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Genetics

जेब्राफिश स्पर्मेटोसाइट्स से मेओटिक क्रोमोसोम स्प्रेड की तैयारी

doi: 10.3791/60671 Published: March 3, 2020

Summary

परमाणु सतह फैलता है meiosis के दौरान गुणसूत्र घटनाओं का अध्ययन करने के लिए एक अनिवार्य उपकरण हैं । यहां हम जेब्राफिश शुक्राणुओं से प्रोफेज I के दौरान मेयोटिक गुणसूत्रों को तैयार करने और कल्पना करने के लिए एक विधि प्रदर्शित करते हैं।

Abstract

मेयोसिस यौन प्रजनन के लिए हैप्लॉयड गेमट्स बनाने के लिए आवश्यक प्रमुख सेलुलर प्रक्रिया है। मॉडल जीवों ने मेओटिक प्रोफेज के दौरान होने वाली गुणसूत्र घटनाओं को समझने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है, जिसमें पेयरिंग, सिनैप्सिस और पुनर्संयोजन घटनाएं शामिल हैं जो उचित गुणसूत्र अलगाव सुनिश्चित करती हैं। जबकि माउस इन प्रक्रियाओं में अंतर्निहित आणविक तंत्र को समझने के लिए एक महत्वपूर्ण मॉडल रहा है, इस प्रणाली में सभी मेयोटिक घटनाएं मानव मेयोसिस के अनुरूप नहीं हैं। हमने हाल ही में मानव शुक्राणुओं के मॉडल के रूप में जेब्राफिश की रोमांचक क्षमता का प्रदर्शन किया। यहां हम विस्तार से वर्णन करते हैं, गुणसूत्र प्रसार तैयारी में मेयोटिक गुणसूत्रों और संबद्ध प्रोटीन की कल्पना करने के हमारे तरीके। इन तैयारियों में गुणसूत्र संरचनाओं के उच्च संकल्प विश्लेषण की अनुमति देने का लाभ है। सबसे पहले, हम वयस्क ज़ेब्राफिश से टेस्ट विच्छेदन की प्रक्रिया का वर्णन करते हैं, जिसके बाद सेल विसोशन, लिसिस और गुणसूत्रों के प्रसार होते हैं। इसके बाद, हम मेटालु संकरण (मछली) में फ्लोरेसेंस द्वारा इम्यूनोफ्लोरेसेंस डिटेक्शन, और न्यूक्लिक एसिड दृश्यों द्वारा मेयोटिक गुणसूत्र प्रोटीन के स्थानीयकरण का पता लगाने की प्रक्रिया का वर्णन करते हैं। इन तकनीकों में जेब्राफिश सिस्टम में मेओटिक क्रोमेटिन वास्तुकला के साइटोलॉजिकल विश्लेषण के लिए उपकरणों का एक उपयोगी सेट शामिल है। जेब्राफिश समुदाय के शोधकर्ताओं को इन तकनीकों में जल्दी से महारत हासिल करने और उन्हें प्रजनन कार्य के अपने मानक विश्लेषणों में शामिल करने में सक्षम होना चाहिए।

Introduction

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यौन प्रजनन दो हैप्लॉयड गेमट्स के संयोजन के माध्यम से आगे बढ़ता है, प्रत्येक दैहिक कोशिका के आधे गुणसूत्र पूरक को ले जाता है। Meiosis एक विशेष सेल डिवीजन है जो डीएनए प्रतिकृति के एक दौर और गुणसूत्र अलगाव के लगातार दो दौर के माध्यम से हैप्लॉयड गेमट्स का उत्पादन करता है। प्रोफेज I में, समरूप गुणसूत्र (समरूपता) को पेयरिंग, पुनर्संयोजन और सिनैप्सिस से गुजरना होगा, जिनमें से उत्तरार्द्ध सिनैपटोनल परिसर के गठन की विशेषता है जिसमें ट्रांसवर्स फिलामेंट, सिसीपी1(चित्रा 1ए, बी)द्वारा ब्रिजित दो होमोलॉग कुल्हाड़ी शामिल हैं। इन प्रक्रियाओं को ठीक से निष्पादित करने में विफलता एन्यूप्लाइड गेमट्स के उत्पादन का कारण बन सकती है, जो मनुष्यों में गर्भपात का एक प्रमुख कारणहैं 1। बांधना, पुनर्संयोजन और सिनेप्सिस के बीच समन्वय के बारे में हमारे ज्ञान को खमीर, सी एलिगेंस,माउस और ड्रोसोफिलाजैसे जीवों की एक विस्तृत श्रृंखला में अध्ययन द्वारा सुविधाप्रदान की गई है, जो अन्य2के बीच हैं। जबकि अलगाव के बाद के अनुसार गुणसूत्र बांधना की सामान्य प्रक्रिया अच्छी तरह से संरक्षित है, पुनर्संयोजन और सिनेप्सिस पर इसकी निर्भरता और इन घटनाओं का क्रम भिन्न होता है।

मेओटिक डबल-स्ट्रैंड ब्रेक (डीएसबी) गठन, जो समरूप पुनर्संयोजन शुरू करता है, लेप्टोटिन के दौरान गुलदस्ता में संकुल टेलोमेरेस के पास होता है और सिनेप्सिस3,4के तुरंत बाद होता है। डीएसबी गठन और सिनेप्सिस दीक्षा का यह विन्यास मनुष्यों में पुरुष मेयोसिस की एक विशेषता भी है, लेकिन माउस5,6,7,8में नहीं, यह सुझाव देता है कि जेब्राफिश मानव शुक्राणुओं के लिए एक मॉडल के रूप में काम कर सकता है। जेब्राफिश मेयोसिस का अध्ययन करने के कई व्यावहारिक फायदे भी हैं। पुरुषों और महिलाओं दोनों वयस्कता के दौरान गेमटोजेनेसिस से गुजरते हैं, उनके गोनाड्स आसानी से सुलभ होते हैं, और सैकड़ों संतान एक ही क्रॉस से उत्पन्न होते हैं। इसके अतिरिक्त, भ्रूण पारदर्शी होते हैं और बाहरी रूप से विकसित होते हैं, जो एन्यूप्लाइड गेमट्स3,9के कारण भ्रूणीय विकास में विपथनों का शीघ्र पता लगाने की सुविधा प्रदान करता है। जेब्राफिश का उपयोग करने के नुकसान यह हैं कि वे यौन परिपक्वता (~ 60 दिनों) तक पहुंचने के लिए धीमे हैं और परमाणु सतह स्प्रेड के लिए आवश्यक सामग्री की मात्रा उनके आकार के आधार पर ~ 10-20 वयस्क जानवरों से एकत्र की जानी चाहिए।

मेओटिक गुणसूत्र प्रसार तैयारी सभी मॉडल जीवों में गुणसूत्र गतिशीलता का अध्ययन करने के लिए एक महत्वपूर्ण उपकरण है, क्योंकि मेयोटिक गुणसूत्र गतिशीलता के प्रमुख हस्ताक्षरों की जांच की जा सकती है। जेब्राफिश में, मेयोटिक कार्यक्रम और परमाणु संगठन की प्रगति के प्रमुख पहलुओं को परमाणु सतह फैलने की जांच के माध्यम से विच्छेदित किया गया है, जिसे यहां गुणसूत्र स्प्रेड के रूप में संदर्भित किया गया है, जिसमें प्रोटीन का इम्यूनोफ्लोरेसेंस डिटेक्शन के लिए एंटीबॉडी और/या न्यूक्लिक एसिड मछली3,4,9,10,11,12द्वारा । दरअसल, गुलदस्ता में संकुल टेलोमेरेस के ध्रुवीकृत स्थानीयकरण को प्रसार तैयारी(चित्रा 1 C)में संरक्षित किया जा सकता है। हाल ही में, हमने जेब्राफिश शुक्राणुओं का उपयोग किया है फ्लोरेसेंस डिटेक्शन विधियों और सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी के साथ जेब्राफिश टेलोमेरे गतिशीलता, समरूप गुणसूत्र बांधना, डबल-स्ट्रैंड ब्रेक स्थानीयकरण, और प्रमुख मेयोटिक संक्रमण3में सिनेप्सिस की विस्तृत प्रगति को स्पष्ट करने के लिए। यहां हम जेब्राफिश टेस्ट के शुक्राणुओं से गुणसूत्र फैलता तैयार करने के तरीके प्रस्तुत करते हैं और बाद में उन्हें फ्लोरोसेंट पेप्टाइड न्यूक्लिक एसिड (पीएनए) जांच के साथ बार-बार टेलोमेरे दृश्यों और गुणसूत्र से जुड़े प्रोटीन का इम्यूनोफ्लोरेसेंस डिटेक्शन के लिए दाग देते हैं।

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Protocol

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जेब्राफिश से जुड़े सभी तरीकों को यूसी डेविस में संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित नैतिक मानकों का उपयोग करके किया गया था ।

1. गुणसूत्र फैलने की प्रक्रिया

नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल 4-6 स्लाइड बनाने के लिए डिज़ाइन किया गया है, जिसमें प्रति स्लाइड सैकड़ों फैल मेयोटिक नाभिक हैं। इस्तेमाल किए गए टेस्ट की संख्या मछली के आकार पर निर्भर करेगी। निषेचन (एमपीएफ) के बाद ~ 60 दिनों के बाद 20 जानवरों का उपयोग करने की उम्मीद करें। बड़े जेब्राफिश (जैसे, एमपीएफ 12) 10 जानवरों के लिए पर्याप्त होना चाहिए। ध्यान रखें कि कुछ मेयोटिक म्यूटेंट (जैसे, spo11-/)के टेस्ट कुछ छोटे3होंगे। इस प्रोटोकॉल में, टेस्ट के एक पूल को एक नमूना माना जाता है। यह सिफारिश की जाती है कि 4 से अधिक नमूने समानांतर रूप से तैयार नहीं किए जाते हैं।

  1. स्प्रेइंग प्रक्रिया शुरू करने से पहले निम्नलिखित समाधान बनाएं
    नोट: भविष्य में प्रसार प्रयोगों में उपयोग के लिए निर्दिष्ट मात्राओं में निम्नलिखित समाधान तैयार करना सुविधाजनक है।
    1. आसुत पानी के 100 मीटर में 3.42 ग्राम सुक्रोज को भंग करके 0.1 मीटर सुक्रोज समाधान तैयार करें। पीएच 8 का उपयोग करके पीएच 8 में सुक्रोज समाधान लाएं जो पीएच 8 में भी है। फिर सुक्रोज समाधान को फ़िल्टर करें। कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
    2. आसुत पानी के 1.8 एल में 1.37 एम एनआइसी, 27 एमएम केसीएल, 73 एमएम एनए2एचएमओ4 और 27.6 एमएम केएच2पीओ4 की अंतिम एकाग्रता के लिए 10x फॉस्फेट-बफरेड लवलाइन (पीबीएस) स्टॉक सॉल्यूशन बनाएं। भंग होने तक हिलाओ, फिर NaOH और autoclave का उपयोग कर 7.3 पीएच समायोजित करें। कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
    3. बाँझ आसुत पानी में एक ४०० μg/mL DNase मैं समाधान बनाओ । -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। इस समाधान के 5 मिलील को तैयार करने और फिर 100 माइक्रोन एलिकोस के रूप में स्टोर करने की सिफारिश की जाती है।
  2. प्रसार प्रोटोकॉल के दिन निम्नलिखित समाधान करें
    नोट: समय दक्षता के लिए, सभी टेस्ट विच्छेदन के तुरंत बाद कोलेजेनेस समाधान करना सबसे अच्छा है और फिर उस समय के दौरान ट्राइप्सिन और ट्राइप्सिन अवरोधक समाधान करें कि नमूनों का कोलेजेनेज़ में इलाज किया जा रहा है।
    1. प्रति नमूना (2% w/v कोलेजेनेस अंतिम एकाग्रता) के प्रति Dulbecco संशोधित ईगल माध्यम (DMEM) के 200 μL में 4 मिलीग्राम कोलेजेनेस भंग करें। जरूरत होने तक बर्फ पर रखें। कोलेजेनेस टेस्टेस को अलग कर देगा।
    2. प्रति नमूना डीएमईएम के 200 माइक्रोन में 1.4 मिलीग्राम ट्राइप्सिन भंग करें (0.7% w/v ट्राइप्सिन अंतिम एकाग्रता)। जरूरत होने तक बर्फ पर रखें। ट्राइप्सिन कोशिकाओं को अलग करने में मदद करेगा।
    3. प्रति नमूना डीएमईएम के 500 माइक्रोन में 10 मिलीग्राम ट्राइप्सिन अवरोधक को भंग करें (2% w/v ट्राइप्सिन अवरोधक अंतिम एकाग्रता)। जरूरत होने तक बर्फ पर रखें। ट्राइप्सिन अवरोधक ट्राइप्सिन को कोशिकाओं को अपमानजनक होने से रोकता है।
    4. बाँझ आसुत पानी में 0.15% ट्राइटन एक्स-100 के साथ 1% फॉर्मलडिहाइड समाधान (16% पूर्व-निर्मित समाधान से) तैयार करें। जरूरत होने तक बर्फ पर रखें। 1% फॉर्मेल्डिहाइड तैयार किया जा सकता है जबकि टेस्टेस का इलाज ट्राइप्सिन और डैनेस I (यानी, स्प्रेडिंग प्रक्रिया के चरण 1.4.7 के दौरान) के साथ किया जा रहा है।
      सावधानी: फॉर्मलडिहाइड खतरनाक है।
  3. वयस्क पुरुष ज़ेब्राफ़िश से वृषण का विच्छेदन
    1. नर जेब्राफिश (>60 डीपीएफ) को बर्फ के पानी में डूबकर। मछली बर्फ के पानी में रखा जा सकता है जब तक विच्छेदन के लिए तैयार है, लेकिन वे जितनी जल्दी हो सके विच्छेदन किया जाना चाहिए ।
      नोट: जंगली प्रकार तनाव एबी इस प्रक्रिया के लिए प्रयोग किया जाता है, लेकिन अन्य जंगली प्रकार उपभेदों भी उत्तरदायी होना चाहिए। सबसे लंबे समय तक हम बर्फ के पानी में मछली रखा है विच्छेदन से पहले प्रोटोकॉल पर किसी भी ध्यान देने योग्य प्रभाव के बिना 3 एच है ।
    2. छोटी कैंची के साथ एक समय में एक मछली decapitate और फिर शरीर गुहा का पर्दाफाश करने के लिए वेंट्रल मिडलाइन के साथ कटौती करने के लिए माइक्रो कैंची का उपयोग करें ।
    3. माइक्रोस्कोप के नीचे 1.65x आवर्धन पर संदंश (सामग्री की तालिकादेखें) का उपयोग करके टेस्टिस को विच्छेदन करें। 1x पीबीएस के उथले पूल द्वारा कवर के साथ एक सिलिकॉन-लेपित पेट्री डिश में विच्छेदन को पूरा करें।
      नोट: टेस्टिस तैरने वाले मूत्राशय और आंत के बीच में स्थित है और मांसपेशियों के ऊतकों(चित्रा 2ए)की तुलना में हल्का दिखाई देगा। जेब्राफिश(चित्रा 2बी)से हटाए जाने पर टेस्टिस में 2 लोब होने चाहिए।
    4. जितना हो सके टेस्टिस से ज्यादा फैट और आसपास के टिश्यू निकालें। फिर प्रत्येक विच्छेदित टेस्टिस को सीधे डीएमईएम के 2 मिलील के साथ 5 मिलील ट्यूब में जोड़ें और बर्फ पर रखें।
      नोट: कदम 1.3.3 और 1.3.4 किसी भी प्रयोग करने से पहले महारत हासिल होनी चाहिए।
  4. वृषण कोशिकाओं का विसोजन
    1. 0.1 मीटर सुक्रोज समाधान के पूर्व गर्म 100 मीटर 37 डिग्री सेल्सियस करने के लिए।
    2. टेस्ट के साथ 5 mL ट्यूब के लिए कोलेजेनेज़ समाधान के 200 μL जोड़ें। समाधान को कई बार उलटा बनाकर मिलाएं।
    3. धीरे-धीरे एक इनक्यूबेटर शेकर में टेस्ट को क्षैतिज रूप से 100 आरपीएम पर 32 डिग्री सेल्सियस पर 50 डिग्री सेल्सियस के लिए एक घंटे तक हिलाएं जब तक कि डीएमईएम बादल छाए रहे और टेस्ट छोटे हिस्से में न हों। विसोजन की सुविधा के लिए हर 10 सीन को तेजी से उलटा करें।
    4. कोलेजेनेस को धोने के लिए, डीएमईएम को अंतिम 5 mL वॉल्यूम में जोड़ें और ट्यूब को कई बार उलटा करें। कमरे के तापमान पर 3 न्यूनतम के लिए ~ 200 x ग्राम पर टेस्ट पैलेट। अधिनेता के 3 mL निकालें ताकि केवल 2 mL ही रह सके।
      नोट: डीएमईएम के अतिरिक्त, हटाने और हस्तांतरण गुणसूत्र प्रसार प्रक्रिया की संपूर्णता के लिए प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट के साथ किया जाता है।
    5. कुल 3 डीएमईएम वॉश के लिए दो बार और दोहराएं कदम 1.4.4। डीएमईएम वॉश के बीच गोली को फिर से निलंबित न करें। पिछले डीएमईएम वॉश के बाद, सुपरनेटेंट के 4 mL को हटा दें ताकि केवल 1 mL रह जाए।
    6. 2 mL की कुल मात्रा के लिए डीएमईएम के 1 mL जोड़ें और ट्राइप्सिन समाधान के 200 माइक्रोन और DNase I समाधान के 20 μL जोड़ें। समाधान मिलाने के लिए कई बार ट्यूब को उलटदें।
    7. 100 आरपीएम पर 5-15 मीटर के लिए 32 डिग्री सेल्सियस पर ट्यूब को क्षैतिज रूप से हिलाएं जब तक कि डीएमईएम समाधान में केवल कुछ झुरमुट न हों। विसोजन की सुविधा के लिए हर 5 मिन से ट्यूब को तेजी से उलटा करें।
      नोट: झुरमुट मिलाने के बाद काफी छोटा होना चाहिए।
    8. ट्राइप्सिन अवरोधक समाधान के 500 माइक्रोन जोड़ें और DNase I समाधान के 50 μL। ट्यूब को मिश्रण करने के लिए कई बार उलटा करें, फिर कमरे के तापमान पर 3 मिन के लिए ~ 200 x ग्राम पर कम करें ताकि तरल या झुरमुट को हटाया जा सके जो ट्यूब कैप या ट्यूब के किनारे का पालन कर सकते हैं।
    9. बर्फ पर ट्यूब प्लेस और 2 मिन के लिए एक प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट के साथ बार-बार पाइपिंग करके सेल निलंबन को फिर से निलंबित करें ताकि किसी भी शेष झुरमुटों के विजन की सुविधा हो सके। सेल निलंबन को ट्रांसफर पिपेट के बल्ब में न जाने दें। 2 मिन के बाद, निलंबन वापस 5 mL ट्यूब में पिपेट ।
    10. प्री-वेट डीएमईएम के साथ 100 माइक्रोन सेल छलनी और बर्फ पर 50 मीटर ट्यूब के शीर्ष पर रखें।
    11. प्लास्टिक ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके एक समय में छलनी एक बूंद के माध्यम से सेल निलंबन स्थानांतरित करें। सुनिश्चित करें कि सेल निलंबन स्थानांतरण पिपेट के बल्ब में न जाए।
    12. एक प्लास्टिक ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके फिल्ट्रेट को एक नए 5 mL ट्यूब में स्थानांतरित करें और डीएमईएम को 5 mL की अंतिम मात्रा में जोड़ें। एक साफ प्लास्टिक हस्तांतरण पिपेट के साथ फिल्टर के नीचे से जुड़ी पूल्ड कोशिकाओं को इकट्ठा करना सुनिश्चित करें। कमरे के तापमान पर 5 न्यूनतम के लिए ~ 200 x ग्राम पर कोशिकाओं को गोली।
    13. गोली को परेशान किए बिना जितना संभव हो उतना अधिनायक निकालें।
    14. DNase I समाधान के 5 μL सीधे गोली में जोड़ें। फिर एक खाली 1.5 mL माइक्रोसेंटरिफ्यूज ट्यूब रैक के साथ ट्यूब के बाहर के नीचे 4-5 बार धीरे-धीरे स्क्रैप करके DNase I समाधान के साथ गोली मिलाएं। स्क्रैपिंग भी कठोरता से बरामद फैलता की कमी में परिणाम कर सकते हैं ।
    15. डीएमईएम को 5 मिलील की अंतिम मात्रा में जोड़ें और कई बार ट्यूब को उलटकर समाधान मिलाएं। पहले DNase I उपचार के बाद अभी भी मौजूद होना झुरमुट ों के लिए आम है।
    16. कमरे के तापमान पर 2 न्यूनतम के लिए ~ 200 x ग्राम पर सेल निलंबन को गोली दें।
    17. 1.4.13-1.4.16 को एक अतिरिक्त 1-3 बार दोहराएं जब तक कि पुनर्निलंबित गोली DMEM के अलावा पर झुरमुट नहीं है। अंतिम स्पिन के बाद, गोली को परेशान किए बिना जितना संभव हो उतना अधिनायक को हटा दें।
      नोट: हर DNase मैं उपचार के साथ गोली के आकार में कमी की उम्मीद; 4 कुल DNase से अधिक मैं धोता कोशिकाओं की महत्वपूर्ण हानि में परिणाम हो सकता है । यदि DNase I उपचार चरणों के बाद कोई गोली दिखाई नहीं देती है, तो प्रक्रिया के साथ आगे न बढ़ें। किसी भी अप्रयुक्त DNase मैं त्यागें।
    18. 1x पीबीएस के 1 mL जोड़ें और धीरे से एक खाली १.५ mL ट्यूब रैक के साथ ट्यूब के बाहर नीचे खुरचन द्वारा गोली को फिर से निलंबित ।
    19. 5 मिन के लिए ~ 200 x ग्राम पर सेल निलंबन को गोली दें तो गोली को परेशान किए बिना जितना संभव हो उतना अधिनायक को हटा दें।
    20. एपर्चर को चौड़ा करने के लिए 200 माइक्रोन पिपेट टिप के अंत से ~ 3 मिमी काटें और कटौती पाइपेट टिप के साथ ऊपर और नीचे पाइपिंग करके 0.1 एम सुक्रोज समाधान के ~ 80 माइक्रोन में गोली को फिर से निलंबित करें। सेल निलंबन 3 न्यूनतम के लिए कमरे के तापमान पर बैठने दें।
  5. कांच की स्लाइड्स पर गुणसूत्रों का प्रसार
    1. कोट एक पिपेट टिप के पक्ष के साथ 0.15% ट्राइटन एक्स-100 के साथ 1% फॉर्मलडिहाइड के 100 माइक्रोन के साथ एक स्लाइड। फिर लंबी किनारे पर लंबवत एक सीधी रेखा में स्लाइड के केंद्र पर सुक्रोज सेल निलंबन के 18 μL जोड़ें । सभी कोनों में सेल निलंबन के प्रसार की सुविधा के लिए आगे और पीछे (~ 60 डिग्री) स्लाइड झुकाएं।
    2. स्लाइड्स फ्लैट को थोड़ा फटा खुली आर्द्रता कक्ष(चित्रा 3)में रखें ताकि फॉर्मलडिहाइड समाधान को सूखने से रोका जा सके। आर्द्रता कक्ष को रात भर अंधेरे दराज में रखें।
    3. आर्द्रता कक्ष से ढक्कन निकालें और स्लाइड को पूरी तरह से सूखने की अनुमति दें।
    4. स्लाइड्स में रखें कोप्लिन जार फिर कोप्लिन जार को आसुत पानी से भरें और कमरे के तापमान पर कोमल मिलाते हुए 5 सीन के लिए इनक्यूबेट करें ।
      नोट: स्लाइड को कोप्लिन जार प्रति स्लाइड की संख्या को अधिकतम करने के लिए एक टेढ़ा पैटर्न में कोप्लिन जार में रखा जा सकता है। सुनिश्चित करें कि सभी स्लाइडों के बीच तरल के लिए जगह है।
    5. पानी डालें और जार को 1:250 गीला एजेंट के साथ भरें (सामग्री की तालिकादेखें)। कमरे के तापमान पर कोमल मिलाते हुए के साथ 5 न्यूनतम के लिए 2 बार धोएं।
    6. स्लाइड्स को पूरी तरह से सूखने दें और -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें जब तक कि वे दाग न हों।
      नोट: सबसे लंबे समय तक हम गुणसूत्रों की किसी भी ध्यान देने योग्य गिरावट के बिना स्लाइड संग्रहीत किया है ~ 2 महीने है ।

2. टेलोमेरे पीएनए जांच धुंधला

नोट: टेलोमेरे दोहराता फ्लोरोफोर-कंजुगेड टेलोमेरे पीएनए जांच का उपयोग करके दाग लगाया जा सकता है जो अग्रणी स्ट्रैंड टेलोमेरे रिपीट (CCCTAA) को संकरण करता है। PNA जांच एक तटस्थ रीढ़ की हड्डी है, जो नकारात्मक आरोप लगाया डीएनए के लिए संकरण आत्मीयता बढ़ जाती है, कोई पृष्ठभूमि के लिए थोड़ा में जिसके परिणामस्वरूप । टेलोमेरे जांच कदम वैकल्पिक है । एंटीबॉडी धुंधला करने के लिए आगे बढ़ने के लिए, 1x पीबीएस में स्लाइड को रिहाइड्रेट करें जैसा कि चरण 2.2.2 में इंगित किया गया है, फिर सीधे "प्राथमिक एंटीबॉडी धुंधला" पर आगे बढ़ें।

  1. टेलोमेरे धुंधला शुरू करने से पहले PNA जांच अभिकर्मक बनाओ
    नोट: भविष्य के प्रयोगों में उपयोग के लिए निर्दिष्ट मात्राओं में निम्नलिखित समाधान तैयार करना सुविधाजनक है। भंडारण की स्थिति नीचे नोट की जाती है।
    1. 20x खारा-सोडियम साइट्रेट (एसएससी) समाधान के 2 एल 3 एम NaCl और 0.3 मीटर सोडियम साइट्रेट की अंतिम एकाग्रता के साथ तैयार करें। ऑटोक्लेव और कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
    2. 50% फॉर्मामाइड, 5x एसएससी, 50 μg/mL हेपरिन, 500 μg/mL ट्रांसफर आरएनए, 0.1% ट्वीन 20 की अंतिम एकाग्रता के लिए स्थानांतरण आरएनए युक्त पूर्व-संकरण समाधान के 50 मीटर बनाएं और पीएच ~ 6 के समाधान को लाने के लिए 1 एम साइट्रिक एसिड के 460 माइक्रोन जोड़ें। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      सावधानी: फॉर्ममाइड खतरनाक है। एक धूम हुड में समाधान तैयार करें।
    3. स्थानांतरण आरएनए को जोड़े बिना चरण 2.1.2 में तैयार पूर्व-संकरण समाधान के 50 मीटर बनाएं। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
    4. पीएनए टेलोमेरे प्रोब्स टेलसी-Cy3 और TelC-Alexa647 निर्माता के निर्देशों के अनुसार फॉर्मामाइड में 50 माइक्रोन स्टॉक के रूप में तैयार किए जाते हैं। पीएनए जांच को 8 μL aliquots के रूप में स्टोर करें - 80 डिग्री सेल्सियस पर।
    5. बाँझ आसुत पानी में गोजातीय सीरम एल्बुमिन (बीएसए) के कम से कम 1 00 मिलीग्राम/एमएल स्टॉक सॉल्यूशन बनाएं। -20 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। यदि स्टॉक बीएसए के 1 मिलीएल से अधिक तैयारी कर रहे हैं, तो समाधान को 1 मिलीएल aliquots के रूप में स्टोर करें।
    6. 2 मिलीग्राम ट्यूब का उपयोग करके, 100 मिलीग्राम/एमएल बीएसए के 27 माइक्रोन और 50 माइक्रोन पीएनए जांच के 8 माइक्रोन को पूर्व-संकरण समाधान के 1.965 मिलील में जोड़कर संकरण समाधान के 2 मिलीएल तैयार करें जिसमें स्थानांतरण आरएनए शामिल है। -20 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में स्टोर करें।
  2. PNA टेलोमेरे जांच धुंधला
    1. हाइब्रिडाइजेशन ओवन को 82 डिग्री सेल्सियस तक प्रीहीट करें।
    2. कमरे के तापमान पर एक आर्द्रता कक्ष में 5 न्यूनतम के लिए प्रति स्लाइड 1x पीबीएस के 500 माइक्रोन के साथ री-हाइड्रेट स्लाइड। एक कागज तौलिया पर स्लाइड के पक्ष का दोहन करके पीबीएस निकालें।
    3. स्लाइड ्स और 2 mL ट्यूब जिसमें 2 min के लिए गर्म संकरण ओवन में धातु की सतह पर सीधे संकरण समाधान होता है।
    4. स्लाइड्स को मेटल की सतह पर रखते हुए, प्रति स्लाइड हाइब्रिडाइजेशन सॉल्यूशन के 100 माइक्रोन जोड़ें और फिर स्लाइड्स को प्लास्टिक कवरस्लिप (~ 25 मिमी x 75 मिमी) कट के साथ कवर करें ताकि ऑटोक्लेव बैग को आकार दिया जा सके। 10-12 मीटर के लिए 82 डिग्री सेल्सियस पर बैठते हैं।
    5. स्लाइड्स में रखें आर्द्रता कक्ष को 16-24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर अंधेरे में रखें। इस बिंदु से आगे और प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी धुंधला के लिए, स्लाइड फ्लोरेसेंस संकेत की फोटोब्लीचिंग से बचने के लिए अंधेरे में रखा जाना चाहिए । ऊष्मायन अवधि के बाद, एंटीबॉडी धुंधला के लिए अभिकर्मकों को चरण 2.2.9 के दौरान तैयार किया जा सकता है।
    6. एक पिपेट टिप के साथ कवरस्लिप निकालें।
      नोट: कवरस्लिप को हटाने की सुविधा के लिए, कोई हस्तांतरण आरएनए के साथ संकरण समाधान के ~ 50-100 μL धीरे स्लाइड और कवरस्लिप के बीच तिरस्कृत किया जा सकता है के रूप में कवरस्लिप उठाया जा रहा है ।
    7. प्रत्येक स्लाइड पर कोई हस्तांतरण आरएनए के साथ पूर्व संकरण समाधान के पिपेट 500 μL और कमरे के तापमान पर 15 min के लिए आर्द्रता कक्ष में स्लाइड जगह है। एक कागज तौलिया पर स्लाइड के पक्ष का दोहन करके समाधान निकालें।
      नोट: कोई हस्तांतरण आरएनए के साथ पूर्व संकरण समाधान प्रत्येक स्लाइड पर जोड़ा जा रहा से पहले पूर्व गर्म नहीं है ।
    8. प्रत्येक स्लाइड में 1x पीबीएस में कोई स्थानांतरण आरएनए के साथ 50% पूर्व संकरण समाधान के 500 माइक्रोन और कमरे के तापमान पर 15 न्यूनतम के लिए आर्द्रता कक्ष में स्लाइड जगह है। एक कागज तौलिया पर स्लाइड के पक्ष का दोहन करके समाधान निकालें।
    9. स्लाइड्स को कोप्लिन जार में स्थानांतरित करें और कमरे के तापमान पर 15 न्यूनतम धोने के लिए कोमल मिलाते हुए 1x पीबीएस में 3 बार धोएं।
    10. स्लाइड्स में जानिए कोप्लिन जार से और एक पेपर तौलिया पर स्लाइड के साइड को टैप करके अतिरिक्त पीबीएस निकालें। फिर 3.2 "प्राथमिक एंटीबॉडी धुंधला" कदम के लिए आगे बढ़ें।

3. एंटीबॉडी धुंधला

नोट: ज्ञात मेयोटिक प्रोटीन के लिए उठाए गए एंटीबॉडी का उपयोग स्प्रेड गुणसूत्र तैयारी में इम्यूनोफ्लोरेसेंस डिटेक्शन के लिए किया जा सकता है। विभिन्न फ्लोरोफोरस के लिए संयुग्मित माध्यमिक एंटीबॉडी कई प्रोटीन को एक साथ दाग देने की अनुमति देता है, अगर प्राथमिक एंटीबॉडी विभिन्न जानवरों में उठाए गए थे।

  1. प्राथमिक और माध्यमिक एंटीबॉडी धुंधला के दिन निम्नलिखित समाधान करें
    1. 1x पीबीएस और 0.1% ट्राइटन एक्स-100 आसुत पानी में पतला के साथ पीबीटी के 1 एल बनाओ। कमरे के तापमान पर स्टोर करें। यह समय से पहले और भविष्य में फैल ने वाले प्रयोगों के लिए बड़ी मात्रा में तैयार किया जा सकता है।
    2. बीएसए के 2 मिलीग्राम/एमएल और पीबीटी में 2% बकरी सीरम की अंतिम एकाग्रता के लिए प्रति स्लाइड एंटीबॉडी ब्लॉक के 500 माइक्रोन तैयार करें।
    3. प्रति स्लाइड प्राथमिक या माध्यमिक एंटीबॉडी मिश्रण के 100 माइक्रोन बनाने के लिए, एंटीबॉडी ब्लॉक में सही एकाग्रता (सामग्री की तालिकादेखें) पर उपयुक्त एंटीबॉडी जोड़ें।
      नोट: एंटीबॉडी एकाग्रता अनुभवजन्य निर्धारित करने की आवश्यकता हो सकती है। चर्चा में, हम एंटीबॉडी की एक सूची हम सफलता के साथ कोशिश की है (कमजोर पड़ने के साथ/
  2. प्राथमिक एंटीबॉडी धुंधला
    नोट: खरगोश विरोधी मानव SCP3 और चिकन विरोधी जेब्राफिश Sycp1 आम तौर पर प्राथमिक एंटीबॉडी धुंधला के लिए उपयोग किया जाता है ।
    1. स्लाइड्स से अतिरिक्त पीबीएस हटाने के बाद, प्रति स्लाइड एंटीबॉडी ब्लॉक के 500 माइक्रोन जोड़ें और स्लाइड को कमरे के तापमान पर एक आर्द्रता कक्ष में न्यूनतम 20 न्यूनतम के लिए रखें।
    2. पेपर तौलिया पर स्लाइड के किनारे टैप करके एंटीबॉडी ब्लॉक निकालें।
    3. प्रति स्लाइड एंटीबॉडी ब्लॉक में प्राइमरी एंटीबॉडी मिक्स के 100 माइक्रोन जोड़ें और स्लाइड्स को ऑटोक्लेव बैग से बने प्लास्टिक कवरस्लिप से कवर करें। स्लाइड्स में रात भर आर्द्रता कक्ष में 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    4. एक पिपेट टिप के साथ कवरस्लिप निकालें और कमरे के तापमान पर कोमल मिलाते हुए के साथ एक Coplin जार में 1x PBS के साथ प्रत्येक के न्यूनतम 5 मिनट के लिए स्लाइड 2 बार धोने ।
    5. एक कागज तौलिया पर स्लाइड के पक्ष का दोहन करके पीबीएस निकालें।
  3. माध्यमिक एंटीबॉडी धुंधला
    नोट: विभिन्न फ्लोरोफोरस के लिए Conjugated बकरी विरोधी खरगोश और विरोधी चिकन एंटीबॉडी एक 1:1000 एकाग्रता पर धुंधला करने के लिए उपयोग किया जाता है ।
    1. प्रति स्लाइड एंटीबॉडी ब्लॉक के 500 माइक्रोन जोड़ें और कमरे के तापमान पर आर्द्रता कक्ष में स्लाइड ों को न्यूनतम 5 न्यूनतम के लिए रखें।
    2. पेपर तौलिया पर स्लाइड के किनारे टैप करके एंटीबॉडी ब्लॉक निकालें।
    3. प्रति स्लाइड एंटीबॉडी ब्लॉक में 100 माइक्रोन मिक्स जोड़ें और स्लाइड्स को ऑटोक्लेव बैग से बने प्लास्टिक कवरस्लिप से कवर करें। स्लाइड्स में 1 घंटे के लिए आर्द्रता कक्ष में 37 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
    4. एक पिपेट टिप के साथ कवरस्लिप निकालें और कमरे के तापमान पर कोमल मिलाते हुए के साथ एक Coplin जार में 1x PBS के साथ प्रत्येक की एक ंयूनतम 5 न्यूनतम के लिए स्लाइड 3 बार धोने ।
    5. स्लाइड्स में एक बार कुल्ला करें कमरे के तापमान पर कोमल मिलाते हुए कोप्लिन जार में आसुत पानी के साथ कम से कम 2 मिन के लिए।
    6. हवा सूखी स्लाइड झुका, सुखाने की सुविधा के लिए ।
    7. DAPI के साथ या उसके बिना एंटी-फीका माउंटेंट के 20 μL रखें (सामग्री की तालिकादेखें) ग्लास कवरस्लिप (24 मिमी x 60 मिमी) पर 3 समान रूप से दूरी वाले डॉट्स के रूप में।
    8. स्लाइड्स में ग्लास कवरस्लिप पर नीचे चेहरा रखें फिर स्लाइड के पाले से ओढ़े हुए छोर को ओवरलैप करने वाले किनारे पर नेल पॉलिश के साथ कवरस्लिप को सील करें ।
    9. तैयार स्लाइड्स को इमेजिंग के लिए तैयार होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।

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Representative Results

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हमने जेब्राफिश स्पर्मेटोसाइट स्प्रेड तैयारी को तैयार करने और कल्पना करने की एक विधि रेखांकित की है। जब सही ढंग से प्रदर्शन किया जाता है, तो हमारी प्रक्रिया अच्छी तरह से फैलती है, गैर-ओवरलैपिंग नाभिक। इस तरह के नाभिक को ठीक करने के लिए, शुरुआती सामग्री (यानी, टेस्ट), ट्राइप्सिन में पर्याप्त समय के लिए टेस्ट का इलाज करना और पर्याप्त संख्या में DNase I उपचार करना महत्वपूर्ण है। इन स्प्रेड को प्रोफेज I के दौरान मेयोटिक प्रगति का अध्ययन करने के लिए टेलोमेरेस और मेओटिक प्रोटीन के लिए दाग दिया जा सकता है चित्र 1 प्रोफेज I के विभिन्न चरणों में गुणसूत्र सुविधाओं के लिए दाग ित स्प्रेड तैयारी के उदाहरणों को दर्शाया गया है चित्रा 4 खराब फैलना नाभिक का एक उदाहरण दिखाता है।

Figure 1
चित्रा 1: गुणसूत्र प्रसार तैयारी के प्रतिनिधि सुपर संकल्प छवियों PNA और एंटीबॉडी जांच के साथ दाग । (A)सिनैपटोनमल परिसर की योजनाबद्ध। (ख)गुणसूत्र धुरी प्रोटीन Sycp3 (हरा), ट्रांसवर्स फिलामेंट प्रोटीन Sycp1 (लाल), और डीएनए (ब्लू) संरचनात्मक रोशनी माइक्रोस्कोपी (सिम) द्वारा एक 100x उद्देश्य का उपयोग कर छवि दिखा होमोलॉग की एक सिनैप्ड जोड़ी । स्केल बार = 1 μm.(C)बाईं ओर पैनलमेओटिक प्रोफेज के तीन चरणदिखाते हैं: लेप्टोटेन (ऊपर), अर्ली-जागोटीन (मध्य) और पचिटेन (नीचे)। स्केल बार = 5 माइक्रोन। सही: प्रत्येक चरण के लिए टेलोमेरेस (मजेंटा) युक्त प्रतिनिधि छवियां। स्केल बार = 1 μm. आंकड़े ब्लोखिना एट अल3से अनुकूलित कर रहे हैं । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 2
चित्रा 2: जेब्राफिश टेस्ट का उदाहरण (~ 7 महीने निषेचन के बाद)। (A)छवि जेब्राफिश के भीतर टेस्टिस के सापेक्ष स्थान को दिखाती है। टेस्टिस तैरने वाले मूत्राशय और आंत के बीच बैठता है। (ख)एक टेस्टिस की लंबाई। युवा जेब्राफिश में छोटे टेस्ट होंगे। गुणसूत्र फैलता है के लिए, टेस्टिस से जितना संभव हो उतना वसा और आसपास के ऊतकों को हटा दें। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 3
चित्रा 3: स्लाइड के लिए आर्द्रता कक्ष । हमारे आर्द्रता कक्ष को इलेक्ट्रोपोराशन क्यूवेट जहाज करने के लिए डिज़ाइन किए गए पॉलीस्टीरिन फोम बॉक्स (21 सेमी x 19 सेमी x 6 सेमी) का उपयोग करके बनाया जाता है। हमने हर दूसरे नाली में गीले पतले ऊतक पोंछे (सामग्री की तालिकादेखें) डाले। स्लाइड्स में गीले पोंछे को छुए बिना लकीरें के ऊपर फ्लैट रखा गया है। एक वाणिज्यिक आर्द्रता कक्ष भी उपलब्ध है (सामग्री की तालिकादेखें)। हम कल्पना करते हैं कि लकीरें और खांचे के साथ लगे किसी भी पॉलीस्टीरिन फोम बॉक्स (उदाहरण के लिए, ग्लास पिपेट13का उपयोग करके) का उपयोग किया जा सकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 4
चित्रा 4: अपर्याप्त DNase I उपचार के कारण खराब गुणवत्ता के उदाहरण फैलता है। 20x उद्देश्य का उपयोग करके सिम द्वारा इमेज्ड सिसीपी3 के लिए मेओटिक गुणसूत्रों को दाग दिया गया। अपर्याप्त DNase मैं उपचार एक चिपचिपा सुक्रोज सेल निलंबन के कारण नाभिक ओवरलैपिंग की ओर जाता है जो कोशिकाओं को स्लाइड पर ठीक से फैलने से रोकता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

Figure 5
चित्रा 5: गुणसूत्र के उदाहरण एक वैकल्पिक विधि11का उपयोग कर फैलता है । सिसीपी3 (हरे) और सिसीपी1 (लाल) के लिए मीओटिक गुणसूत्रों का दाग लगाया गया। गुणसूत्र स्प्रेड को संसार और पेज़ा11द्वारा वर्णित के रूप में तैयार किया गया था । इस विधि को हमारे प्रोटोकॉल के लिए आवश्यक कई ज़ेब्राफिश के बजाय व्यक्तिगत ज़ेब्राफिश का उपयोग करके किया जा सकता है। हमारे हाथों में ऐसे गुणसूत्र ों को देखना आम बात है जो अच्छी तरह से फैलनहीं रहे हैं। वहां भी पृष्ठभूमि धुंधला है कि मलबे है कि गुणसूत्र फैल प्रक्रिया के दौरान स्लाइड पर छोड़ दिया है से परिणाम में एक उल्लेखनीय वृद्धि हुई है । कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।

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Discussion

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यहां हम परमाणु सतह में टेलोमेरेस और गुणसूत्र से जुड़े प्रोटीन के स्थान की जांच करने के तरीकों का वर्णन करते हैं जो जेब्राफिश टेस्ट से अलग शुक्राणुओं से फैलता है । हम उम्मीद करते हैं कि ये विधियां टेस्टिस के आकार में समायोजन के साथ अन्य टेलीसोस्ट प्रजातियों में शुक्राणुओं के विश्लेषण के लिए लागू होंगी।

जबकि केवल कुछ एंटीबॉडी जेब्राफिश मेयोटिक प्रोटीन के लिए उठाया गया है, हम मानव (एच) या माउस (एम) प्रोटीन के लिए उठाए गए निम्नलिखित एंटीबॉडी का उपयोग कर सफलता मिली है । हमारी प्रयोगशाला ने चिकन में जेब्राफिश सिसीपी1 प्रोटीन (zfSycp1) के लिए एंटीबॉडी उठाया है जो सिनैपटोनमल कॉम्प्लेक्स (एससी) के लिए एक विश्वसनीय मार्कर के रूप में कार्य कर चुका है, हालांकि, यह प्रोटीन केवल शुरुआती जागोडीन से देर से पचिटेन तक मौजूद है, जब गुणसूत्र पूरी तरह से सिनैपहैंस किए जाते हैं। खरगोश विरोधी hSYCP3 एंटीबॉडी लेप्टोटेन से मेओटिक गुणसूत्र कुल्हाड़ियों का पता लगाने के लिए बहुत विश्वसनीय रहा है जब तक कि देर से पाचिटेन(चित्रा 1बी, सी)में अनुसूचित जाति के विघटन तक। विशेष रूप से, हमने सिसीपी 3 द्वारा परिभाषित पूर्ण लंबाई की कुल्हाड़ियों और साइसीपी 1 की अनुपस्थिति के साथ एक शास्त्रीय डिप्लोटेन चरण नहीं देखा है, यह सुझाव देते हुए कि, माउस के विपरीत, पाचिटेन3से बाहर निकलने के बाद कुल्हाड़ियों को अपमानित किया जा सकता है। अन्य व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एंटीबॉडी टू एम, एच या जेडएफ मेयोटिक प्रोटीन जिन्होंने सकारात्मक परिणाम दिए हैं, उनमें डीएनए पुनर्संयोजन/प्रतिकृति खरगोश विरोधी hRAD51 और खरगोश विरोधी hRPA भी शामिल हैं । प्रत्येक एंटीबॉडी का स्रोत और उपयोग किए जाने वाले कमजोर पड़ने को सामग्री की तालिकामें सूचीबद्ध किया गया है । जिन लोगों को हमने कम से कम तीन अलग-अलग कमजोरका का उपयोग करके सफलता के बिना कोशिश की है उनमें बकरी विरोधी hDMC1, माउस एंटी-एचएमएचएम1, माउस एंटी-हम्सटर सिसीपी3, माउस एंटी-एचआरपीए शामिल हैं।

गुणसूत्र प्रसार प्रक्रिया के तीन महत्वपूर्ण चरण हैं। पहला सामग्री की सही मात्रा एकत्र कर रहा है। ~ 6 एमपीएफ पुरुषों के लिए स्प्रेडिंग प्रोटोकॉल के लिए पंद्रह बरकरार टेस्ट पर्याप्त होने चाहिए, और जानवरों के आकार के आधार पर इस संख्या को ऊपर या नीचे समायोजित किया जा सकता है। ध्यान रखें कि कुछ मेयोटिक म्यूटेंट में छोटे टेस्ट होंगे, इसलिए 2 अतिरिक्त जानवरों का उपयोग किया जाना चाहिए। दूसरा महत्वपूर्ण कदम कोशिकाओं का विसोजन है। ट्राइप्सिन पाचन के दौरान, यदि टेस्ट छोटे झुरमुटों में अलग नहीं होते हैं, तो यह संभावना है कि फैलने की प्रक्रिया से बहुत कम कोशिकाएं बरामद की जाएंगी। एक तीसरा महत्वपूर्ण कदम DNase I उपचार के बाद एक दृश्य मान की उपस्थिति है। यदि कोई गोली दिखाई नहीं देती है, तो यह संभावना है कि फैलने की प्रक्रिया से कोई नाभिक नहीं निकलेगा। एक गोली का नुकसान पैदा हो सकता है अगर बहुत कम जानवरों का उपयोग किया जाता है या यदि बहुत सारे DNase मैं धोता बाहर किया जाता है । दूसरी ओर, बहुत कम DNase I उपचार एक विस्सिड सुक्रोज सेल निलंबन में परिणाम कर सकते हैं, जो स्लाइड पर फैलने से कोशिकाओं को रोकेगा(चित्रा 4)। यह DNase मैं उपचार (4 उपचार की एक अधिकतम के लिए) प्रदर्शन जारी रखने के लिए महत्वपूर्ण है जब तक झुरमुट अब DMEM के अलावा पर मौजूद हैं ।

प्रस्तुत गुणसूत्र फैलने तकनीक से प्रति स्लाइड सैकड़ों अच्छी तरह से फैलने वाली नाभिक पैदावार होती है। इस प्रक्रिया का उपयोग करते हुए, हम सुपर-रिज़ॉल्यूशन माइक्रोस्कोपी3का उपयोग करके जेब्राफिश शुक्राणुओं के दौरान प्रमुख घटनाओं का विस्तृत विश्लेषण प्रदान करने में सक्षम रहे हैं। हमारे हाथों में, इस प्रोटोकॉल बेहतर फैल गुणसूत्रों उत्पन्न किया है, स्लाइड पर कम मलबे के साथ, और कम पृष्ठभूमि तेजी से एक Moens14 और Sansam और Pezza11 (चित्रा 5)द्वारा वर्णित जानवरों का उपयोग कर तरीकों के साथ तुलना में धुंधला । इन मतभेदों की संभावना हमारे प्रोटोकॉल में कोलेजेनेस, ट्रिपसिन और DNase उपचार के उपयोग के कारण होती है। हमारी तकनीक की दो सीमाएं 10-20 वयस्क ज़ेब्राफिश पुरुषों और अधिक श्रमसाध्य एंजाइम उपचार और धोने के चरणों का उपयोग करने की आवश्यकता है। यदि सुपर-रिज़ॉल्यूशन डिटेक्शन आवश्यक नहीं है, यदि जेब्राफिश सामग्री सीमित है, या दो से अधिक शर्तों का समानांतर परीक्षण किया जाता है, तो तेज तरीके अधिक उपयुक्त विकल्प हो सकते हैं14,15,16।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

हम पांडुलिपि पर टिप्पणी के लिए ट्रेंट न्यूमैन और मासुदा शरीफी और जेब्राफिश meiocytes से गुणसूत्रों को फैलाने और धुंधला करने के तरीकों को अनुकूलित करने में मदद करने के लिए एक गुयेन का शुक्रिया अदा करते हैं । इस काम को NIH R01 GM079115 द्वारा समर्थित किया गया था S.M.B.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL centrifuge tubes Several commercial brands available
1.5 mL microcentrifuge tube rack Several commercial brands available
16% formaldehyde, methanol-free ThermoFisher Scientific 28908
2 mL Several commercial brands available
24 x 50 mm glass coverslips Corning 2980-245
24 x 60 mm glasscoverslips VWR International 16004-312
50 mL conical centrifuge tubes ThermoFisher Scientific 363696
Autoclave bag Several commercial brands available Used to make plastic coverslips.
Bovine Serum Albumin (BSA) Fisher Scientific BP1605-100 Prepare a 100 mg/ml stock solution in sterile distilled water.
Cell Strainer, 100 µm Fisher Scientific 08-771-19
CF405M goat anti-chicken IgY (H+L), highly cross-adsorbed Biotium 203775-500uL Use at 1:1000
Chicken anti-zfSycp1 Generated by Burgess lab N/A Use at 1:100
Collagenase from Clostridium histolyticum Sigma-Aldrich C0130-500MG
Coplin jar Several commercial brands available
DNase I, grade II from bovine pancreas Roche Diagnostics 10104159001
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Fisher Scientific MT10014CV
Dumont No. 5 Forceps Fine Science Tools 11252-30 Two are required for dissecting the testes.
Eppendorf Tubes, 5 mL VWR International 89429-308
Formamide Fisher Scientific BP228-100
Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-11039 Use at 1:1000
Goat anti-chicken IgY (H+L) secondary antibody, Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A-11042 Use at 1:1000
Goat anti-hDMC1 Santa Cruz Biotechnology sc-8973 Does not work in our hands
Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-11008 Use at 1:1000
Goat anti-rabbit IgG (H+L) cross-adsorbed secondary antibody, Alexa Fluor 594 ThermoFisher Scientific A-11012 Use at 1:1000
Goat serum Sigma-Aldrich G9023-10mL
Heparin sodium salt Sigma-Aldrich H3393-100KU
Humidity chamber Fisher Scientific 50-112-3683
Hybridization Oven VWR International 230401V (Model 5420)
Incubator Shaker New Brunswick Scientific Model Classic C25
KCl Fisher Scientific P217-500
Kimwipes Kimerbly-Clark Professional 34155 Used for the humidity chamber
KH2PO4 Fisher Scientific P285-500
Microscope Several commercial brands available Any standard microscope capable of at least ~1.65X magnification is sufficient.
Microscope slides Fisher Scientific 12-544-7
Mouse anti-hamsterSCP3 Abcam ab97672 Does not work in our hands
Mouse anti-hMLH1 BD Biosciences 550838 Does not work in our hands
Mouse anti-hRPA Sigma-Alrich MABE285 Does not work in our hands
Na2HPO4 · 7 H2O Fisher Scientific S373-500
NaCl Fisher Scientific S271-3
Photo-Flo 200 solution Electron Microscopy Sciences 74257
Plastic transfer pipettes Several commercial brands available
PNA TelC-Alexa647 PNA Bio Inc F1013 Prepare as per manufacturer's instructions.
PNA TelC-Cy3 PNA Bio Inc F1002 Prepare as per manufacturer's instructions.
ProLong Diamond Antifade Mountant ThermoFisher Scientific P36970
ProLong Diamond Antifade Mountant with DAPI ThermoFisher Scientific P36971
Rabbit anti-hRPA Bethyl A300-244A Use at 1:300
Rabbit anti-hSCP3 Abcam ab150292 Use at 1:200
Rabbit anti-hRad51 GeneTex GTX100469 Use at 1:300
Sodium citrate Fisher Scientific S279-500
Sucrose Fisher Scientific S5-500
Supercut Scissors, 30° angle, 10 cm Fisher Scientific 50-822-353 Can also use any pair of small scissors.
Sylgard kit Fisher Scientific NC9897184 Prepare as per manufacturer's instructions.
Triton X-100 Fisher Scientific BP151-100 Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature. Triton X-100 forms a precipitate when diluted in water; precipitate dissolves overnight.
Trypsin Worthington Biochemical LS003708
Trypsin inhibitor from chicken egg white Sigma-Aldrich T9253-500MG
Tween 20 Bio-Rad 170-6531 Dilute in sterile distilled water to make a 20% working solution. Store at room temperature.
Vannas Spring Scissors - 4 mm (micro scissors) Fine Science Tools 15018-10

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References

  1. Nagaoka, S. I., Hassold, T. J., Hunt, P. A. Human aneuploidy: mechanisms and new insights into an age-old problem. Nature Reviews Genetics. 13, 493-504 (2012).
  2. Zickler, D., Kleckner, N. Recombination, Pairing, and Synapsis of Homologs during Meiosis. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 7, (2015).
  3. Blokhina, Y. P., Nguyen, A. D., Draper, B. W., Burgess, S. M. The telomere bouquet is a hub where meiotic double-strand breaks, synapsis, and stable homolog juxtaposition are coordinated in the zebrafish, Danio rerio. PLoS Genetics. 15, e1007730 (2019).
  4. Saito, K., Sakai, C., Kawasaki, T., Sakai, N. Telomere distribution pattern and synapsis initiation during spermatogenesis in zebrafish. Developmental Dynamics. 243, 1448-1456 (2014).
  5. Oliver-Bonet, M., Turek, P. J., Sun, F., Ko, E., Martin, R. H. Temporal progression of recombination in human males. Molecular Human Reproduction. 11, 517-522 (2005).
  6. Gruhn, J. R., Rubio, C., Broman, K. W., Hunt, P. A., Hassold, T. Cytological studies of human meiosis: sex-specific differences in recombination originate at, or prior to, establishment of double-strand breaks. PLoS One. 8, e85075 (2013).
  7. Pratto, F., et al. Recombination initiation maps of individual human genomes. Science. 346, 1256442 (2014).
  8. Brown, P. W., et al. Meiotic synapsis proceeds from a limited number of subtelomeric sites in the human male. American Journal of Human Genetics. 77, 556-566 (2005).
  9. Poss, K. D., Nechiporuk, A., Stringer, K. F., Lee, C., Keating, M. T. Germ cell aneuploidy in zebrafish with mutations in the mitotic checkpoint gene mps1. Genes and Development. 18, 1527-1532 (2004).
  10. Saito, K., Siegfried, K. R., Nüsslein-Volhard, C., Sakai, N. Isolation and cytogenetic characterization of zebrafish meiotic prophase I mutants. Developmental Dynamics. 240, 1779-1792 (2011).
  11. Sansam, C. L., Pezza, R. J. Connecting by breaking and repairing: mechanisms of DNA strand exchange in meiotic recombination. Febs Journal. 282, 2444-2457 (2015).
  12. Feitsma, H., Leal, M. C., Moens, P. B., Cuppen, E., Schulz, R. W. Mlh1 Deficiency in Zebrafish Results in Male Sterility and Aneuploid as Well as Triploid Progeny in Females. Genetics. 175, 1561-1569 (2007).
  13. Dia, F., Strange, T., Liang, J., Hamilton, J., Berkowitz, K. M. Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Mouse Spermatocytes. Journal of Visualized Experiments. (129), e55378 (2017).
  14. Moens, P. B. Zebrafish: chiasmata and interference. Genome. 49, 205-208 (2006).
  15. Lisachov, A. P., Zadesenets, K. S., Rubtsov, N. B., Borodin, P. M. Sex chromosome synapsis and recombination in male guppies. Zebrafish. 12, (2), 174-180 (2015).
  16. Ocalewicz, K., Mota-Velasco, J. C., Campos-Ramos, R., Penman, D. J. FISH and DAPI staining of the synaptonemal complex of the Nile tilapia (Oreochromis niloticus) allow orientation of the unpaired region of bivalent 1 observed during early pachytene. Chromosome Research. 17, (6), 773 (2009).
जेब्राफिश स्पर्मेटोसाइट्स से मेओटिक क्रोमोसोम स्प्रेड की तैयारी
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Blokhina, Y. P., Olaya, I., Burgess, S. M. Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes. J. Vis. Exp. (157), e60671, doi:10.3791/60671 (2020).More

Blokhina, Y. P., Olaya, I., Burgess, S. M. Preparation of Meiotic Chromosome Spreads from Zebrafish Spermatocytes. J. Vis. Exp. (157), e60671, doi:10.3791/60671 (2020).

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