ×. Täta rör remsan igen med samma tätning.
    Anmärkning: detta steg kan inledningsvis vara svårt att åstadkomma i 20 s; Det kommer dock att bli lättare efter några analyser.
  8. Inkubera vid 71 ° c i 5 min.
  9. Placera proverna på kylapparaten med 20 s intervall mellan varje remsa. Låt dem svalna i 10 min men Centrifugera varje remsa kort efter 5 min kylning, att dekanera vatten droppar under tätnings plåten, sedan lägga tillbaka den till kylapparaten och ta bort tätningen.
    Obs: kylapparaten kan enkelt göras genom att placera en 96 väl PCR-platta på en petriskål (storlek 150 mm × 15 mm) fylld med vatten och fryst i minst 1 h. Apparaten bör tas ut ur frysen ca 5 min före början av analysen. Ta inte ut kylapparaten rätt innan provet kylning eftersom det kommer att frysa reaktionsblandningen och hindra färgutveckling.
  10. Efter 10 minuters kylning, tillsätt 60 μL lösning A + B, blanda genom att Pipettera upp och ner för 5 × och håll rör remsorna på kylapparaten i 10 min.
  11. Tillsätt 90 μL av arsenite-citratlösningen och håll i rumstemperatur i minst 30 min för att producera en stabil blå färg.
    FÖRSIKTIGHET: på grund av dess toxicitet alla lösningar som innehåller natriumarsenit bör hanteras med extra omsorg hela tiden. Sålunda, tillsatsen av arsenite-citrat lösning bör göras i en draghuv.
  12. Fördela 180 μL av varje reaktionsblandning i en klar 96 väl polystyren mikroplatta.
  13. Mät absorbansen för varje brunn vid 860 nm med hjälp av en mikroplattspektrofotometer.

5. resultatanalys

  1. I genomsnitt tre exemplar av varje prov och Pi -standarderna. Subtrahera sedan med det tomma för att eliminera bakgrunds signalen.
  2. Gör en kalibreringskurva genom att plotta absorbansen (A860) värden mot mängden Pi standard (nmol) och utföra en linjär regression för att erhålla trendlinje funktionen med hjälp av följande formel:
    Equation 1
  3. Beräkna fosfat mängden (nmol) som frigörs från den enzymatiska reaktionen baserad på den linjära regressionsformeln ovan.
  4. Beräkna den specifika aktiviteten med hjälp av följande formel:
    Equation 2
    där NPi är den mängd fosfat som frigörs från reaktionen (nmol), t är reaktionstiden (min) och mtmppase är mängden ren tmppase som används i analysen (mg).
  5. Beräkna procent aktiviteten för varje hämmare koncentration med hjälp av följande formel:
    Equation 3
    där sajagär den specifika aktiviteten hos ett prov med inhibitor och saun är den specifika aktiviteten hos det ohämmade provet.
  6. Beräkna logiken50 (uppskattning) och IC50 (uppskattning) med en ickelinjära regression Fit från fyra-parameter dos-responskurva med hjälp av följande formel:
    Equation 4
    där X är log av koncentration (μM), Y är aktivitet (%), topp och botten är platåer i samma enhet som Y (100% och 0%, respektive), logik50 har samma logg enheter som X, och hillslope = lutning faktor eller backen lutning, som är unitless.
    Obs: programvara (tabell över material) används för montering. Använd koncentrationen 0,01 μM (i stället för 0,00 μM) för provet utan hämmare eftersom logaritmen av noll inte är definierad.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

I detta protokoll testades åtta föreningar (1 − 8) (figur 2A) tillsammans med IDP, en vanlig hämmare av pyrofoshataser, som en positiv kontroll. Varje förening testades vid tre olika koncentrationer (1 μM, 5 μM och 20 μM) i triplicate. Screeningens arbetsflöde avbildas i figur 1, med början från prov och REAGENSBEREDNING till absorbansmätningen vid 860 nm.

I slutet av detta protokoll, efter tillsats av lösning A + B och arsenite-citrat, lösningarna utveckla en stabil blå färg med maximal absorption vid 709 nm och 860 nm14 på grund av den komplexa bildandet av fosfat joner med molybdat som kan observeras och visar förekomsten av den enzymatiska reaktionen. För detta experiment använder vi absorbansen vid 860 Nm för mätning av Pi mängd släppt eftersom den har bättre detektionsgräns och känslighet jämfört med absorbansen vid 709 nm15. Den blå färgen är fullt utvecklad i 30 min av inkubering vid rumstemperatur och stabil i minst 5 h14. Analysen har känsligheten ner till Pi koncentration på 10 μm och absorbansen är linjär över ett koncentrationsintervall på 10 − 800 μm14. I det representativa resultatet här innehåller brunnar E1 − E3 (figur 2C) reaktionsblandningen utan hämmare och den blå lösningen kan observeras i slutet av analysen. Detta kan också observeras vid låga sammansatta koncentrationer där fullständig hämning inte har uppnåtts, som i brunnar F1 − F3 för IDP och Wells A4 − A6 för sammansatt 1 (ATC, en nyligen känd icke-konkurrenshämmande hämmare av TmPPase9) vid koncentrationen 2,5 μm respektive 1 μm. Den högre koncentrationen av IDP och sammansatta 1, desto mindre till ingen blå färg kan observeras (G1 − G3 och H1 − H3 för IDP och B4 − B6 och C4 − C6 för förening 1) indikerar hämning av den enzymatiska aktiviteten. Alla tre koncentrationerna av icke-hämmande föreningar (2, 3och 8) uppvisade samma blåa färgintensitet som brunnar E1 − E3 utan någon hämmare (figur 2C).

Efter absorbansmätningen vid 860 nm kan data bearbetas och analyseras (se protokoll avsnitt 5). Figur 2D visar kalibrerings profilen för Pi standard med dess linjära montering (y = 0.0576 x + 0,0019; r2 = 0,999). Figur 3 visar handlingen i enzymatisk aktivitet (%) koncentrationen av varje testad substans. För föreningar med inhibitionsaktivitet visas också en icke-linjär kurva passning. IDP, som används som en positiv kontroll, visar tydligt en minskning av aktiviteten vid högre koncentration. IC50 (uppskattning) beräknad utifrån tre olika koncentrationer är 88,2 ΜM (tabell 1), som liknar den tidigare mätningen (80,0 μm) med åtta koncentrations punkter14. Föreningarna 1, 4, 5, 6och 7 uppvisade en liknande tendens som IDP sedan koncentrationen ökade med IC50 (uppskattning) av cirka 1,3 μM, 7,4 μm, 19,0 μm, 37,4 μm respektive 156,1 μm (tabell 1). För föreningar 2, 3och 8 kan ingen minskning av aktivitet eller hämning observeras vid analyskoncentrationerna. En ytterligare analys med åtta koncentrations punkter kan göras för att generera exakt IC50. Figur 4 visar inhibitionskurvan för föreningar 1, 5, 6, 7 och 8 med en IC50 på 1,7 μm, 21,4 μm, 58,8 μm, 239,0 μm och > 500 μm, respektive9.

Figure 1
Figur 1: ett schematiskt arbetsflöde med TmPPase-hämningstest i 96-format. Den röda numreringen visar stegen i analysen enligt protokollet och de blå pilarna visar intervall ordningen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: prover, deras arrangemang och färgutveckling i en 96 väl tallrik. A) strukturerna för de föreningar 18 som används för analysen. Inhibitionsaktiviteten av dessa föreningar har rapporterats i Vidilaseris et al.9. B) prov arrangemang. C) färgutveckling, 30 min efter tillsats av arsenitecitratlösning. Koncentrationerna av kontroll hämmare (IDP) och prover som används, ordnade uppifrån och ned, är 2,5 μM, 25 μM och 250 μM koncentration och 1 μM, 5 μM och 20 μM koncentration, respektive. Intensiteten av den blå färgen motsvarar mängden Pjag släpptes på grund av den enzymatiska reaktionen och avsaknaden av färg motsvarar ingen enzymatisk reaktion. Dkalibreringskurva för Pi -standard (nmol) mot en860 med linjär koppling (y = 0.0576 x + 0,0019; r2 = 0,999). Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: kurva för aktiviteten av TmPPase-procent för tre olika inhibitratkoncentrationer. De ickelinjära Regressions kurvorna för beräkning av IC50 (uppskattning) visas för IDP samt för föreningar 1, 4, 5, 6 och 7 , men inte för föreningar 2, 3och 8 eftersom de inte hämmar tmppase-aktivitet vid analyskoncentrationerna. Logiken50 och IC50 (uppskattning) för varje förening visas i tabell 1. Alla data visas som medelvärde ± SD med tre replikat. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: hämning kurva från åtta koncentrations punkter av föreningar 1, 5, 6, 7 och 8. Denna siffra är tagen från Vidilaseris et al.9 med smärre modifiering. Alla data visas som medelvärde ± SD med tre replikat. Vänligen klicka här för att se en större version av denna siffra.

Prov LogIC50 IC50 (uppskattning) (μm)
Idp 1,95 ± 0,0142 87,9 ± 2,46
1 0,112 ± 0,0274 1,29 ± 0,0816
2 ingen hämning
3 ingen hämning
4 0,870 ± 0,0447 7,39 ± 0,760
5 1,28 ± 0,0296 19,0 ± 1,29
6 1,57 ± 0,0846 37,4 ± 7,29
7 2,19 ± 0,366 156 ± 131
8 ingen hämning

Tabell 1: logik50 och IC50 (uppskattning) av IDP och föreningar 1 − 8 baserat på data från figur 3.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Här rapporterar vi ett detaljerat protokoll för enkel screening av hämmare för membran bunden pyrofosfatas från T. maritima i en 96 väl plåtformat baserat på Vidilaseris et al.14. Detta protokoll är billigt och baserat på 12-phosphomolybdic syra, som bildas från ortofosfat och molybdat under sura förhållanden och reduceras till foshomolybdenum arter med en distinkt blå färg12. Denna metod är att föredra framför andra protokoll, såsom den känsligare Malakit grön analys16, eftersom denna metod inte visar inblandning i förekomsten av hög fosfolipid koncentration som krävs för TmPPase reaktivering14.

Arbetsflödet för screening protokollet avbildas i figur 1 och denna process kan åstadkommas fullt ut i 1 h. Detta protokoll är optimerat för TmPPase med optimal arbetstemperatur vid 71 ° c och 5 min reaktionstid. Eftersom vatten kommer att avdunsta vid denna temperatur från reaktionsblandningen, en adhesiv tätnings plåt (skivad för att passa och täcka remsorna) appliceras för att förhindra avdunstning14 och det avdunstade vattnet är helt enkelt minnas med centrifugering. Den 5 min inkubationstiden väljs eftersom det fortfarande är i det linjära området för det enzymatiskt släppta fosfat och tillräckligt för tillförlitlig screening14. I detta protokoll är timing och pipettering viktiga faktorer för att få ett bra och tillförlitligt resultat. Tillsats av reagenser under analysen med 20 s intervall mellan remsorna är ett optimerat timing alternativ för att underlätta utförandet av efterföljande steg.

För olika Mppaser bör den optimala temperaturen och inkubationstiden bestämmas separat före användning i inhibitionsanalysen. Enzymet reaktivering Protocol ovan är optimerad för tmppase och andra mppases kan behöva ett annat reaktivering Protocol. Till exempel ska DDM inte tillsättas för reaktivering av mPPase från Pyrobaculum aerophilum eftersom det kommer att minska dess enzymatiska aktivitet17. Eftersom enzymet kommer att bli mindre aktiv om de bereds i god tid, tillägg av återaktiveras enzym bör tillsättas reaktionsblandningen strax innan analysen initieras. Efter tillsats av arsenite-citratlösningen är reaktionsprodukten stabil i minst 5 h14. Därför kan nästa omgång av analysen utföras omedelbart, och absorbansmätningen kan göras senare till alla partier på en gång.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inget att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöddes av bidragen från Jane och Aatos Erkkos stiftelse och BBSRC (BB/M021610) till Adrian Goldman, Finlands Akademi (nr 308105) till Keni Vidilaseris, (nr 310297) till Henri Xhaard, och (nr 265481) till Jari Yli-Kauhaluoma, och Helsingfors universitets forskningsfonder till Gustav Boije af Gennäs. Författarna tackar Bernadette Gehl för hennes tekniska hjälp under projektet.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Adhesive sealing sheet Thermo Scientific AB0558
Ammonium heptamolybdate tetrahydrate Merck F1412481 636
Ascorbic acid Sigma-Aldrich 95212-250G
BioLite 96Well Multidish Thermo Scientific 130188
Dimethyl sulfoxide (DMSO) Merck 1167431000
8-well PCR Tube Strips 0.2 ml without caps (120) Nippon genetics FG-028
Dodecyl maltoside (DDM) Melford B2010-100G
Ethanol Merck 1009901001
Glacial acetic acid Merck 1000631011
Hydrochloric acid Sigma-Aldrich 258148-500ML
Imidodiphosphate sodium salt Sigma-Aldrich I0631-1G
L-α-Phosphatidyl choline from soybean lecithin Sigma 429415-100GM
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 8147330500
Multiplate 96-Well PCR Plates Bio-Rad MLL9651
MultiSkan Go Thermo Scientific 10680879
Nepheloskan Ascent (Type 750) Labsystems
Polystyrene Petri dish (size 150 mm x 15 mm) Sigma-Aldrich P5981-100EA
Potassium chloride Merck 104936
Prism 6 software GraphPad
QBT2 Heating block Grant Instruments
Sodium meta-arsenite Fisher Chemical 12897692
Sodium phosphate dibasic (Pi) Sigma S0876-1KG
Sodium pyrophosphate dibasic Fluka 71501-100G
Trisodium citrate dihydrate Fluka 71404-1KG

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Terstappen, G. C., Reggiani, A. In silico research in drug discovery. Trends in Pharmacological Sciences. 22, (1), 23-26 (2001).
  2. Rask-Andersen, M., Almen, M. S., Schioth, H. B. Trends in the exploitation of novel drug targets. Nature Reviews Drug Discovery. 10, (8), 579-590 (2011).
  3. Shah, N. R., Vidilaseris, K., Xhaard, H., Goldman, A. Integral membrane pyrophosphatases: a novel drug target for human pathogens. AIMS Biophysics. 3, (1), 171-194 (2016).
  4. Baykov, A. A., Malinen, A. M., Luoto, H. H., Lahti, R. Pyrophosphate-Fueled Na+ and H+ Transport in Prokaryotes. Microbiology and Molecular Biology Reviews. 77, (2), 267-276 (2013).
  5. Serrano, A., Perez-Castineira, J. R., Baltscheffsky, M., Baltscheffsky, H. H+-PPases: yesterday, today and tomorrow. IUBMB Life. 59, (2), 76-83 (2007).
  6. Liu, J., et al. A vacuolar-H+-pyrophosphatase (TgVP1) is required for microneme secretion, host cell invasion, and extracellular survival of Toxoplasma gondii. Molecular Microbiology. 93, (4), 698-712 (2014).
  7. Lemercier, G., et al. A pyrophosphatase regulating polyphosphate metabolism in acidocalcisomes is essential for Trypanosoma brucei virulence in mice. Journal of Biological Chemistry. 279, (5), 3420-3425 (2004).
  8. Belogurov, G. A., et al. Membrane-bound pyrophosphatase of Thermotoga maritima requires sodium for activity. Biochemistry. 44, (6), 2088-2096 (2005).
  9. Vidilaseris, K., et al. Asymmetry in catalysis by Thermotoga maritima membrane-bound pyrophosphatase demonstrated by a nonphosphorus allosteric inhibitor. Science Advances. 5, (5), (2019).
  10. Lin, S. M., et al. Crystal structure of a membrane-embedded H+-translocating pyrophosphatase. Nature. 484, (7394), 399-403 (2012).
  11. Fiske, C. H., Subbarow, Y. The colorimetric determination of phosphorus. Journal of Biological Chemistry. 66, (2), 375-400 (1925).
  12. Nagul, E. A., McKelvie, I. D., Worsfold, P., Kolev, S. D. The molybdenum blue reaction for the determination of orthophosphate revisited: Opening the black box. Analytica Chimica Acta. 890, 60-82 (2015).
  13. Kellosalo, J., Kajander, T., Palmgren, M. G., Lopez-Marques, R. L., Goldman, A. Heterologous expression and purification of membrane-bound pyrophosphatases. Protein Expression and Purification. 79, (1), 25-34 (2011).
  14. Vidilaseris, K., Kellosalo, J., Goldman, A. A high-throughput method for orthophosphate determination of thermostable membrane-bound pyrophosphatase activity. Analytical Methods. 10, (6), 646-651 (2018).
  15. He, Z. Q., Honeycutt, C. W. A modified molybdenum blue method for orthophosphate determination suitable for investigating enzymatic hydrolysis of organic phosphates. Communications in Soil Science and Plant Analysis. 36, (9-10), 1373-1383 (2005).
  16. Martin, B., Pallen, C. J., Wang, J. H., Graves, D. J. Use of fluorinated tyrosine phosphates to probe the substrate specificity of the low molecular weight phosphatase activity of calcineurin. Journal of Biological Chemistry. 260, (28), 14932-14937 (1985).
  17. Strauss, J., Wilkinson, C., Vidilaseris, K., Harborne, S. P. D., Goldman, A. A simple strategy to determine the dependence of membrane-bound pyrophosphatases on K+ as a cofactor. Methods in Enzymology. 607, 131-156 (2018).
Screening för <em>Thermotoga maritima</em> membran-bundna Pyrofosfatashämmare
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Vidilaseris, K., Johansson, N. G., Turku, A., Kiriazis, A., Boije af Gennäs, G., Yli-Kauhaluoma, J., Xhaard, H., Goldman, A. Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors. J. Vis. Exp. (153), e60619, doi:10.3791/60619 (2019).More

Vidilaseris, K., Johansson, N. G., Turku, A., Kiriazis, A., Boije af Gennäs, G., Yli-Kauhaluoma, J., Xhaard, H., Goldman, A. Screening for Thermotoga maritima Membrane-Bound Pyrophosphatase Inhibitors. J. Vis. Exp. (153), e60619, doi:10.3791/60619 (2019).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter