Summary

Préparation des propagations méiotiques de chromosome des spermatocytes de poisson-zèbre

Published: March 03, 2020
doi:

Summary

Les écarts de surface nucléaires sont un outil indispensable pour étudier les événements chromosomiques pendant la méiose. Ici nous démontrons une méthode pour préparer et visualiser des chromosomes méiotiques pendant la prophase I des spermatocytes de poisson zèbre.

Abstract

La méiose est le processus cellulaire clé nécessaire pour créer des gamètes haploïdes pour la reproduction sexuelle. Les organismes modèles ont joué un rôle déterminant dans la compréhension des événements chromosomiques qui ont lieu pendant la prophase méiotique, y compris les événements d’appariement, de synapse et de recombinaison qui assurent une ségrégation chromosomique appropriée. Bien que la souris ait été un modèle important pour comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à ces processus, tous les événements méiotiques de ce système ne sont pas analogues à la méiose humaine. Nous avons récemment démontré le potentiel passionnant du poisson zèbre comme modèle de spermatogénèse humaine. Ici nous décrivons, en détail, nos méthodes pour visualiser les chromosomes méiotiques et les protéines associées dans les préparations de propagation de chromosome. Ces préparations ont l’avantage de permettre l’analyse à haute résolution des structures chromosomiques. Tout d’abord, nous décrivons la procédure pour disséquer des testicules du poisson zèbre adulte, suivi de la dissociation cellulaire, de la lyse, et de la diffusion des chromosomes. Ensuite, nous décrivons la procédure pour détecter la localisation des protéines méiotiques de chromosome, par détection d’immunofluorescence, et séquences d’acide nucléique, par hybridation in situ de fluorescence (FISH). Ces techniques constituent un ensemble utile d’outils pour l’analyse cytologique de l’architecture de la chromatine méiotique dans le système de poisson zèbre. Les chercheurs de la communauté des poissons zèbres devraient être en mesure de maîtriser rapidement ces techniques et de les intégrer dans leurs analyses standard de la fonction reproductrice.

Introduction

La reproduction sexuelle se poursuit par la combinaison de deux gamètes haploïdes, chacun portant la moitié du complément chromosomique d’une cellule somatique. La méiose est une division cellulaire spécialisée qui produit des gamètes haploïdes à travers une série de réplication de l’ADN et deux cycles successifs de ségrégation chromosomique. Dans la prophase I, les chromosomes homologues (homologs) doivent subir l’appariement, la recombinaison et la synapse, ce dernier étant caractérisé par la formation du complexe synaptonemal qui comprend deux axes homologués pontés par le filament transversal, Sycp1 (Figure 1A,B). Le défaut d’exécuter correctement ces processus peut conduire à la production de gamètes aneuploid, qui sont une cause principale de fausses couches chez l’homme1. Notre connaissance de la coordination entre l’appariement, la recombinaison et la synapse a été facilitée par des études dans un large éventail d’organismes, tels que la levure, C. elegans, la souris, et la drosophile, entre autres2. Tandis que le processus général de l’appariement homologue de chromosome suivi de la ségrégation est bien conservé, sa dépendance à la recombinaison et à la synapse et l’ordre de ces événements varie.

La formation de rupture à double brin méiotique (DSB), qui initie une recombinaison homologue, se produit près des télomères regroupés dans le bouquet pendant le leptotene et la synapse s’ensuit peu après3,4. Cette configuration de la formation de l’ASD et de l’initiation à la synapse est également une caractéristique de la méiose masculine chez l’homme, mais pas chez la souris5,6,7,8, suggérant que le poisson zèbre peut servir de modèle pour la spermatogénèse humaine. Il y a également plusieurs avantages pratiques d’étudier la méiose de poisson zèbre. Les mâles et les femelles subissent la gamétogenèse tout au long de l’âge adulte, leurs gonades sont facilement accessibles, et des centaines de descendants sont générés à partir d’une seule croix. En outre, les embryons sont transparents et se développent à l’extérieur, ce qui facilite la détection précoce des aberrations dans le développement embryonnaire en raison de gamètes aneuploides3,9. Les inconvénients de l’utilisation du poisson zèbre sont qu’ils sont lents à atteindre la maturité sexuelle (environ 60 jours) et la quantité de matière nécessaire pour les écarts de surface nucléaire doit être recueillie à partir d’animaux adultes de 10 à 20, selon leur taille.

Les préparations de propagation de chromosome méiotique sont un outil essentiel pour étudier la dynamique de chromosome à travers tous les organismes modèles, puisque les signatures clés de la dynamique méiotique de chromosome peuvent être sondées. Chez le poisson zèbre, les aspects clés de la progression du programme méiotique et de l’organisation nucléaire ont été disséqués par le biais de l’enquête sur les propagations de surface nucléaire, appelées ici les propagations chromosomiques, avec des anticorps pour la détection d’immunofluorescence des protéines et/ou des acides nucléiques par FISH3,4,9,10,11,12. En effet, la localisation polarisée des télomères groupés dans le bouquet peut être préservée dans la préparation de la propagation (Figure 1C). Récemment, nous avons utilisé des propagations du chromosome spermatocyte du poisson zèbre ainsi que des méthodes de détection de fluorescence et de microscopie à super résolution pour élucider la progression détaillée de la dynamique des télomères du poisson zèbre, de l’appariement chromosomique homologue, de la localisation des ruptures à double brin et de la synapse lors des transitions méiotiques clés3. Ici nous présentons des méthodes pour préparer des écarts de chromosome des spermatocytes des testicules de poisson zèbre et par la suite les tacher avec des sondes fluorescentes d’acide nucléique de peptide (PNA) aux séquences répétées de telomere et à la détection d’immunofluorescence des protéines associées de chromosome.

Protocol

Toutes les méthodes impliquant le poisson zèbre ont été effectuées en utilisant des normes éthiques approuvées par le Comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’UC Davis. 1. Procédure d’épandage de chromosome REMARQUE : Le protocole suivant est conçu pour créer 4-6 diapositives, avec des centaines de noyaux méiotiques de propagation par diapositive. Le nombre de testicules utilisés dépendra de la taille du poisson. Attendez-v…

Representative Results

Nous avons décrit une méthode pour préparer et visualiser les préparations de propagation de spermatocyte salèbre. Lorsqu’elle est exécutée correctement, notre procédure donne des noyaux bien répartis et non superposés. Pour récupérer de tels noyaux, il est important d’avoir la quantité appropriée de matériel de démarrage (c.-à-d. les testicules), traiter les testicules pour une durée suffisante dans la trypsine et un nombre suffisant de traitements DNase I. Ces tart…

Discussion

Ici nous décrivons des méthodes pour sonder l’emplacement des télomères et des protéines chromosome-associées dans les écarts de surface nucléaire des spermatocytes isolés des testicules de poisson zèbre. Nous nous attendons à ce que ces méthodes soient applicables pour l’analyse des spermatozoïdes chez d’autres espèces de téléostéos avec ajustement à la taille du testicule.

Alors que seulement quelques anticorps ont été élevés aux protéines méiotiques de poisson …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nous remercions Trent Newman et Masuda Sharifi pour leurs commentaires sur le manuscrit et An Nguyen pour avoir aidé à optimiser les méthodes de propagation et de coloration des chromosomes des méiocytes de poissons zèbres. Ce travail a été soutenu par NIH R01 GM079115 attribué à S.M.B.

Materials

1.5 mL centrifuge tubes Several commercial brands available
1.5 mL microcentrifuge tube rack Several commercial brands available
16% formaldehyde, methanol-free ThermoFisher Scientific 28908
2 mL Several commercial brands available
24 x 50 mm glass coverslips Corning 2980-245
24 x 60 mm glasscoverslips VWR International 16004-312
50 mL conical centrifuge tubes ThermoFisher Scientific 363696
Autoclave bag Several commercial brands available Used to make plastic coverslips.
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific BP1605-100 Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water.
Cell Strainer, 100 µm Fisher Scientific 08-771-19
CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed Biotium 203775-500uL Use at 1:1000
Chicken anti-zfSycp1 Generated by Burgess lab N/A Use at 1:100
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C0130-500MG
Coplin jar Several commercial brands available
DNase I, grade II from bovine pancreas Roche Diagnostics 10104159001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Fisher Scientific MT10014CV
Dumont No. 5 Forceps Fine Science Tools 11252-30 Two are required for dissecting the testes.
Eppendorf Tubes, 5 mL VWR International 89429-308
Formamide Fisher Scientific BP228-100
Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-11039 Use at 1:1000
Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A-11042 Use at 1:1000
Goat anti-hDMC1 Santa Cruz Biotechnology sc-8973 Does not work in our hands
Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-11008 Use at 1:1000
Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A-11012 Use at 1:1000
Goat serum Sigma-Aldrich G9023-10mL
Heparin sodium salt Sigma-Aldrich H3393-100KU
Humidity chamber Fisher Scientific 50-112-3683
Hybridization Oven VWR International 230401V (Model 5420)
Incubator Shaker New Brunswick Scientific Model Classic C25
KCl Fisher Scientific P217-500
Kimwipes Kimerbly-Clark Professional 34155 Used for the humidity chamber
KH2PO4 Fisher Scientific P285-500
Microscope Several commercial brands available Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient.
Microscope slides Fisher Scientific 12-544-7
Mouse anti-hamsterSCP3 Abcam ab97672 Does not work in our hands
Mouse anti-hMLH1 BD Biosciences 550838 Does not work in our hands
Mouse anti-hRPA Sigma-Alrich MABE285 Does not work in our hands
Na2HPO4 · 7 H2O Fisher Scientific S373-500
NaCl Fisher Scientific S271-3
Photo-Flo 200 solution Electron Microscopy Sciences 74257
Plastic transfer pipettes Several commercial brands available
PNA TelC-Alexa647 PNA Bio Inc F1013 Prepare as per manufacturer's instructions.
PNA TelC-Cy3 PNA Bio Inc F1002 Prepare as per manufacturer's instructions.
ProLong Diamond Antifade Mountant ThermoFisher Scientific P36970
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI ThermoFisher Scientific P36971
Rabbit anti-hRPA Bethyl A300-244A Use at 1:300
Rabbit anti-hSCP3 Abcam ab150292 Use at 1:200
Rabbit anti-hRad51 GeneTex GTX100469 Use at 1:300
Sodium citrate Fisher Scientific S279-500
Sucrose Fisher Scientific S5-500
Supercut Scissors, 30° angle, 10 cm Fisher Scientific 50-822-353 Can also use any pair of small scissors.
Sylgard kit Fisher Scientific NC9897184 Prepare as per manufacturer's instructions.
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100 Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight.
Trypsin Worthington Biochemical LS003708
Trypsin inhibitor from chicken egg white Sigma-Aldrich T9253-500MG
Tween 20 Bio-Rad 170-6531 Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature.
Vannas Spring Scissors – 4 mm (micro scissors) Fine Science Tools 15018-10

References

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Cite This Article
Blokhina, Y. P., Olaya, I., Burgess, S. M. Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes. J. Vis. Exp. (157), e60671, doi:10.3791/60671 (2020).

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