Summary

إعداد ينتشر كروموسوم Meiotic من الحيوانات المنوية زيبرافيش

Published: March 03, 2020
doi:

Summary

ينتشر السطح النووي هي أداة لا غنى عنها لدراسة الأحداث الكروموسومية أثناء الداء الميوي. هنا نُظهر طريقة لإعداد وتصور الكروموسومات الميوتيكية خلال المرحلة الأولى من الحيوانات المنوية من سمك حمار وحشي.

Abstract

Meiosis هو العملية الخلوية الرئيسية المطلوبة لإنشاء gametes haploid للتكاثر الجنسي. وقد كانت الكائنات الحية النموذجية مفيدة في فهم أحداث الكروموسوم التي تحدث خلال المرحلة المتوسطة، بما في ذلك الاقتران، وتشبج الاشتباك العصبي، والأحداث إعادة التركيب التي تضمن الفصل الكروموسومي السليم. في حين أن الماوس كان نموذجا هاما لفهم الآليات الجزيئية الكامنة وراء هذه العمليات ، وليس كل الأحداث meiotic في هذا النظام هي مماثلة لmeiosis الإنسان. لقد أظهرنا مؤخرًا الإمكانات المثيرة لسمك الحمار الوحشي كنموذج لتكوين الحيوانات المنوية البشرية. هنا نصف، بالتفصيل، أساليبنا لتصور الكروموسومات ميوتيك والبروتينات المرتبطة بها في الاستعدادات انتشار الكروموسوم. هذه الاستعدادات لديها ميزة السماح تحليل عالية الدقة من هياكل الكروموسوم. أولاً، نصف إجراء تشريح الخصيات من سمك الحمار الوحشي البالغ، يليه انفصام الخلايا، تحلل، وانتشار الكروموسومات. بعد ذلك ، نصف إجراء الكشف عن توطين بروتينات الكروموسومات المتوسطة ، عن طريق الكشف عن الفلور المناعي ، وتسلسل الحمض النووي ، عن طريق التهجين في الموقع (FISH). وتشمل هذه التقنيات مجموعة مفيدة من الأدوات للتحليل الخلوي لبنية الكروماتين ميوتيكية في نظام حمار وحشي. وينبغي أن يكون الباحثون في مجتمع سمك الحمار الوحشي قادرين على إتقان هذه التقنيات بسرعة ودمجها في تحليلاتهم القياسية للوظيفة الإنجابية.

Introduction

الإنجاب الجنسي يستمر من خلال الجمع بين اثنين من الملة haploid، كل تحمل نصف الكروموسوم تكملة خلية جسدية. Meiosis هو قسم الخلايا المتخصصة التي تنتج الملة haploid من خلال جولة واحدة من تكرار الحمض النووي وجولتين متتاليتين من الفصل الكروموسوم. في المرحلة الأولى ، يجب أن تخضع الكروموسومات المتجانسة (homologs) للاقتران وإعادة التركيب والمشبك ، ويتميز هذا الأخير بتكوين مجمع synaptonemal الذي يتكون من محورين متجانسين يتم جسرهما بواسطة خيوط العرضية ، Sycp1(الشكل 1A ، B). الفشل في تنفيذ هذه العمليات بشكل صحيح يمكن أن يؤدي إلى إنتاج gametes aneuploid ، والتي هي السبب الرئيسي للإجهاض في البشر1. وقد تم تسهيل معرفتنا بالتنسيق بين الاقتران وإعادة التركيب والمشبك من خلال الدراسات في مجموعة واسعة من الكائنات الحية ، مثل الخميرة ، C. elegans، الماوس ، وDrosophila، من بين أمور أخرى2. في حين أن العملية العامة لاقتران الكروموسوم المتجانس تليها العزل يتم الحفاظ عليها بشكل جيد ، فإن اعتمادها على إعادة التركيب والمشبك ويختلف ترتيب هذه الأحداث.

Meiotic كسر حبلا مزدوجة (DSB) تشكيل، الذي يبدأ إعادة تركيب متجانسة، يحدث بالقرب من التيلوميرات تتجمع في باقة خلال اللبتوتين ومتشابك الاشتباك العصبي تستتبعه بعد وقت قصيرمن 3،4. هذا التكوين من تشكيل DSB وبدء المشبك هو أيضا سمة من سمات meiosis الذكور في البشر ولكن ليس في الماوس5،6،7،8، مما يشير إلى أن حمار وحشي يمكن أن تكون بمثابة نموذج لتكوين الحيوانات المنوية البشرية. وهناك أيضا العديد من المزايا العملية لدراسة الحمار الوحشي meiosis. يخضع كل من الذكور والإناث لتولد الخلايا في مرحلة البلوغ، ويمكن الوصول إلى الغدد التناسلية بسهولة، ويتم توليد المئات من النسل من صليب واحد. بالإضافة إلى ذلك ، تكون الأجنة شفافة وتتطور خارجيًا ، مما يسهل الكشف المبكر عن الانحرافات في النمو الجنيني بسبب الملة الأنيوبلويد3،9. مساوئ استخدام حمار وحشي هي أنها بطيئة للوصول إلى النضج الجنسي (~ 60 يوما) ويجب جمع كمية المواد اللازمة لينتشر السطح النووي من الحيوانات البالغة ~ 10-20 ، اعتمادا على حجمها.

تعد مستحضرات انتشار الكروموسوم اتّهات أداة حيوية لدراسة ديناميكيات الكروموسوم عبر جميع الكائنات الحية النموذجية، حيث يمكن استكشاف التواقيع الرئيسية لديناميكيات الكروموسومات المتوسطة. في حمار وحشي ، تم تشريح الجوانب الرئيسية لتطور البرنامج meiotic والمنظمة النووية من خلال استكشاف ينتشر السطح النووي ، ويشار إليه هنا باسم ينتشر الكروموسوم ، مع الأجسام المضادة للكشف عن الفلور المناعي للبروتينات و / أو الأحماض النووية من قبل FISH3،4،9،10،11،12. في الواقع ، يمكن الحفاظ على توطين الاستقطاب من التيلوميرات المجمعة في باقة في إعداد انتشار(الشكل 1C). في الآونة الأخيرة ، استخدمنا كروموسوم الحيوانات المنوية الحمار الوحشي ينتشر جنبا إلى جنب مع طرق الكشف عن الفلورسوووإكسينس والمجهر الفائق الدقة لتوضيح التقدم التفصيلي لديناميكيات تيلومير حمار وحشي ، اقتران كروموسوم متجانس ، توطين كسر حبلا مزدوج ، وتشابك الاشتباك العصبي في التحولات الرئيسية meiotic3. هنا نقدم طرق لإعداد ينتشر الكروموسوم من الحيوانات المنوية من الخصيتين حمار وحشي ووصمها في وقت لاحق مع الفلورسنت الببتيد النووي (السلطة الوطنية الفلسطينية) تحقيقات لتسلسل التيلومير المتكرروالكشف عن الفلوروسوم البروتينات المرتبطة.

Protocol

تم تنفيذ جميع الأساليب التي تنطوي على حمار وحشي باستخدام المعايير الأخلاقية المعتمدة من قبل لجنة رعاية الحيوانات المؤسسية واستخدامها في جامعة كاليفورنيا في ديفيس. 1. إجراء انتشار الكروموسوم ملاحظة: تم تصميم البروتوكول التالي لإنشاء 4-6 شرائح، مع مئات من النوى …

Representative Results

لقد حددنا طريقة لإعداد وتصور حمار وحشي الحيوانات المنوية الاستعدادات انتشار. عندما يؤديها بشكل صحيح، لدينا إجراءات تسفر عن انتشار جيد، والنوى غير متداخلة. لاستعادة هذه النوى ، من المهم أن يكون المبلغ المناسب من المواد بدءا (أي الخصيتين) ، وعلاج الخصيتين لفترة كافية من ال…

Discussion

هنا نصف طرق للتحقيق في موقع التيلوميرات والبروتينات المرتبطة الكروموسوم في السطح النووي ينتشر من الحيوانات المنوية معزولة عن الخصيتين حمار وحشي. نتوقع أن تكون هذه الأساليب قابلة للتطبيق لتحليل الحيوانات المنوية في الأنواع الأخرى teleost مع التكيف مع حجم الخصية.

في حين تم رفع …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

نشكر ترينت نيومان وماسودا شريفي على تعليقاتهما على المخطوطة و”نغوين” للمساعدة في تحسين طرق نشر وتلطيخ الكروموسومات من مقلدات الحمار الوحشي. تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة R01 GM079115 الممنوحة لS.M.B.

Materials

1.5 mL centrifuge tubes Several commercial brands available
1.5 mL microcentrifuge tube rack Several commercial brands available
16% formaldehyde, methanol-free ThermoFisher Scientific 28908
2 mL Several commercial brands available
24 x 50 mm glass coverslips Corning 2980-245
24 x 60 mm glasscoverslips VWR International 16004-312
50 mL conical centrifuge tubes ThermoFisher Scientific 363696
Autoclave bag Several commercial brands available Used to make plastic coverslips.
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific BP1605-100 Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water.
Cell Strainer, 100 µm Fisher Scientific 08-771-19
CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed Biotium 203775-500uL Use at 1:1000
Chicken anti-zfSycp1 Generated by Burgess lab N/A Use at 1:100
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C0130-500MG
Coplin jar Several commercial brands available
DNase I, grade II from bovine pancreas Roche Diagnostics 10104159001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Fisher Scientific MT10014CV
Dumont No. 5 Forceps Fine Science Tools 11252-30 Two are required for dissecting the testes.
Eppendorf Tubes, 5 mL VWR International 89429-308
Formamide Fisher Scientific BP228-100
Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-11039 Use at 1:1000
Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A-11042 Use at 1:1000
Goat anti-hDMC1 Santa Cruz Biotechnology sc-8973 Does not work in our hands
Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-11008 Use at 1:1000
Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A-11012 Use at 1:1000
Goat serum Sigma-Aldrich G9023-10mL
Heparin sodium salt Sigma-Aldrich H3393-100KU
Humidity chamber Fisher Scientific 50-112-3683
Hybridization Oven VWR International 230401V (Model 5420)
Incubator Shaker New Brunswick Scientific Model Classic C25
KCl Fisher Scientific P217-500
Kimwipes Kimerbly-Clark Professional 34155 Used for the humidity chamber
KH2PO4 Fisher Scientific P285-500
Microscope Several commercial brands available Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient.
Microscope slides Fisher Scientific 12-544-7
Mouse anti-hamsterSCP3 Abcam ab97672 Does not work in our hands
Mouse anti-hMLH1 BD Biosciences 550838 Does not work in our hands
Mouse anti-hRPA Sigma-Alrich MABE285 Does not work in our hands
Na2HPO4 · 7 H2O Fisher Scientific S373-500
NaCl Fisher Scientific S271-3
Photo-Flo 200 solution Electron Microscopy Sciences 74257
Plastic transfer pipettes Several commercial brands available
PNA TelC-Alexa647 PNA Bio Inc F1013 Prepare as per manufacturer's instructions.
PNA TelC-Cy3 PNA Bio Inc F1002 Prepare as per manufacturer's instructions.
ProLong Diamond Antifade Mountant ThermoFisher Scientific P36970
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI ThermoFisher Scientific P36971
Rabbit anti-hRPA Bethyl A300-244A Use at 1:300
Rabbit anti-hSCP3 Abcam ab150292 Use at 1:200
Rabbit anti-hRad51 GeneTex GTX100469 Use at 1:300
Sodium citrate Fisher Scientific S279-500
Sucrose Fisher Scientific S5-500
Supercut Scissors, 30° angle, 10 cm Fisher Scientific 50-822-353 Can also use any pair of small scissors.
Sylgard kit Fisher Scientific NC9897184 Prepare as per manufacturer's instructions.
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100 Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight.
Trypsin Worthington Biochemical LS003708
Trypsin inhibitor from chicken egg white Sigma-Aldrich T9253-500MG
Tween 20 Bio-Rad 170-6531 Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature.
Vannas Spring Scissors – 4 mm (micro scissors) Fine Science Tools 15018-10

References

  1. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).
  2. Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).
  3. Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio. PLoS Genetics. 15, e1007730 (2019).
  4. Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish. Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).
  5. Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. Temporal progression of recombination in human males. Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).
  6. Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks. PLoS One. 8, e85075 (2013).
  7. Pratto, F., et al. Recombination initiation maps of individual human genomes. Science. 346, 1256442 (2014).
  8. Brown, P. W., et al. Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male. American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).
  9. Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1. Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).
  10. Saito, K., Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C., Sakai, N. Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants. Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).
  11. Sansam, C. L., Pezza, R. J. Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination. Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).
  12. Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females. Genetics. 175, 1561-1569 (2007).
  13. Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes. Journal of Visualized Experiments. (129), e55378 (2017).
  14. Moens, P. B. Zebrafish: chiasmata and interference. Genome. 49, 205-208 (2006).
  15. Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies. Zebrafish. 12 (2), 174-180 (2015).
  16. Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene. Chromosome Research. 17 (6), 773 (2009).

Play Video

Cite This Article
Blokhina, Y. P., Olaya, I., Burgess, S. M. Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes. J. Vis. Exp. (157), e60671, doi:10.3791/60671 (2020).

View Video