Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

استخدام الشعيرات الدموية المناعة الكهربائية للبحث عن المؤشرات الحيوية المحتملة للتصلب الجانبي الضموري في الصفائح الدموية البشرية

Published: February 10, 2020 doi: 10.3791/60638
Automatic Translation
1, 2, 3, 3, 3, 3, 3, 1
1Department of Basic Sciences, Kansas City University of Medicine and Biosciences, 2Rice University School of Medicine, 3University of Kansas Medical Center

Summary

المؤشرات الحيوية المستندة إلى الدم للأمراض العصبية التنكسية ضرورية لتنفيذ دراسات سريرية واسعة النطاق. يجب أن يتطلب اختبار الدم الموثوق به والمعتمد حجم عينة صغيرة وكذلك طريقة أخذ عينات أقل توغلًا ، بأسعار معقولة ، وقابلة للتكرار. توضح هذه الورقة أن الاختبارات المناعية للكهروفورية الشعرية عالية الإنتاجية تفي بمعايير تطوير العلامات البيولوجية المحتملة.

Abstract

أصبح الاختبارات المناعية للكهرفورسي الشعري (CEI) ، المعروف أيضًا باسم التكنولوجيا الغربية الشعرية ، طريقة اختيار لفحص البروتينات والأدوية ذات الصلة بالأمراض في التجارب السريرية. الاستنساخ، والحساسية، وحجم عينة صغيرة الشرط، متعددة xing الأجسام المضادة لوضع العلامات البروتين متعددة في نفس العينة، والقدرة الآلية عالية الإنتاجية لتحليل ما يصل إلى 24 عينات فردية، وشرط وقت قصير جعل CEI مفيدة على الكلاسيكية الغربية اللطخة المناعية. هناك بعض القيود على هذه الطريقة، مثل عدم القدرة على استخدام هلام التدرج (4٪-20٪) مصفوفة، خلفية عالية مع عينات بيولوجية غير مكررة، وعدم توافر الكواشف التجارية الفردية. تصف هذه الورقة طريقة فعالة لتشغيل CEI في إعداد عينات متعددة ، وتحسين تركيز البروتين ومعايرة الأجسام المضادة الأولية في لوحة واحدة للعينات ، وتوفير قوالب سهلة الاستخدام لإعداد العينة. كما وصفت طرق لقياس pan TDP-43 ومشتق TDP-43 الفوسفوري في تحلل الصفائح الدموية cytosol كجزء من المبادرة في تطوير المؤشرات الحيوية القائمة على الدم للأمراض العصبية.

Introduction

الهدف العام من CEI كما هو موضح هنا هو توفير بروتوكول تدريجي محدث لتحليل البروتينات المستهدفة في الصفائح الدموية البشرية. تعيين جزيء التوقيع القائم على الدم هي واحدة من أهم المهام في مجال تطوير العلامات الحيوية في الأمراض العصبية البشرية، مثل مرض الزهايمر (AD)، التصلب الجانبي الضموري (ALS)، لوبار الجبهي الصدغي انحطاط (FTLD), مرض باركنسون (PD), إدراج التهاب الجهاز العضلي (IBM), وغيرها من البروتين تجميع الظروف المرضية ذات الصلة. الكشف عن كميات دقيقة من هذه البروتينات التوقيع في كميات كبيرة من الدم مع العديد من العوامل التدخلية يشكل تحديا. ولذلك ، فإن خصوصية وحساسية والقدرة على التعامل مع عدد كبير من العينات ، واستنساخ الطريقة المحددة هي حاسمة.

الصفائح الدموية البشرية يمكن أن تكون بمثابة بيئة لتحديد وتعيين البروتينات البيولوجية المحتملة للأمراض العصبية. الصفائح الدموية توفر الفرصة لتكون بمثابة نموذج الخلية الأولية البديلة، والتي تعكس بعض ميزات الخلايا العصبية1،2،3. هناك بعض الميزات التي تجعل الصفائح الدموية واحدة من الوسائل المفضلة لتحليل البروتينات المرشحة العلامات الحيوية ومشتقاتها الكيميائية. أولاً، يمكن الحصول على الصفائح الدموية بسهولة باستخدام نهج أقل توغلاً من خلال جمع الدم من المتبرعين (أي الثقب الوريدي) أو بكميات كبيرة من بنوك الدم المجتمعية. ثانيا، يمكن بسهولة عزل الصفائح الدموية من الدم كله مع الحد الأدنى من الأعمال التحضيرية في مختبرات مجهزة الحد الأدنى4،5. ثالثا, الصفائح الدموية لا تحتوي على نواة; ولذلك، فهي خلية نموذج جيد لدراسة التعديلات في التمثيل الغذائي دون تنظيم النسخ. رابعا، يتم تغليف محتوى الجزيئات الحيوية من الصفائح الدموية. لذلك ، تحمي البيئة الدقيقة للصفائح الدموية محتوياتها من المواد المتدخلة في المصل (أي البروتياز). خامساً، يمكن تخزين البلازما الغنية بالصفائح الدموية في درجة حرارة الغرفة لمدة 7-8 أيام دون فقدان النشاط الأيضي. لذلك ، توفر الصفائح الدموية نموذج عمل يتم فيه تقليل العوامل الخارجية والتحكم فيها.

وتستخدم تقنيات المناعة التقليدية مثل النشاف المناعي (على سبيل المثال، النشاف الغربي) والفحص المناعي المرتبط بالإنزيم (ELISA) على نطاق أوسع في تحليل البروتين المحدد. ومع ذلك، فإن هاتين الطريقتين لهما العديد من العيوب، بما في ذلك خطوات القياس المتعددة، ومتطلبات المواد الكيميائية والكواشف الخطرة، وحجم العينة الكبير، ومشكلات إعادة النسخة القابلة للاستنساخ، وتباين البيانات بين المدى. وقد دفع ذلك إلى وضع طريقة أبسط مع خطوات أقل ويمكن تحقيقها في فترة قصيرة نسبياً. على الرغم من أن تقنية اللطخة الغربية الكلاسيكية ستظل طريقة مختبرية شائعة ، فإن إجراءاتها متعددة الخطوات والإمدادات والنفايات السامة (أي الأكريلاميد والميثانول وما إلى ذلك) ووقت التحليل أصبحت أقل جاذبية عند أداء كمية عالية الإنتاجية تحليل البروتين.

نهج CEI الآلي أصبح تدريجيا وسيلة اختيار للمختبرات التي تجري اختبارات البروتين عالية الإنتاجية6. CEI يلغي الحاجة إلى المواد الهلامية، وأجهزة إلجل الكهربائي، والأغشية، والكهربائي وأجهزة النقل الكهربائي، والمزيد من المشاركات التعامل المادي. إذا تم تصميمها بشكل جيد ، يجب إكمال فحص CEI في غضون 3.5 ساعة تقريبًا ، بما في ذلك تحليل البيانات الكمية ، والرسم الكهربائي لجودة النشر ، والرسوم البيانية مع التحليل الإحصائي. التفوق الآخر لنظام CEI هو متطلباته من تركيز البروتين 10x-20x أقل ، مما يجعله مثاليًا للاستخدام في العينات البشرية المستخدمة في التجارب السريرية7و8.

الجزء الأكثر أهمية من CEI هو تحسين شروط مقادير لكل الأجسام المضادة التي تم شراؤها من بائعين مختلفين ، ونوع الأجسام المضادة (أحادي النسيلة مقابل متعدد النسيلة) ، وتركيزات البروتين المثلى ، وإعداد العينة ، ودرجة حرارة التهيئة العينة ، والجهد الكهربائي المطبق على الشعيرات الدموية. لقد قمنا بتطوير طريقة تحسين تنسيق واحد للCEI التي يجب تنفيذها قبل أي مقالات جديدة ، والتي ستوفر الوقت والموارد. ويتبع خطوة التحسين هذه تقييم كمي آلي لكل من المشتق الكلي والفوسفوري من بروتين الحمض النووي/الحمض النووي الريبي الملزم (TARDP). نظرًا لحجمه (43 كيلو دا)، سيتم استخدام الاختصار TDP-43 في جميع أنحاء هذه الورقة. هنا، يتم تقييم البروتين TDP-43 في الصفائح الدموية البشرية التي تم الحصول عليها من المرضى ALS للمساعدة في تطوير قيمة الفوسفور التنبؤية (PPV) كعلامة بيولوجية تشخيصية محتملة.

TDP-43 هو مرشح جديد للعلامات البيولوجية المرض المحتملة لALS. TDP-43 هو بروتين في كل مكان في جميع الخلايا النواة. لذلك ، تم التحقيق في وظائف TDP-43 خلال مختلف الأحداث الخلوية العادية وفي الأمراض العصبية 9،10،11،12،13،14. على الرغم من أن TDP-43 هو بروتين نووي15، إلا أنه لديه القدرة على النقل داخل وخارج بين النواة والسيتوبلازم بسبب وجود التعريب النووي وتسلسل التصدير النووي16،17،18،19. وتشارك Cytoplasmic TDP-43 في مختلف الأحداث الخلوية، مثل استقرار مرنا والنقل، والاستجابة للإجهاد، وظيفة الميتوكوندريا، autophagosome20. ومع ذلك ، لا يعرف الكثير عن دور المشتقات الفوسفورية من TDP-43 بخلاف مشاركتها في الإمراض من الأمراض العصبية21.

يوضح هذا البروتوكول كيفية تحسين شروط التحليل لتحليل محتويات TDP-43 ومشتقاته الفوسفورية في الصفائح الدموية باستخدام نهج CEI. وبما أن الفوسفور TDP-43 غير متوفر تجارياً، فمن المقترح استخدام قيمة فوسفورية تنبؤية (PPV) لتقييم ملامح TDP-43 في مرضى ALS. يستخدم نظام CEI هذا كمية صغيرة من خليط العينة (2.5-3.0 ميكرولتر لكل شعرية). إجمالي إعداد حجم الخفض هو 8.0 ميكرولتر لكل شعرية استنادًا إلى بروتوكول الشركة المصنعة؛ وبالتالي ، يمكن للباحثين الاستفادة من إعداد خليط عينة واحدة لشوطين منفصلين. الشركة المصنعة تصميم بروتوكول الاقاضة بحيث يتم تصغير أي أخطاء الأنابيب، إن لم يتم القضاء عليها تماما. وتنقسم 24 مخاليط عينة الصفائح الدموية البشرية الفردية إلى نصف مجلدات (أي 2.5-3.0 ميكرولتر لكل عينة) وتحليلها على التوالي من قبل اثنين من الأجسام المضادة المختلفة في غضون حوالي 7 ساعة. ويوفر نظام الاستراتيجية الدولية للبيانات الموضح هنا طريقة إجراء إجراء عالية الإنتاجية مرغوبة. يحتاج المستخدمون إلى اختبار الأجسام المضادة من مختلف البائعين وطرق إعداد العينة للبروتين المستهدف قبل إجراء فحص واسع النطاق.

Protocol

جميع البروتوكولات المتعلقة بمعالجة الصفائح الدموية البشرية تتبع المبادئ التوجيهية لكل من جامعة كانساس المركز الطبي وجامعة كانساس سيتي للطب والعلوم البيولوجية لجان IRB.

1- إعداد المخازن المؤقتة والكواشف

ملاحظة: إعداد كافة العينات وفقاً للإرشادات الخاصة بالشركة المصنعة. ارتداء معدات الحماية الشخصية (معاطف المختبر والقفازات والنظارات الواقية) أثناء هذا الإجراء.

  1. إعداد مخزن غسيل سيترات عن طريق الجمع بين 0.941 غرام من السكروز (11 mM التركيز النهائي)، 6.4 مل من 5 M NaCl (128 mM النهائي)، 5.4 مل من 0.2 M NaH2PO4 (4.3 mM النهائي)، 9.4 مل من 0.2 M Na2PHO4 (7.5 mM النهائي)، 0.352 غرام من سترات الصوديوم (4.8 mM النهائي)، و 0.115 غرام من حمض الستريك (2.4 mM النهائي). ضبط الحجم الإجمالي إلى 250 مل مع ddH2O. تصفية من خلال قرص مرشح 0.45 ميكرومتر وضبط درجة الحموضة إلى 6.5. تخزين ما يصل إلى 1 سنة في 4 درجة مئوية. جلب درجة حرارة غرفة الحل (RT) قبل استخدام22.
  2. إعداد العازلة تمزق من خلال الجمع بين 250 mM السكروز، 1 mM EDTA، و 10 mM تريس-Cl (درجة الحموضة 7.4) في حجم نهائي 100 مل. تخزين ما يصل إلى 1 سنة في 4 درجة مئوية. أضف 2 ميكرولتر من كوكتيل مثبطات الفوفاتاتز (1:1000 نهائي) و1 ميكرولتر من البروتياز مثبطات كوكتيل (1:2000 نهائي) إلى 2 مل من العازلة تمزق. الحفاظ على الجليد حتى استخدام. تجاهل المخزن المؤقت تمزق غير المستخدمة.

2. عزل الصفائح الدموية

  1. جمع 8-10 مل من الدم البشري في أنبوب جمع الدم ذو الغطاء الأصفر الذي يحتوي على محلول حمض الـ citrate-dextrose (ACD) (75 mM trisodium citrate، 124 mM dextrose، و38 mM acid itric، pH = 7.4؛ ACD: الدم = 1:9). مزيج بلطف محتوى أنبوب 5x-6x عكس باليد.
  2. الطرد المركزي الأنابيب في 200 × ز في الدوار دلو يتأرجح لمدة 20 دقيقة في RT.
  3. جمع البلازما الغنية بالصفائح الدموية (~ 3-4 مل) في أنبوب قاع مخروطي 15 مل وترك ما يقرب من 0.5 مل من PRP من معطف باهي (جزء ضبابي المظهر) لتجنب التلوث. إذا حدث أي تلوث بخلايا الدم الحمراء، كرر هذه الخطوة.
  4. الطرد المركزي عينات PRP في 1200 × ز لمدة 15 دقيقة في RT.
  5. غسل كريات الصفائح الدموية (P1) عن طريق إعادة تعليق لطيف في 1 مل من العازلة غسل الجيترات وبيليه عن طريق الطرد المركزي في 1200 × ز لمدة 15 دقيقة في RT.
  6. حفظ بيليه الصفائح الدموية النقية. تجاهل السوبرناستانت.
  7. إعادة تعليق كريات الصفائح الدموية في 600 ميكرولتر من العازلة تمزق تحتوي على الكوكتيلات المانع.
  8. سونيكات تعليق الصفائح الدموية باستخدام سونيكاتور. ضع العينة في دلو ثلج صغير. تعيين sonicator في وضع 3 لمدة 20 ق في الوضع المستمر.
    ملاحظة: تأكد من تنظيف المسبار مع 10٪ التبييض تليها المياه المقطرة.
  9. الطرد المركزي العينات سونيكاتيد في 20،000 ز لمدة 30 دقيقة في 4 درجة مئوية لإزالة الكسور membranous. Aliquot supernatants في 60 ميكرولتر وتخزينها في -80 درجة مئوية. تجنب دورات الذوبان/التجميد المتكررة للكسور الدورية للصفائح الدموية.

3- التحضير لـ CEI

ملاحظة: تم الجمع بين 100 ميكرولتر من الصفائح الدموية البشرية من مرضى ALS (n = 8-10) ، وتم تجميع الموضوعات الصحية (n = 8-10) بشكل منفصل واستخدامها لتحسين التناول.

  1. ملء القوالب التي تم إنشاؤها داخليًا لتخطيط CEI(الجدول 1)وإعداد العينة(الجدول 2). جدول إعداد خليط العينة ديناميكي وسوف يحسب تلقائيًا مقدار الحجم الذي يجب إزالته من المصدر.
    ملاحظة: عند إدخال وحدة تخزين المصدر المطلوبة في جدول ديناميكي-2، سيتم حساب حجم المخزن المؤقت عينة 0.1 X تلقائياً.
  2. ما قبل التسمية 25 0.2 مل أنابيب PCR مع الشعيرات الدموية #1-#25 ووضعها في رف PCR. وضعت على الجليد.
  3. أنابيب الطرد المركزي الدقيقة قبل التسمية 0.6 مل: واحد لكل جسم مضاد أساسي والتخفيف (إذا لزم الأمر) لاستخدامها، واحد للمخزن العازلة عينة 0.1x، واحد لluminol-S/peroxide، وواحد لكل عينة ليتم تخفيفها (إذا لزم الأمر). وضعها على الجليد في رف أنبوب.
  4. أخرج مخزن العينة المؤقت، ومخزن الغسيل، ولوحة واحدة، وخرطوشة متوفرة في وحدة فصل CEI 12-230 kDa الرئيسية للفصل.
  5. من الثلاجة 4 درجة مئوية، أخرج العازلة تخفيف الأجسام المضادة، والأجسام المضادة الأولية، والأجسام المضادة الثانوية، لومينول، بيروكسيد الهيدروجين، وحزمة القياسية. ضع جميع الكواشف على الثلج، باستثناء الحزمة القياسية، والتي لا تزال في RT.
    ملاحظة: الكواشف من حزم القياسية هي lyophilized ومختومة مع غطاء احباط. وينبغي نسج هذه أسفل لفترة وجيزة باستخدام جهاز طرد مركزي صغير قبل فتح للحد من فقدان المنتج. لفتح، يمكن إما أن تكون مثقوبة أنابيب الكاشف بواسطة طرف ماصة أو انسحبت من الزاوية.
  6. لإعداد DTT 400 mM، إضافة 40 ميكرولتر من الماء المنزوع الأيونات إلى أنبوب واضح يحتوي على DTT.
  7. لإعداد 40 ميكرولتر من المزيج الرئيسي الفلوري 5x، أضف 20 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعينة 10x و20 ميكرولتر من محلول DTT المعد بسعة 400 مل إلى الأنبوب الوردي المنصوص عليه في العدة.
  8. لإعداد السلم biotinylated، إضافة 16 ميكرولتر من الماء الديالمتين، 2 ميكرولتر من 10x عينة عازلة، و 2 μL من إعداد 400 mM DTT الحل إلى الأنبوب الأبيض المقدمة في عدة. مزيج بلطف ونقل إلى أنبوب PCR 0.2 مل لdenaturing.
  9. إعداد 0.1x عينة عازلة عن طريق إضافة 1.5 ميكرولتر من 10x عينة عازلة و 148.5 ميكرولتر من المياه المنزوعة الأيونات إلى 0.6 مل أنبوب الطرد المركزي الصغير. دوامة لخلط ووضع هاوية على الجليد.
  10. إعداد تخفيف اتّهاب الأجسام المضادة المطلوبة. إضافة الأجسام المضادة المخفف في أحجام المعينة لكل أنبوب الطرد المركزي الصغيرة المسمى مسبقا. إذا كانت وحدات التخزين متطابقة، استخدم تقنية الأنابيب العكسية23؛ إذا لم يكن كذلك، قبل شطف تلميح ماصة قبل الاستغناء.
    ملاحظة: في هذا الاستنساب، تم استخدام الأجسام المضادة A-TDP-43 عموم وa-p (S409/410-2) TDP-43 الأجسام المضادة. تم استخدام الأجسام المضادة للERK للتحكم الداخلي للتأكد من أن مكونات الاختبارات تعمل.
  11. تنفيذ الأنابيب العكسي لتخفيف الأجسام المضادة على النحو المبين أدناه. بدلا ً من ذلك، يمكن العثور على معلومات إضافية في الأدب24.
    ملاحظة: يفضل عكس تقنية الأنابيب عند الاستغناء عن وحدات التخزين التسلسلية الصغيرة من الحلول23. توفر هذه التقنية بعض المزايا: (1) توفير حجم دقيق، (2) القضاء على رغوة الكاشف في فتحة الطرف، و(3) مثالية للحجم الصغير (<lt;5 μL) الكواشف، والحلول اللزجة، والحلول السطحية، والحلول ذات ضغط البخار العالي.
    1. وضع تلميح السليم في ماصة واضغط على المكبس وصولا الى المحطة الثانية (الخطوة -2). تزج طرف الأنابيب بضعة ملليمترات في الحل. الافراج عن المكبس ببطء لملء تلميح pipet مع الحل في حين أن تلميح لا يزال مغمورة في الحل. قم بإزالة الطرف من المحلول والمسه بلطف على حافة خزان الكاشف بحيث تتم إزالة السائل الزائد المتبقي على الجزء الخارجي من الطرف.
    2. الاستغناء عن الحل عن طريق الضغط على المكبس وصولا الى التوقف الأول (الخطوة - 1). لا تستغني عن الحل المتبقي في الطرف.
    3. إفراغ المحلول المتبقي في الطرف إلى خزان الكاشف عن طريق الضغط على المكبس إلى المحطة الثانية (الخطوة-2). الافراج عن المكبس إلى موقف جاهز للخطوة pipetting المقبل.
    4. إضافة الأجسام المضادة المطلوبة في وحدات التخزين المعينة لكل أنبوب microcentrifuge المسمى مسبقا(الجدول 1)لا قبل شطف تلميح pipet: إضافته مباشرة إلى المخفف ومسح تلميح عدة مرات لإزالة الأجسام المضادة. ضع الأنابيب على الثلج.
  12. لإعداد مزيج عينة CEI ، قم بتنفيذ الخطوات المذكورة أدناه لأنابيب PCR المسماة الغطاء # 2 من خلال cap # 25: هذا بنفس الترتيب كما يظهر في الجدول 1.
    1. فتح جميع الأنابيب، إضافة 1.6 μL aliquots من الفلورسنت 5x عينة عازلة لكل أنبوب باستخدام تقنية الأنابيب العكسي، ثم إغلاق كل أنبوب PCR على إضافة المخزن المؤقت 5x للحد من فقدان العينة.
    2. فتح جميع الأنابيب، إضافة 0.1x عينة المخزن المؤقت في وحدات التخزين المعينة في الجدول 2 إلى كل أنبوب، ثم إغلاق مباشرة بعد ذلك. إذا كانت وحدات التخزين متطابقة، استخدم تقنية الأنابيب العكسية. إذا لم يكن كذلك، قبل شطف تلميح pipet قبل الاستغناء عن 0.1x عينة عازلة.
    3. افتح جميع الأنابيب، أضف عينة من البروتين في المجلدات المعينة في الجدول 2 إلى كل أنبوب، ثم أغلق بعد ذلك مباشرة. إذا كانت وحدات التخزين متطابقة، استخدم تقنية الأنابيب العكسية. إذا لم يكن كذلك، قبل شطف تلميح pipet قبل الاستغناء عن 0.1x عينة عازلة.
    4. الطرد المركزي لفترة وجيزة جميع أنابيب PCR في جهاز طرد مركزي على مقاعد البدلاء (13،000 × ز لمدة 30 s)، وأنابيب PCR نفض الغبار / دوامة لخلط، ثم كرر الطرد المركزي.
    5. نقل جميع أنابيب PCR إلى cycler مع غطاء ساخن. عينات التشوه في درجة حرارة ومدة محددتين (أي 95 درجة مئوية لمدة 5 سنوات؛ 70 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة).
      ملاحظة: درجة حرارة التسخ والمدة تحتاج إلى تحسين للبروتين المستهدف.
    6. كرر الخطوة 3.12.4.
    7. عودة جميع أنابيب PCR إلى رف أنبوب ومكان على الجليد.
    8. خلال خطوة التسخ، وإعداد حل التنمية (1:1 luminol-S: بيروكسيد الحل)، ثم إضافة 200 ميكرولتر من luminol-S و 200 ميكرولتر من بيروكسيد. ضع على الثلج
    9. لتحميل لوحة CEI مملوءة مسبقًا بالعينة المعدة أعلاه ، قم بتوزيع الكواشف والعينات في لوحة العينات الموضحة في تخطيط العينات(الشكل 1). تجنب إدخال فقاعات الهواء.
      ملاحظة: إذا كانت وحدات التخزين والحل متطابقة، استخدم تقنية الأنابيب العكسي. إذا لم يكن كذلك، قبل شطف تلميح pipet قبل الاستغناء وعدم طرد ما تبقى في لوحة جيدا باستخدام علامة التبويب الثانية وقف على ماصة. قد تحتوي وحدة الفصل 12-230 كيلو دا على دليل تحميل لوحة مرمزة بالألوان. ضع هذا الدليل تحت اللوحة مع إضافة الكواشف والعينات إلى البئر ، مما يساعد بصريًا عند تحميل العينة. يمكن تنزيل دليل تحميل اللوحة من موقع الشركة على الويب أيضًا.
      1. في الصف E، إضافة 15 ميكرولتر من luminol: مزيج بيروكسيد إلى كل بئر.
        ملاحظة: من الناحية المثالية، قم بإعداد هذا الكاشف قبل الاستخدام مباشرة وإضافة إلى كل بئر. إذا لم يكن هذا مناسبًا ، فقد يتم إعداد هذا الخليط قبل 30 دقيقة من تحميل اللوحة.
      2. في الصف D، إلى D1 بشكل جيد، إضافة 10 ميكرولتر من ستريبتافيالدين-HRP.
      3. في الصف D، إلى الآبار D2-D25، أضف 10 ميكرولتر من الأجسام المضادة الثانوية المعينة.
      4. في الصف B، إلى كل بئر، إضافة 10 ميكرولتر من الأجسام المضادة المخفف.
      5. في الصف C، إلى C1 جيدا، إضافة 10 ميكرولتر من الأجسام المضادة المخفف.
      6. في الصف C، إلى الآبار C2-C25، أضف 10 ميكرولتر من الأجسام المضادة الأولية المعينة.
      7. في الصف A، إلى A1 جيدا، إضافة 5 ميكرولتر من سلم biotinylated من أنبوب PCR #1.
      8. في الصف A، إلى الآبار A2-A25، أضف 3 ميكرولتر من العينة، أنابيب PCR #2-#25 في الآبار المقابلة #2-#25.
      9. إضافة 500 ميكرولتر من مخزن الغسيل المؤقت إلى كل مخزن مؤقت غسل المعين جيدا.
      10. الطرد المركزي لوحة لمدة 5 دقيقة في 1000 × ز في RT.

Figure 1
الشكل 1: تخطيط الاسهاب. يمكن إجراء كل من الأجسام المضادة الأساسية وتحسين عينة البروتين المستهدف في فحص واحد. الشعيرات الدموية 2-7، 8-13، 14-19، و 20-24 تمثل تركيز البروتين المختلفة ومجموعة الأجسام المضادة الأولية. الشعيرات الدموية 25 يمثل السيطرة الإيجابية. تم استخدام الأجسام المضادة للERK. ومع ذلك، يمكن تضمين أي مراقبة إيجابية مناسبة. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

4. تنفيذ CEI على لوحة 1

  1. أولاً، قم بتشغيل محلل CEI(جدول المواد)ثم قم بتشغيل الكمبيوتر. فتح البرنامج(جدول المواد)
  2. توصيل محلل إلى النظام على الانترنت(جدول المواد). هذه هي خطوة ضرورية لجمع البيانات تشغيل لأغراض اطلاق النار المتاعب واستعادة البيانات.
  3. انقر على الأداة من القائمة العلوية اليسرى، ثم انقر فوق الاتصال. حدد الرقم التسلسلي للأداة الذي يظهر كقائمة منبثقة. انقر فوق الاتصال.
  4. حدد علامة التبويب"Assay"وحدد "جديد أو أُسِب" أو حدد قالبًا محفوظًا.
  5. معلمات مقاة الإدخال(الجدول 1)أو تعديل القالب حاليًا. حفظ اسم الملف وموقعه.
  6. تأكد من أن مؤشر اللون الأزرق الوامض في المحلل لا يزال أزرق صلبًا.
  7. المس الزر المعدني الفضي أعلى الباب البرتقالي لفتحه.
  8. قم بإزالة خرطوشة الشعيرات الدموية بعناية من عبوتها. أدخل خرطوشة الشعيرات الدموية كما هو موضح في بروتوكول الشركة المصنعة. إذا تم تثبيته بشكل صحيح، يتحول الضوء الداخلي إلى "أزرق".
  9. إزالة ختم واقية من لوحة الحسم. مراقبة بصريا الآبار المملوءة مسبقا لفقاعات الهواء. إذا لوحظ، البوب لهم مع طرف pipet صغيرة (طويلة رمح P10 تلميح pipet يعمل بشكل جيد).
  10. تحميل حامل لوحة عن طريق وضع لوحة الطرح وإغلاق الباب. في الكمبيوتر، انقر على زر البدء.
    1. ضع صينية الثلج التي تحتوي على الكواشف الحساسة لدرجة الحرارة والعينات في الظلام عند 4 درجة مئوية حتى تستعد لإعداد لوحة ثانية مملوءة مسبقًا.
    2. ترك الكواشف / لوازم في درجة حرارة الغرفة للصفيحة الثانية.

5. تنفيذ CEI على لوحة 2

ملاحظة: تم تعيين هذا لوحة لتحليل مستويات TDP-43 الفوسفورية.

  1. إزالة علبة الثلج التي يتم تخزينها في 4 درجة مئوية ووضعها على مقاعد البدلاء، 1 ساعة قبل الوقت المقدر الانتهاء من اللوحة الأولى. استرداد لوحة ثانية وخرطوشة.
  2. إعداد أي تخفيف الأجسام المضادة اللازمة للتشغيل الثاني وتخزينها على الجليد. إعداد الطازجة 1:1 luminol-S: محلول بيروكسيد (الخطوة 3.12.8 أعلاه).
  3. ريمك ولفترة وجيزة إعادة الطرد المركزي مزيج العينة والكواشف اللازمة لتحميل لوحة مملوءة مسبقا. تحميل اللوحة الثانية وفقا للشكل 1. تحميل a-p (S409-410-2) TDP-43 حل الأجسام المضادة في الآبار الصف C.
  4. عند اكتمال التشغيل الأول، تجاهل اللوحة الأولى والخرطوشة. إزالة خرطوشة ووضعها في حاوية حادة للتخلص منها. احتفظ بالملصقات من اللوحة والخرطوشة لأغراض مرجعية.
  5. أغلق ملف البرنامج وإعادة تحديد نفس القالب. سيتذكر البرنامج الإعدادات من التشغيل السابق. قم بإجراء أي تغييرات على التعليق التوضيحي حسب الحاجة (أي تغيير الجسم المضاد الأساسي).
  6. كرر الخطوات 4.8-4.10. وضع بعيدا جميع 12-230 كيلو دا الرئيسية فصل مجموعة الكواشف وحدة الكواشف واللوازم
  7. تجاهل اليسار أكثر من CEI عينة مزيج، تخفيف الأجسام المضادة، 0.1x عينة عازلة وluminol-S: بيروكسيد يمزج وفقا للوائح الجامعة.

6 - تحليل البيانات

  1. بمجرد اكتمال التشغيل، تأكد من إجراء فحوصات الجودة التالية.
    1. في البرنامج، حدد رمز إظهار المعايير وعلامة التبويب عرض الرسم البياني. تحقق من جميع الشعيرات الدموية الـ 25 للحصول على محاذاة الذروة لأحجام علامات الفلورسنت الداخلية. تصحيح الاختلالات عن طريق تحديد فرض قياسي أو النقر بزر الماوس الأيمن على الذروة غير الصحيحة ثم تحديد غير قياسي. قم بإجراء هذا الفحص لكل شعيرات شعرية جديدة.
    2. انقر على العينات ورمز العرض الواحد. حدد #1 الشعيرات الدموية (سلم biotinylated) في علامة التبويب التجربة. مراجعة التحالفات الذروة لعلامات الوزن الجزيئي. انقر على الذروة في عرض الرسم البياني وحدد إزالة الذروة، إذا تم اختيار غير صحيح من الذروة من قبل البرنامج.
      ملاحظة: على سبيل المثال، سوف يظهر السلم الحيوي 12-230 KDa قمم التحجيم في 12 كيلو دا، 40 كيلو طن، 66 كيلو دا، 116 كيلو د. سيكون التحجيم لقمم العينة غير صحيح إذا لم يتم تنفيذ هذه الخطوة وسيتم إنشاء نتائج غير دقيقة.
    3. عرض الفيلم الكهربائي وملاحظة إذا حدث أي هجرة غير طبيعية أثناء التشغيل.
    4. اشتقاق البيانات (على سبيل المثال، جدول القمم، بما في ذلك الوزن الجزيئي، ومنطقة الذروة، وارتفاع الذروة، والإشارة إلى الضوضاء [S/N]) حسب الحاجة لإجراء المزيد من العمليات الحسابية. هناك أدوات شرح الرسم البياني الموجودة في الزاوية العلوية اليمنى من إطار الرسم البياني لتوفير مزيد من المعلومات حول الرسم البياني.

Representative Results

تحسين تركيز البروتين الخلوي الصفائح الدموية ومعايرة الأجسام المضادة الأولية
من المهم إنشاء مجموعة ديناميكية خطية من البروتينات الدورية الصفائح الدموية في النسخة، لأن التغيرات في إشارة تتناسب بشكل مباشر مع التغيرات في البروتين في السيتوسول الصفائح الدموية. استخدام خليط الصفائح الدموية الكاملة في فحص قد يقلل من شدة إشارة البروتينات المستهدفة (TDP-43 و P (S409-412) TDP-43) والمساهمة في إشارة خلفية عالية. لذلك ، في هذا الطرح ، تم استخدام supernatant واضح (كسر دوري) بعد تمزق الصفائح الدموية(الشكل 2).

Figure 2
الشكل 2: يعتمد وضوح الإشارة على جودة العينة. (أ)كامل الصفائح الدموية المتجانس يتداخل مع مكافحة TDP-43 ملزمة الأجسام المضادة; لذلك ، لوحظ مخطط كهربي صاخبة. (ب)تم الحصول على كسر دوري صفائصف من إخضاع اللايسيت كله إلى الطرد المركزي (16,000 × ز لمدة 30 دقيقة). تمت إزالة معظم البروتينات الميمبرانية. وبالتالي ، تم تعزيز الأجسام المضادة TDP-43 الملزمة لبروتين TDP-43 (تتبع الخط الأزرق). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم إنشاء نطاق ديناميكي خطي لتركيز بروتين السيتول الصفائح الدموية في 0.2-0.8 ملغم/مل. تم اعتماد قالب مُقازبحيث يمكن إجراء كل من تركيز البروتين ومعايرة الأجسام المضادة الأولية في إجراء تحليل واحد(الشكل 3).

Figure 3
الشكل 3: النطاق الديناميكي الخطي لتركيز بروتين السيتوسول الصفائح الدموية. (أ)تم تحسين كل من تركيزات البروتين وتركيزات الأجسام المضادة في لوحة واحدة خلال نفس الشوط. (ب)تم إنشاء نطاق العمل الخطي (0.2-0.8 ملغم/مل) للبروتين. تم تصنيف حمولة بروتين 0.5 ملغم/مل بواسطة الأجسام المضادة A-ERK كتحكم إيجابي (الشعيرات الدموية 25). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تجدر الإشارة إلى أن محتوى الجلسرين في أنبوب إعداد العينة يجب أن يكون أقل من 20٪ (النهائي)، وإلا فإن تركيز الجلسرين العالي سيؤثر سلبًا على ربط الأجسام المضادة الأولية.

تحديد الوقت الأمثل للتعرض
في النسخة القديمة من البرنامج، كان لا بد من تحديد وقت التعرض الأمثل من خلال رسم منطقة الذروة ضد تركيز البروتين (ملغم/مل). يوفر الإصدار الجديد أداة جديدة تسمى ملف تعريف الكشف عن النطاق الديناميكي العالي (HDR)(الشكل 4). باستخدام لوحة الصور وفرت خيار لعرض جميع أوقات التعرض (أي 5 ق، 15 ق، 30 ق، 60 ق، 120 ق، 240 ق، 480 ق) معا. برامج الكمبيوتر تحليل جميع أوقات التعرض وحددت تلقائيا أفضل وقت التعرض (HDR). وقدم ملف تعريف الكشف عن تقرير التنمية البشرية نطاقًا ديناميكيًا أوسع بكثير نظرًا لحساسية الـ CEI الأكبر ، مما يعني اكتشافًا وكمية أفضل على نطاق تركيز عينة أكبر. ومع ذلك ، لا يزال لدى المستخدمين خيار اختيار أي وقت تعرض يلبي الهدف التجريبي. باستخدام هذه الميزة، تم العثور على الوقت الأمثل التعرض للبروتين TDP-43. تمثل الذروة الوقت الأمثل للتعرض(الشكل 4A). تم تحديد وقت تعرض واحد (4 ق) لهذا الجسم المضاد بعد مراجعة جميع أوقات التعرض التسعة التي تتراوح بين 1-512 s(الشكل 4B).

Figure 4
الشكل 4: ملف تعريف الكشف عن النطاق الديناميكي العالي (HDR) للبروتين المستهدف. (A)TDP-43 ذروة البروتين يمثل الوقت الأمثل للتعرض للبروتين المستهدف. وكان المعايرة A-TDP-43 Ab 1:300، وكان تركيز بروتين السيتول الصفائح الدموية 0.5 ملغم/مل. يشير الخط الأزرق المحدد بالبرنامج إلى الوقت الأمثل للتعرض. (ب)يمثل هذا الرقم وقت تعرض واحد محدد من قبل المستخدم (4 ق) بعد مراجعة جميع أوقات التعرض التسعة التي تتراوح بين 1-512 s. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

مستويات TDP-43 في السيتوسول الصفائح الدموية البشرية من المرضى ALS
تم إجراء تطوير العلامات الحيوية قاعدة الدم. باستخدام حالات فحص محسنة، تم تحليل الكسور التأنية الشهرية للصفائح الدموية التي تم الحصول عليها من مرضى ALS باستخدام مجموعتين من الأجسام المضادة (أي، الأجسام المضادة المضادة لـ TDP-43 [Pan] ، وهي أجسام مضادة تتعرف على المشتقات الفوسفورية من بروتين TDP-43؛ هنا، تم استخدام A-P [S409/410-2] TDP-43). في هذه المظاهرة ، يتم تقديم TDP-43 الخاص بالمرض ومشتقاته الفوسفورية(الشكل 5).

Figure 5
الشكل 5: تمثيل لقيمة الفوسفور التنبؤية (PPV) من TDP-43. لم تظهر الكمية المطلقة من TDP-43 وPan TDP-43 وحدها فرقًا كبيرًا بين ALS ومجموعات التحكم. ومع ذلك، أشار الـPPV إلى زيادة طفيفة في مجموعة ALS، على الرغم من عدم وجود فرق إحصائي بين المجموعتين بسبب عدم كفاية أعداد الأشخاص (ALS = 25، التحكم = 27). وأظهرت قيمة د منخفضة كوهين بين وسائل ALS ومجموعة التحكم حجم تأثير منخفض بين المجموعتين بسبب حجم العينة الصغيرة (التحكم = 25، ALS = 27). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

تم قياس إجمالي TDP-43 باستخدام منحنى المعايرة(الشكل 6)

Figure 6
الشكل 6: منحنى المعايرة القياسية. واستخدمت تركيزات البروتين المؤتلف ة TDP-43 المشتراة تجارياً لبناء منحنى قياسي. وتمثل كل بيانات متوسط ثلاثية. كانت كثافة نطاق البروتين تعتمد على التركيز (Inset). يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

لم يكن القياس الكمي للبروتين الفوسفوري TDP-43 ممكنًا بسبب عدم توفر هذا البروتين تجاريًا. بدلاً من ذلك، تم تحديد قيمة فوسفورية متوقعة (PPV) تحدد النسبة المئوية للأنواع الفوسفورية من TDP-43. تم تحديد PPV من تحليلين تسلسليين CEI لنفس العينة باستخدام المعادلة التالية.

Equation 1

تم اختبار تقلب الاختبارات داخل وبين المدى في كسور الصفائح الدموية ALS البشرية المجمعة(الشكل 7)

Figure 7
الشكل 7: تنويعات الاسباة. (أ)تم تحليل اثنين من الشعيرات الدموية المحملة بنفس العينة من قبل CEI ، وتم حساب تباين العينات داخل المدى كـ CV ٪ = 14.9. (ب)تم تحليل نفس العينة في ثلاثة أيام فحص مختلفة وفي ثلاثة عمليات فحص مختلفة. تم حساب تباين المنقّح بين المدى كـ CV% = 18.7. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

على الرغم من أن قيم التباين بين الشعيرات الدموية (الشعيرات الدموية إلى الشعيرات الدموية) انخفضت في النطاق المقبول (CV% = 14.9)، فإن قيمة الخفض بين المدى كانت مرتفعة نسبيًا (CV% = 18.7). ويفسر أن هذا الاختلاف قد يكون بسبب استخدام خراطيش الشعيرات الدموية ولوحات عينة من الكثير مختلفة. من المستحسن أن يتم إجراء دراسات الاستنساخ في مكونات CEI التي لها نفس رقم اللوت.

الجدول 1: CEI قالب تحميل لوحة cei. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

الجدول 2: نموذج تفاعلي قالب إعداد الخليط. بعد إدخال تركيز بروتين المخزون من عينات غير معروفة ، ستقوم الخلايا التفاعلية تلقائيًا بحساب مقدار الحجم الذي يجب استخدامه لإعداد مزيج العينة. يرجى الضغط هنا لتحميل هذا الجدول.

Discussion

الشعيرات الشعيرات الكهربية القائمة على المناعية الآن الطريقة المفضلة لتحليل العينات عالية الإنتاجية وفحوصات المخدرات25. أحجام عينة صغيرة، مكونات القياس الأمثل جيدا، منصة سهلة الاستخدام والقياس والأجهزة، والإنفاق الكاشف، وانخفاض نسبة CV هي المزايا الأولية26،27. على الرغم من وجود عدة طرق لفصل البروتينات في طرائق مختلفة للفحص ، يمكن تكييف CEI القائم على الأجسام المضادة الموصوفة هنا من قبل المختبرات الصغيرة التي تشارك في تطوير العلامات الحيوية المستندة إلى الدم. توفر تقنية CEI للاستقافي المستخدمة هنا قياسات موثوقة وقابلة للتكرار وحساسة لـ TDP-4328 ومشتقها الفوسفوري5.

يوفر نظام CEI أيضًا خيارًا متعدد الشينغ لتحليل TDP-43 ومشتقاته الفوسفورية في وقت واحد وتوفير القياس الكمي المباشر للبروتين المستهدف ، إذا كان البروتين المستهدف المنقى أو المؤتلف متاحًا. كامل طول البروتين المؤتلف TDP-43 متاح تجاريا; ومع ذلك ، فإن مشتق TDP-43 الفوسفوري المؤتلف ليس كذلك. وبما أن الفوسفور TDP-43 غير متوفر تجارياً، تم تنفيذ قيمة فوسفورية تنبؤية (PPV) لتقييم ملف TDP-43 في مرضى ALS. وقد وُصفت كميات Pan TDP-43 والفوسفورية TDP-43 بشكل دائم بفلوروفور؛ ولذلك، فإن ملف TDP-43 لا يزال هو نفسه مع أو بدون وحدة كمية (أي نانوغرام/مل، pg/mL، الخ). على الرغم من أن تحديد الكمية المطلقة من TDP-43 ومشتقاته الفوسفورية (أي P.S409-410-12) يوفر قياسًا كميًا أكثر ، فإن حساب PPV يلغي ضرورة الفسفور المؤتلف TDP-43 للتوحيد القياسي ، لأنه غير متوفر تجاريًا.

يوفر CEI العديد من نقاط التفتيش في منصة الاختبارات لتحديد المشكلة بدقة في حالة فشل إجراء اختبار. هذا يزيل العقبات ويوفر تصميم تجريبي أفضل. The assay procedure is fully automated except for filling the sample plate. هذه ميزة هامة مقارنة بتحليل النشاف الغربي القياسي. توفر هذه الميزة التناسق من التشغيل إلى التشغيل. على الرغم من أن كل مختبر لديه إجراءات تشغيل قياسية فريدة من نوعها، فمن المهم الالتزام بالممارسات التي تقلل من الخطأ البشري. على سبيل المثال، من الأهمية بمكان إعداد خليط لومينول-S/peroxide قبل تحميل اللوحة، لأن إضافة بيروكسيد إلى لومينول يبدأ التفاعل الأنزيمي ويستهلك الركيزة اللومينول. كما أن تحميل العينات والأجسام المضادة الأولية/الثانوية في آبار الصفائح دون فقاعات الهواء هي خطوات بالغة الأهمية.

بالإضافة إلى ذلك ، بما أن آبار الصفائح صغيرة الحجم ولا توجد مساحة بين الآبار ، يجب على المستخدمين توخي الحذر أثناء الأنابيب ، وهي الخطوة الأكثر أهمية لأن كل شيء آخر مؤتمت. ترتيب تحميل العينات والأجسام المضادة وغيرها من الكواشف مهم لاتساق العينات(الشكل 1). تستغرق عملية إعداد اللوحة حوالي 40-45 دقيقة. لذلك ، يوصى أولاً بتحميل اللوحة بمكونات الاختبارات المطلوبة وإعداد خليط luminol-S / بيروكسيد قبل الأنابيب مباشرة. بهذه الطريقة ، هناك تسلسل ثابت من إضافة الكاشف ، وسيتم تحقيق قوة إشارة التلألؤ المتسقة. لا ينصح باستخدام كاشف لومينول-S/peroxide منتهية الصلاحية ، لأنه يؤثر في المقام الأول على قوة البيروكسيد. وقد أدى التقدم المحرز مؤخرا في إدخال نظام التقسيم المؤقت، بما في ذلك نطاق التوافق الكيميائي والمنظفات، إلى تعزيز جودة الاختبارات وأسفر عن نتائج أكثر قابلية للاستنساخ ويمكن التنبؤ بها. الآن ، وهو جديد التحرير والسرد محلل من نفس الشركة المصنعة تمتلك ميزة لتحليل العينات المسماة مع chemiluminescence والأجسام المضادة المترافقة fluorescence في نفس الشوط. هذه الميزة الجديدة يلغي الحاجة إلى تشغيل على التوالي اثنين من لوحات الفردية ويزيل تشغيل لتشغيل الاختلاف.

وينبغي تخزين لوحات من قافي في درجة الحرارة المحيطة. إذا تم اختياره للحفاظ على لوحات الاطباق في ثلاجة 4 درجة مئوية، يجب إخراج الأطباق في الليلة السابقة للاستخانة وإحضارها إلى درجة الحرارة المحيطة. يجب غسل آبار العينة المحملة بشكل غير صحيح على نطاق واسع (4-5 مرات) مع المخزن المؤقت المتوفرة في عدة قبل إضافة العينة الصحيحة. كل الأجسام المضادة الأولية والعينات البيولوجية هي فريدة من نوعها; لذلك ، يجب إجراء تحسين الأجسام المضادة / البروتين قبل تحليل العينات للبروتينات المستهدفة في السوائل البيولوجية.

هنا ، تم تعيين وقت حضانة الأجسام المضادة الأولية لمدة 30 دقيقة افتراضيًا. إذا كانت الإشارة ضعيفة ، يجب على المستخدمين النظر في زيادة وقت حضانة الأجسام المضادة الأولية حتى الوصول إلى قوة الإشارة المطلوبة دون نضوب إشارة الفلورسينس. بالنسبة للصفائح الدموية البشرية ، تم إعداد عينات مجمعة من المرضى واستخدامها لإجراء تحليل تحسيني. عينة تجميع أفضل يمثل الاختلاف بين الجزيئات الحيوية المستهدفة. من المستحسن استخدام supernatants واضحة بدلا من التأني الكامل أو التجانس الكلي لCEI.

قد يقلل التركيز العالي للبروتين في خليط الصفائح الدموية الكاملة من نسبة الإشارة إلى الضوضاء(الشكل 2). وينبغي تجنب دورات التجميد والذوبان المتكررة للعينات، لأن ذلك يؤثر سلباً على ربط الأجسام المضادة الأولية. مكونات المخزن المؤقت ليسات مهمة، كما أن بعض الكواشف غير متوافقة مع CEI29. وينصح بالتحقق من قائمة الكواشف المتوافقة المقدمة على موقع الشركة المصنعة قبل إعداد العينة. هذا هو الحد من النظام الذي لا يتسامح مع الظروف الشديدة لإعداد العينة. من المستحسن تحسين معلمات تشغيل العينات (أي تخفيف الأجسام المضادة الأولية ، وتركيز البروتين ، ووقت حضانة الأجسام المضادة الأولية ، وما إلى ذلك) باستخدام عينات مجمعة لتحليل العينات الفردية لاحقًا.

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود مصلحة مالية منافسة باستثناء شركة ProteinSimple Inc. التي غطت تكلفة نشر هذه المخطوطة.

Acknowledgments

وقد تم رعاية هذا البحث من خلال منحة داخل المدرسة منحت لA.A. تم دعم هذا العمل من خلال منحة CTSA من NCATS منحت إلى مركز جامعة كانساس الطبي للحدود: معهد هارتلاند للبحوث السريرية والانتقالية (#UL1TR606381). المحتويات هي مسؤولية المؤلفين فقط ولا تمثل بالضرورة وجهات النظر الرسمية للالمعاهد القومية للصحة أو NCATS. نحن ممتنون لجامعة كانساس الطبية مركز ALS عيادة الشخصية للحصول على موافقة IRB لجمع عينة الدم من المتطوعين الأصحاء والمرضى المرضى. يشكر المؤلفون إيمري أغباس على التدقيق اللغوي للمخطوطة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
12-230 kDa Separation kit ProteinSimple SM-W004 Contains pre-filled assay plate and 25-channel capillary cartridge
3000G Thermocycler Techne FTC3G/02 We used this thermocylcer for heating the sample mix
Anti-Mouse detection kit ProteinSimple 042-205 Includes HRP-conjugated secondary antibody, buffer, luminol reagent, molecular weight marker
Anti-P(S409-410) TDP-43 antibody ProteinTech 22309-1-AP Primary antibody that recognizes phosphorylated TDP-43
Anti-P(S409-412) TDP-43 antibody CosmoBio-USA TIP-PTD-P02 Primary antibody that recognizes phosphorylated TDP-43
Anti-Rabbit detection kit ProteinSimple DM-001 Includes HRP-conjugated secondary antibody, buffer, luminol reagent, molecular weight marker
Anti-TDP-43 (pan) antibody ProteinTech 10782-2-AP Primary antibody that recognizes whole TDP-43 protein
Compass for SimpleWestern (SW) ProteinSimple Ver.4.0.0. Compass for SW is the control and data analysis application for SimpleWestern instruments
Sonic Dismembrator; Model100 Fisher Scientific Sonicator. Used to rupture the cell membrane. This model is discontinued (Model XL2000-350)
Table top centrifuge Eppendorf 22625004 Model# 5810 with swinging plate bucket
Wes analyzer ProteinSimple 55892-WS-2203 Performs the capillary gel electrophoresis

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Blair, P., Flaumenhaft, R. Platelet alpha-granules: basic biology and clinical correlates. Blood Reviews. 23 (4), 177-189 (2009).
  2. Mercado, C. P., Kilic, F. Molecular mechanisms of SERT in platelets: regulation of plasma serotonin levels. Molecular Interventions. 10 (4), 231-241 (2010).
  3. Goubau, C., et al. Regulated granule trafficking in platelets and neurons: a common molecular machinery. European Journal of Paediatric Neurology. 17 (2), 117-125 (2013).
  4. Basu, S. S., et al. Human platelets as a platform to monitor metabolic biomarkers using stable isotopes and LC-MS. Bioanalysis. 5 (24), 3009-3021 (2013).
  5. Wilhite, R., et al. Platelet phosphorylated TDP-43: an exploratory study for a peripheral surrogate biomarker development for Alzheimer's disease. Future Science OA. 3 (4), 238 (2017).
  6. Worth, A. J., et al. LC-MS Analysis of Human Platelets as a Platform for Studying Mitochondrial Metabolism. Journal of Visualized Experiments. (110), e53941 (2016).
  7. Statland, J. M., et al. Rasagiline for amyotrophic lateral sclerosis: A randomized, controlled trial. Muscle and Nerve. 59 (2), 201-207 (2019).
  8. Charytan, D. M., et al. Safety and cardiovascular efficacy of spironolactone in dialysis-dependent ESRD (SPin-D): a randomized, placebo-controlled, multiple dosage trial. Kidney International. 95 (4), 973-982 (2019).
  9. Ugras, S. E., Shorter, J. RNA-Binding Proteins in Amyotrophic Lateral Sclerosis and Neurodegeneration. Neurology Research International. , 432780 (2012).
  10. Amador-Ortiz, C., et al. TDP-43 immunoreactivity in hippocampal sclerosis and Alzheimer's disease. Annal of Neurology. 61 (5), 435-445 (2007).
  11. Baloh, R. H. TDP-43: the relationship between protein aggregation and neurodegeneration in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal lobar degeneration. FEBS Journal. 278 (19), 3539-3549 (2011).
  12. Buratti, E., Baralle, F. E. The molecular links between TDP-43 dysfunction and neurodegeneration. Advances in Genetics. 66, 1-34 (2009).
  13. Guo, W., et al. An ALS-associated mutation affecting TDP-43 enhances protein aggregation, fibril formation and neurotoxicity. Nature Structural Molecular Biology. 18 (7), 822-830 (2011).
  14. Geser, F., et al. Motor neuron disease clinically limited to the lower motor neuron is a diffuse TDP-43 proteinopathy. Acta Neuropathologica. 121 (4), 509-517 (2011).
  15. Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in frontotemporal lobar degeneration and amyotrophic lateral sclerosis. Science. 314 (5796), 130-133 (2006).
  16. Buratti, E., Baralle, F. E. TDP-43: gumming up neurons through protein-protein and protein-RNA interactions. Trends in Biochemical Sciences. 37 (6), 237-247 (2012).
  17. Fallini, C., Bassell, G. J., Rossoll, W. The ALS disease protein TDP-43 is actively transported in motor neuron axons and regulates axon outgrowth. Human Molecular Genetics. 21 (16), 3703-3718 (2012).
  18. Ayala, Y. M., et al. Structural determinants of the cellular localization and shuttling of TDP-43. Journal of Cell Sciences. 121, Pt 22 3778-3785 (2008).
  19. Fiesel, F. C., Kahle, P. J. TDP-43 and FUS/TLS: cellular functions and implications for neurodegeneration. FEBS Journal. 278 (19), 3550-3568 (2011).
  20. Birsa, N., Bentham, M. P., Fratta, P. Cytoplasmic functions of TDP-43 and FUS and their role in ALS. Seminars in Cell and Development Biology. , (2019).
  21. Liachko, N. F., et al. CDC7 inhibition blocks pathological TDP-43 phosphorylation and neurodegeneration. Annals of Neurology. 74 (1), 39-52 (2013).
  22. Qureshi, A. H., et al. Proteomic and phospho-proteomic profile of human platelets in basal, resting state: insights into integrin signaling. PLoS One. 4 (10), 7627 (2009).
  23. Suominen, I., Koivisto, S. Increasing Precision When Pipetting Protein Samples: Assessing Reliability of the Reverse Pipetting Technique. American Laboratory. , (2011).
  24. Pipetting tool box for life sciences. , https://www.mt.com/us/en/home/library/guides/laboratory-division/life-science/pipetting-toolbox-for-life-sciences.html (2019).
  25. Hale, L. J., et al. 3D organoid-derived human glomeruli for personalised podocyte disease modelling and drug screening. Nature Communication. 9 (1), 5167 (2018).
  26. Chen, J. Q., Wakefield, L. M., Goldstein, D. J. Capillary nano-immunoassays: advancing quantitative proteomics analysis, biomarker assessment, and molecular diagnostics. Journal of Translational Medicine. 13, 182 (2015).
  27. Moser, A. C., Hage, D. S. Capillary electrophoresis-based immunoassays: principles and quantitative applications. Electrophoresis. 29 (16), 3279-3295 (2008).
  28. Fourier, A., et al. Development of an automated capillary nano-immunoassay-Simple Western assay-to quantify total TDP43 protein in human platelet samples. Analytical and Bioanalytical Chemistry. 411 (1), 267-275 (2019).
  29. Compatibility, S.W.S.A.B. , https://www.proteinsimple.com/technical_library.html (2017).

Tags

علم الأعصاب، العدد 156، TDP-43، الفوسفورTDP-43، الكهربية الشعرية، الصفائح الدموية البشرية، الأمراض العصبية، العلامات الحيوية، قيمة الفوسفور التنبؤية، تقييم الأمثل
استخدام الشعيرات الدموية المناعة الكهربائية للبحث عن المؤشرات الحيوية المحتملة للتصلب الجانبي الضموري في الصفائح الدموية البشرية
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sage, J. M., Hall, L., McVey, A.,… More

Sage, J. M., Hall, L., McVey, A., Barohn, R. J., Statland, J. M., Jawdat, O., Dimachkie, M. M., Agbas, A. Use of Capillary Electrophoresis Immunoassay to Search for Potential Biomarkers of Amyotrophic Lateral Sclerosis in Human Platelets. J. Vis. Exp. (156), e60638, doi:10.3791/60638 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter