Summary

Приготовление Мейотических хромосомных спредов из сперматозоидов зебрафиш

Published: March 03, 2020
doi:

Summary

Ядерные поверхностные спреды являются незаменимым инструментом для изучения хромосомных событий во время мейоза. Здесь мы демонстрируем метод подготовки и визуализации мейотических хромосом во время профазы I из сперматозитов зебры.

Abstract

Meiosis является ключевым клеточным процессом, необходимым для создания гаплоидных гамет для полового размножения. Модельорганизмов сыграли важную роль в понимании хромосомных событий, которые происходят во время мейотической профазы, включая спаривание, синапсис и рекомбинации событий, которые обеспечивают надлежащую сегрегацию хромосомы. Хотя мышь была важной моделью для понимания молекулярных механизмов, лежащих в основе этих процессов, не все мейотические события в этой системе аналогичны человеческому мейозу. Недавно мы продемонстрировали захватывающий потенциал зебры в качестве модели человеческого сперматогенеза. Здесь мы подробно описываем наши методы визуализации мейотических хромосом и связанных с ними белков в хромосомных препаратах. Преимущество этих препаратов позволяет проводить анализ хромосомных хромосомных структур с высоким разрешением. Во-первых, мы описываем процедуру вскрытия яичек от взрослых зебр, а затем диссоциации клеток, лиза и распространения хромосом. Далее мы описываем процедуру обнаружения локализации мейотических хромосомных белков путем обнаружения иммунофлуоресценции и последовательностей нуклеиновых кислот путем флуоресценции на месте гибридизации (FISH). Эти методы представляют собой полезный набор инструментов для цитологического анализа мейотического хроматина архитектуры в системе зебрафиш. Исследователи в сообществе зебры должны быть в состоянии быстро освоить эти методы и включить их в свой стандартный анализ репродуктивной функции.

Introduction

Сексуальное размножение происходит через сочетание двух гаплоидных гамет, каждый из которых несет половину хромосомного дополнения соматической клетки. Meiosis является специализированным делением клеток, который производит гаплоидные гаметы через один раунд репликации ДНК и два последовательных раунда сегрегации хромосомы. В профазе I гомологичные хромосомы (омологи) должны пройти спаривание, рекомбинацию и синапсис, последний из которых характеризуется образованием синаптонемного комплекса, состоящего из двух омологовых осей, мостовых поперечной нитью, Sycp1(Рисунок 1A, B). Неспособность должным образом выполнить эти процессы может привести к производству анеуплоидных гамет, которые являются основной причиной выкидышей у людей1. Наши знания о координации между сопряжением, рекомбинации и синапсиса было облегчено исследований в широком диапазоне организмов, таких как дрожжи, C. elegans, мышь, и Drosophila, среди других2. В то время как общий процесс гомологичных хромосомных спаривания с последующим сегрегацией хорошо сохраняется, его зависимость от рекомбинации и синапсиса и порядок этих событий варьируется.

Мейотическое двухструное разрыв (DSB) образование, которое инициирует гомологичную рекомбинацию, происходит вблизи теломер, сгруппированных в букете во время лептотена и синапсиса вытекает вскоре после3,4. Эта конфигурация формирования DSB и синапсис инициации также является характеристикой мужского мейоза у людей, но не в мыши5,6,7,8, предполагая, что зебрафиш может служить моделью для человеческого сперматогенеза. Есть также несколько практических преимуществ изучения зебрафиш мейоз. Как мужчины, так и самки проходят гейттогенез на протяжении всей взрослой жизни, их гонады легко доступны, и сотни потомства генерируются из одного креста. Кроме того, эмбрионы прозрачны и развиваются внешне, что облегчает раннее выявление аберраций в эмбриональном развитии из-за анеуплоидных гамет3,9. Недостатки использования зебры в том, что они медленно достигают половой зрелости (60 дней), а количество материала, необходимого для ядерных поверхностных спредов, должно быть собрано у взрослых животных в зависимости от их размера.

Препараты мейотической хромосомы являются жизненно важным инструментом для изучения динамики хромосом во всех модельных организмах, так как ключевые признаки динамики мейотической хромосомы могут быть исследованы. В зебрафиш, ключевые аспекты прогрессирования мейотической программы и ядерной организации были расчленены путем зондирования ядерных поверхностных спредов, упомянутых здесь как хромосомные спреды, с антителами для иммунофлюоресценции обнаружения белков и / или нуклеиновых кислот FISH3,4,9,10,11,12. Действительно, поляризованная локализация кластерных теломер в букете может быть сохранена в спред-препарате(рисунок 1С). В последнее время мы использовали зебра фишка сперматозоидов хромосомы распространяется вместе с методами обнаружения флуоресценции и супер-разрешение микроскопии, чтобы выяснить детальное прогрессирование динамики теломер зебры, гомологические хромосомы сопряжения, двойной нитны перерыв локализации, и синапс и синапсис на ключевых мейотических переходов3. Здесь мы представляем методы подготовки хромосомных спредов из сперматозитов яичек зебры, а затем окрашиваем их флуоресцентными пептидными нуклеиновыми кислотами (ПНА) зондами для повторных последовательностей теломер и иммунофуфрезесценции, связанных с белками.

Protocol

Все методы, связанные с зебрафиш были выполнены с использованием этических стандартов, утвержденных Институциональным комитетом по уходу за животными и использованию в Калифорнийском университете в Дэвисе. 1. Процедура распространения хромосомы ПРИМЕЧАН…

Representative Results

Мы наметили метод для подготовки и визуализации зебрафиш сперматоцитов распространения препаратов. При правильном выполнении наша процедура дает хорошо спред, не перекрывающиеся ядра. Чтобы восстановить такие ядра, важно иметь соответствующее количество исходного …

Discussion

Здесь мы описываем методы зондирования расположения теломер и хромосо-связанных белков в ядерной поверхности распространяется из сперматоцитов, изолированных от яичек зебры. Мы ожидаем, что эти методы будут применимы для анализа сперматоцитов у других видов телеост с корректировкой …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Мы благодарим Трента Ньюмана и Масуду Шарифи за комментарии к рукописи и An Nguyen за помощь в оптимизации методов распространения и окрашивания хромосом от зебры миоцитов. Эта работа была поддержана NIH R01 GM079115, присужденной S.M.B.

Materials

1.5 mL centrifuge tubes Several commercial brands available
1.5 mL microcentrifuge tube rack Several commercial brands available
16% formaldehyde, methanol-free ThermoFisher Scientific 28908
2 mL Several commercial brands available
24 x 50 mm glass coverslips Corning 2980-245
24 x 60 mm glasscoverslips VWR International 16004-312
50 mL conical centrifuge tubes ThermoFisher Scientific 363696
Autoclave bag Several commercial brands available Used to make plastic coverslips.
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific BP1605-100 Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water.
Cell Strainer, 100 µm Fisher Scientific 08-771-19
CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed Biotium 203775-500uL Use at 1:1000
Chicken anti-zfSycp1 Generated by Burgess lab N/A Use at 1:100
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C0130-500MG
Coplin jar Several commercial brands available
DNase I, grade II from bovine pancreas Roche Diagnostics 10104159001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Fisher Scientific MT10014CV
Dumont No. 5 Forceps Fine Science Tools 11252-30 Two are required for dissecting the testes.
Eppendorf Tubes, 5 mL VWR International 89429-308
Formamide Fisher Scientific BP228-100
Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-11039 Use at 1:1000
Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A-11042 Use at 1:1000
Goat anti-hDMC1 Santa Cruz Biotechnology sc-8973 Does not work in our hands
Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-11008 Use at 1:1000
Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A-11012 Use at 1:1000
Goat serum Sigma-Aldrich G9023-10mL
Heparin sodium salt Sigma-Aldrich H3393-100KU
Humidity chamber Fisher Scientific 50-112-3683
Hybridization Oven VWR International 230401V (Model 5420)
Incubator Shaker New Brunswick Scientific Model Classic C25
KCl Fisher Scientific P217-500
Kimwipes Kimerbly-Clark Professional 34155 Used for the humidity chamber
KH2PO4 Fisher Scientific P285-500
Microscope Several commercial brands available Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient.
Microscope slides Fisher Scientific 12-544-7
Mouse anti-hamsterSCP3 Abcam ab97672 Does not work in our hands
Mouse anti-hMLH1 BD Biosciences 550838 Does not work in our hands
Mouse anti-hRPA Sigma-Alrich MABE285 Does not work in our hands
Na2HPO4 · 7 H2O Fisher Scientific S373-500
NaCl Fisher Scientific S271-3
Photo-Flo 200 solution Electron Microscopy Sciences 74257
Plastic transfer pipettes Several commercial brands available
PNA TelC-Alexa647 PNA Bio Inc F1013 Prepare as per manufacturer's instructions.
PNA TelC-Cy3 PNA Bio Inc F1002 Prepare as per manufacturer's instructions.
ProLong Diamond Antifade Mountant ThermoFisher Scientific P36970
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI ThermoFisher Scientific P36971
Rabbit anti-hRPA Bethyl A300-244A Use at 1:300
Rabbit anti-hSCP3 Abcam ab150292 Use at 1:200
Rabbit anti-hRad51 GeneTex GTX100469 Use at 1:300
Sodium citrate Fisher Scientific S279-500
Sucrose Fisher Scientific S5-500
Supercut Scissors, 30° angle, 10 cm Fisher Scientific 50-822-353 Can also use any pair of small scissors.
Sylgard kit Fisher Scientific NC9897184 Prepare as per manufacturer's instructions.
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100 Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight.
Trypsin Worthington Biochemical LS003708
Trypsin inhibitor from chicken egg white Sigma-Aldrich T9253-500MG
Tween 20 Bio-Rad 170-6531 Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature.
Vannas Spring Scissors – 4 mm (micro scissors) Fine Science Tools 15018-10

References

  1. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).
  2. Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).
  3. Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio. PLoS Genetics. 15, e1007730 (2019).
  4. Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish. Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).
  5. Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. Temporal progression of recombination in human males. Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).
  6. Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks. PLoS One. 8, e85075 (2013).
  7. Pratto, F., et al. Recombination initiation maps of individual human genomes. Science. 346, 1256442 (2014).
  8. Brown, P. W., et al. Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male. American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).
  9. Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1. Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).
  10. Saito, K., Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C., Sakai, N. Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants. Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).
  11. Sansam, C. L., Pezza, R. J. Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination. Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).
  12. Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females. Genetics. 175, 1561-1569 (2007).
  13. Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes. Journal of Visualized Experiments. (129), e55378 (2017).
  14. Moens, P. B. Zebrafish: chiasmata and interference. Genome. 49, 205-208 (2006).
  15. Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies. Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).
  16. Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene. Chromosome Research. 17 (6), 773 (2009).

Play Video

Cite This Article
Blokhina, Y. P., Olaya, I., Burgess, S. M. Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes. J. Vis. Exp. (157), e60671, doi:10.3791/60671 (2020).

View Video