Summary

Zubereitung von meiotischen Chromosomenaufstrichen aus Zebrafisch Spermatozyten

Published: March 03, 2020
doi:

Summary

Nukleare Oberflächenausbreitungen sind ein unverzichtbares Werkzeug, um Chromosomenereignisse während der Meiose zu untersuchen. Hier zeigen wir eine Methode zur Vorbereitung und Visualisierung meiotischer Chromosomen während der Prophase I aus Zebrafisch-Spermatozyten.

Abstract

Meiose ist der wichtigste zelluläre Prozess erforderlich, um haploide Gameten für die sexuelle Reproduktion zu erstellen. Modellorganismen haben entscheidend dazu beigetragen, die Chromosomenereignisse zu verstehen, die während der meiotischen Prophase stattfinden, einschließlich der Paarungs-, Synapsen- und Rekombinationsereignisse, die eine korrekte Chromosomensegregation gewährleisten. Während die Maus ein wichtiges Modell für das Verständnis der molekularen Mechanismen war, die diesen Prozessen zugrunde liegen, sind nicht alle meiotischen Ereignisse in diesem System analog zur menschlichen Meiose. Kürzlich haben wir das spannende Potenzial des Zebrafisches als Modell der menschlichen Spermatogenese demonstriert. Hier beschreiben wir detailliert unsere Methoden zur Visualisierung meiotischer Chromosomen und zugehöriger Proteine in Chromosomenausbreitungspräparaten. Diese Präparate haben den Vorteil, dass eine hochauflösende Analyse von Chromosomenstrukturen möglich ist. Zunächst beschreiben wir das Verfahren zur Zersebung von Hoden von erwachsenen Zebrafischen, gefolgt von Zelldissoziation, Lyse und Verbreitung der Chromosomen. Als Nächstes beschreiben wir das Verfahren zum Nachweis der Lokalisation von meiotischen Chromosomenproteinen durch Immunfluoreszenznachweis und Nukleinsäuresequenzen durch Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH). Diese Techniken umfassen eine nützliche Reihe von Werkzeugen für die zytologische Analyse der meiotischen Chromatin-Architektur im Zebrafischsystem. Forscher in der Zebrafischgemeinschaft sollten in der Lage sein, diese Techniken schnell zu beherrschen und in ihre Standardanalysen der Fortpflanzungsfunktion zu integrieren.

Introduction

Die sexuelle Fortpflanzung erfolgt durch die Kombination zweier haploider Gameten, die jeweils die Hälfte des Chromosoms einer somatischen Zelle tragen. Meiose ist eine spezialisierte Zellteilung, die haploide Gameten durch eine Runde DNA-Replikation und zwei aufeinander folgende Runden der Chromosomensegregation produziert. In proPhase I müssen homologe Chromosomen (Homologe) paarwerden, rekombinieren und synapsisieren, wobei letztere durch die Bildung des synaptonemalen Komplexes gekennzeichnet ist, der zwei Homologachsen umfasst, die durch das Querfilament, Sycp1 (Abbildung 1A,B) überbrückt werden. Wenn diese Prozesse nicht ordnungsgemäß ausgeführt werden, kann dies zur Produktion von aneuploiden Gameten führen, die eine der Hauptursachen für Fehlgeburten beim Menschen sind1. Unser Wissen über die Koordination zwischen Paarung, Rekombination und Synapse wurde durch Studien in einer Vielzahl von Organismen, wie Hefe, C. elegans,Maus und Drosophila,unter anderem2erleichtert. Während der allgemeine Prozess der homologen Chromosomenpaarung, gefolgt von Segregation, gut konserviert ist, variiert seine Abhängigkeit von Rekombination und Synapse und die Reihenfolge dieser Ereignisse.

Meiotische Doppelstrangbruchbildung (DSB), die eine homologe Rekombination initiiert, tritt in der Nähe von Telomere auf, die während Leptotene im Bouquet gebündelt sind, und Synapse folgt kurz nach3,4. Diese Konfiguration der DSB-Bildung und Synapsis-Initiation ist auch ein Merkmal der männlichen Meiose beim Menschen, aber nicht in Maus5,6,7,8, was darauf hindeutet, dass Zebrafische als Modell für die menschliche Spermatogenese dienen können. Es gibt auch mehrere praktische Vorteile des Studiums Zebrafisch Meiose. Sowohl Männchen als auch Weibchen durchlaufen Gametogenese während des gesamten Erwachsenenalters, ihre Gonaden sind leicht zugänglich, und Hunderte von Nachkommen werden aus einem einzigen Kreuz erzeugt. Darüber hinaus sind die Embryonen transparent und entwickeln sich extern, was die Früherkennung von Aberrationen in der embryonalen Entwicklung durch aneuploide Gameten3,9erleichtert. Nachteile der Verwendung von Zebrafischen sind, dass sie langsam die Geschlechtsreife erreichen (ca. 60 Tage) und die Menge an Material, das für nukleare Oberflächenausbreitungen benötigt wird, muss von 10-20 erwachsenen Tieren gesammelt werden, abhängig von ihrer Größe.

Meiotische Chromosomenausbreitungspräparate sind ein wichtiges Werkzeug, um die Chromosomendynamik über alle Modellorganismen hinweg zu untersuchen, da Schlüsselsignaturen der meiotischen Chromosomendynamik untersucht werden können. Bei Zebrafischen wurden Schlüsselaspekte des Fortschreitens des meiotischen Programms und der nuklearen Organisation durch die Sondierung von nuklearen Oberflächenausbreitungen, hier als Chromosomausbreitung bezeichnet, mit Antikörpern zum Immunfluoreszenznachweis von Proteinen und/oder Nukleinsäuren durch FISH3,4,9,10,11,12seziert. Tatsächlich kann die polarisierte Lokalisierung von gruppierten Telomere im Bouquet in der Ausbreitungszubereitung erhalten bleiben (Abbildung 1C). Kürzlich haben wir Zebrafisch-Spermatozyten-Chromosom-Spreads zusammen mit Fluoreszenz-Detektionsmethoden und superhochauflösender Mikroskopie verwendet, um das detaillierte Fortschreiten der Zebrafisch-Telomer-Dynamik, homologen Chromosomenpaarung, Doppelstrang-Break-Lokalisierung und Synapsen an wichtigen meiotischen Übergängen3zu klären. Hier stellen wir Methoden zur Vorbereitung von Chromosomenausbreitungen aus Spermatozyten der Zebrafischhoden vor und färben sie anschließend mit fluoreszierenden Peptidnukleinsäure-Sonden (PNA) zu wiederholten Telomersequenzen und Immunfluoreszenznachweis von Chromosomen-assoziierten Proteinen.

Protocol

Alle Methoden, die Zebrafische betreffen, wurden nach ethischen Standards durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee der UC Davis genehmigt wurden. 1. Chromosomenausbreitungsverfahren HINWEIS: Das folgende Protokoll wurde entwickelt, um 4-6 Dias mit Hunderten von verteilten meiotischen Kernen pro Folie zu erstellen. Die Anzahl der verwendeten Hoden hängt von der Größe der Fische ab. Erwarten Sie, 20 Tiere bei 60 Tagen nach der Befruchtung (d…

Representative Results

Wir haben eine Methode zur Vorbereitung und Visualisierung von Zebrafisch Spermatozyten-Spread-Präparate skizziert. Bei korrekter Durchgeführte ergibt unser Verfahren gut verteilte, nicht überlappende Kerne. Um solche Kerne zurückzugewinnen, ist es wichtig, die entsprechende Menge an Ausgangsmaterial (d.h. Hoden), Hoden für eine ausreichende Dauer in Trypsin und eine ausreichende Anzahl von DNase I Behandlungen zu behandeln. Diese Aufstriche können dann für Telomere und meiotische …

Discussion

Hier beschreiben wir Methoden zur Untersuchung der Lage von Telomeren und chromosomassoziierten Proteinen in nuklearen Oberflächenausbreitungen aus Spermatozyten, die aus Zebrafischhoden isoliert sind. Wir erwarten, dass diese Methoden für die Analyse von Spermatozyten in anderen Teleostarten mit Anpassung an die Größe der Hoden anwendbar sein werden.

Während nur wenige Antikörper zu meiotischen Proteinen von Zebrafischen erhoben wurden, hatten wir Erfolg mit den folgenden Antikörpern, …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Wir danken Trent Newman und Masuda Sharifi für ihre Kommentare zum Manuskript und An Nguyen für ihre Hilfe bei der Optimierung von Methoden zur Verbreitung und Färbung von Chromosomen aus Zebrafisch-Meiocyten. Diese Arbeit wurde von NIH R01 GM079115 an S.M.B.

Materials

1.5 mL centrifuge tubes Several commercial brands available
1.5 mL microcentrifuge tube rack Several commercial brands available
16% formaldehyde, methanol-free ThermoFisher Scientific 28908
2 mL Several commercial brands available
24 x 50 mm glass coverslips Corning 2980-245
24 x 60 mm glasscoverslips VWR International 16004-312
50 mL conical centrifuge tubes ThermoFisher Scientific 363696
Autoclave bag Several commercial brands available Used to make plastic coverslips.
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific BP1605-100 Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water.
Cell Strainer, 100 µm Fisher Scientific 08-771-19
CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed Biotium 203775-500uL Use at 1:1000
Chicken anti-zfSycp1 Generated by Burgess lab N/A Use at 1:100
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C0130-500MG
Coplin jar Several commercial brands available
DNase I, grade II from bovine pancreas Roche Diagnostics 10104159001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Fisher Scientific MT10014CV
Dumont No. 5 Forceps Fine Science Tools 11252-30 Two are required for dissecting the testes.
Eppendorf Tubes, 5 mL VWR International 89429-308
Formamide Fisher Scientific BP228-100
Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-11039 Use at 1:1000
Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A-11042 Use at 1:1000
Goat anti-hDMC1 Santa Cruz Biotechnology sc-8973 Does not work in our hands
Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-11008 Use at 1:1000
Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A-11012 Use at 1:1000
Goat serum Sigma-Aldrich G9023-10mL
Heparin sodium salt Sigma-Aldrich H3393-100KU
Humidity chamber Fisher Scientific 50-112-3683
Hybridization Oven VWR International 230401V (Model 5420)
Incubator Shaker New Brunswick Scientific Model Classic C25
KCl Fisher Scientific P217-500
Kimwipes Kimerbly-Clark Professional 34155 Used for the humidity chamber
KH2PO4 Fisher Scientific P285-500
Microscope Several commercial brands available Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient.
Microscope slides Fisher Scientific 12-544-7
Mouse anti-hamsterSCP3 Abcam ab97672 Does not work in our hands
Mouse anti-hMLH1 BD Biosciences 550838 Does not work in our hands
Mouse anti-hRPA Sigma-Alrich MABE285 Does not work in our hands
Na2HPO4 · 7 H2O Fisher Scientific S373-500
NaCl Fisher Scientific S271-3
Photo-Flo 200 solution Electron Microscopy Sciences 74257
Plastic transfer pipettes Several commercial brands available
PNA TelC-Alexa647 PNA Bio Inc F1013 Prepare as per manufacturer's instructions.
PNA TelC-Cy3 PNA Bio Inc F1002 Prepare as per manufacturer's instructions.
ProLong Diamond Antifade Mountant ThermoFisher Scientific P36970
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI ThermoFisher Scientific P36971
Rabbit anti-hRPA Bethyl A300-244A Use at 1:300
Rabbit anti-hSCP3 Abcam ab150292 Use at 1:200
Rabbit anti-hRad51 GeneTex GTX100469 Use at 1:300
Sodium citrate Fisher Scientific S279-500
Sucrose Fisher Scientific S5-500
Supercut Scissors, 30° angle, 10 cm Fisher Scientific 50-822-353 Can also use any pair of small scissors.
Sylgard kit Fisher Scientific NC9897184 Prepare as per manufacturer's instructions.
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100 Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight.
Trypsin Worthington Biochemical LS003708
Trypsin inhibitor from chicken egg white Sigma-Aldrich T9253-500MG
Tween 20 Bio-Rad 170-6531 Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature.
Vannas Spring Scissors – 4 mm (micro scissors) Fine Science Tools 15018-10

References

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Cite This Article
Blokhina, Y. P., Olaya, I., Burgess, S. M. Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes. J. Vis. Exp. (157), e60671, doi:10.3791/60671 (2020).

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