Summary
हम स्थिर धातु एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी का उपयोग करतैयार नमूनों के लिए शुरू की धातुओं के आसान मात्राकरण के लिए एक परख पेश करते हैं । विधि कोलोरीमेट्रिक मेटल इंडिकेटर और डिटेक्टर के रूप में यूवी-विस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के रूप में हाइड्रोक्सीनैपथॉल ब्लू का उपयोग करती है।
Abstract
स्थिर धातु एफ़िनिटी क्रोमेटोग्राफी (आईमैक) स्तंभों से लीच धातुओं के साथ एंजाइमों का संदूषण एंजाइमों के लिए एक बड़ी चिंता का विषय बन गया है, क्योंकि आईमैक रेजिन में उपयोग किए जाने वाले कई आम डी-और ट्राइवेलेंट कॉइन एंजाइमों पर अवरोधक प्रभाव डालते हैं। हालांकि, धातु लीचिंग की सीमा और विभिन्न eluting के प्रभाव और अभिकर्मकों को कम करने के लिए सरल और व्यावहारिक संक्रमण धातु क्वांटिफिकेशन प्रोटोकॉल है कि आम तौर पर उपलब्ध उपकरणों का उपयोग की अनुपस्थिति के कारण बड़े हिस्से में खराब समझ रहे है बायोकेमिस्ट्री लैब। इस समस्या के समाधान के लिए, हमने एक शुद्धि कदम के रूप में आईमैक का उपयोग करके तैयार नमूनों में धातु संदूषण की मात्रा को जल्दी से निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल विकसित किया है। विधि 647 एनएम पर एचएनबी स्पेक्ट्रम में परिवर्तन के आधार पर, नैनोमोलर रेंज में धातु की मात्रा की मात्रा निर्धारित करने के साधन के रूप में एक नमूना समाधान में धातु cation सामग्री के लिए एक रंगीन संकेतक के रूप में हाइड्रोक्सीनैपथॉल ब्लू (एचएनबी) का उपयोग करती है। जबकि एक समाधान में धातु सामग्री ऐतिहासिक रूप से परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी या प्रेरक प्लाज्मा तकनीकों का उपयोग करके निर्धारित की गई है, इन तरीकों को एक विशिष्ट जैव रसायन प्रयोगशाला के दायरे के बाहर विशेष उपकरण और प्रशिक्षण की आवश्यकता होती है। यहां प्रस्तावित विधि बायोकेमिस्टों के लिए सटीकता का त्याग किए बिना मौजूदा उपकरणों और ज्ञान का उपयोग करके नमूनों की धातु सामग्री निर्धारित करने के लिए एक सरल और तेज तरीका प्रदान करती है।
Introduction
पोरथ और सहकर्मियों द्वारा अपनी स्थापना के बाद से1,स्थिर धातु आत्मीयता क्रोमेटोग्राफी (आईमैक) जेडएन2 +, नी2 +,सीयू2 +और सीओ 2+जैसे संक्रमण धातु आयनों के साथ संबंध बनाने की उनकी क्षमता के आधार पर प्रोटीन को जल्दी से अलग करने के लिए पसंद की एक विधि बन गई है। यह सबसे अधिक इंजीनियर पॉली-हिस्टीडीन टैग के माध्यम से किया जाता है और अब पुनः संयोजन प्रोटीन2के अलगाव के लिए सबसे आम क्रोमेटोग्राफिक शुद्धिकरण तकनीकों में से एक है। आईमैक ने क्विनोलोन, टेट्रासाइक्लिन, अमीनोग्लिकोसाइड्स, मैक्रोलिड्स और फूड सैंपल एनालिसिस3 के लिए और लिवर और अग्नाशय के कैंसर4,5के लिए रक्त-सीरम प्रोटीन मार्कर की पहचान करने में एक कदम के रूप में रिकॉम्बिनेंट प्रोटीन शुद्धि से परे अनुप्रयोगों को भी पाया है । आश्चर्य नहीं कि आईमैक कई देशी बायोएनर्जेटिकएंजाइम6,7,8,9,10के अलगाव के लिए पसंद की एक विधि भी बन गई है। हालांकि, एंजाइमैटिक रूप से सक्रिय बायोएनर्जेटिक प्रोटीन पर अध्ययन के लिए इन शुद्धिकरण विधियों का सफल कार्यान्वयन स्तंभ मैट्रिक्स से एल्यूएट में लीच किए गए धातु के एनेक्स के नगण्य स्तरों की उपस्थिति पर निर्भर करता है। आमतौर पर आईमैक में उपयोग किए जाने वाले डाइवेलेंट धातु के नेस में पैथोलॉजिकल जैविक महत्व को जाना जाता है, यहां तक कि कम सांद्रता11,12पर भी। इन धातुओं का शारीरिक प्रभाव जैव ऊर्जावान प्रणालियों में सबसे अधिक स्पष्ट है, जहां वे सेलुलर श्वसन या प्रकाश संश्लेषण13,14,15के अवरोधक के रूप में घातक साबित हो सकते हैं। इसी तरह के मुद्दों प्रोटीन वर्गों के बहुमत के लिए अपरिहार्य हैं, जहां अवशिष्ट प्रदूषक धातुओं एक प्रोटीन के जैविक कार्यों या जैव रासायनिक और जैव भौतिक तकनीकों के साथ लक्षण वर्णन के साथ हस्तक्षेप कर सकते हैं ।
जबकि ऑक्सीकरण स्थितियों के तहत धातु संदूषण का स्तर और इमिदाजोल को एक एलुएंट के रूप में उपयोग करना आम तौर पर कम16होता है, प्रोटीन अलगाव साइस्टीन को कम करने वाले एजेंटों (डीटीटी, मर्काप्टोथेनॉल, आदि) या हिस्टिडीन17,18 या एथिलीनडायनेटेस्टेलेस्टिक एसिड (ईडीटीए) जैसे मजबूत चेलेटर के साथ धातु संदूषण19000 00 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 00 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 000 00 इसी तरह, चूंकि आईमैक रेजिन में धातु आयनों को अक्सर कार्बोक्सिलिक समूहों द्वारा समन्वित किया जाता है, इसलिए अम्लीय परिस्थितियों में किए गए प्रोटीन वाष्प ों में धातु संदूषण का स्तर बहुत अधिक होने की संभावना है। समाधानों में धातु की सामग्री का मूल्यांकन परमाणु अवशोषण स्पेक्ट्रोस्कोपी (आस) का उपयोग करके किया जा सकता है और पीपीबी-पीपीटी रेंज21,22,23,24में पता लगाने की सीमा तक प्लाज्मा-मास स्पेक्ट्रोमेट्री (आईसीपी-एमएस) को शामिल किया जा सकता है। दुर्भाग्य से, आस और आईसीपी-एमएस एक पारंपरिक जैव रसायन प्रयोगशाला में पता लगाने के लिए यथार्थवादी साधन नहीं हैं क्योंकि उन तरीकों को विशेष उपकरणों और प्रशिक्षण तक पहुंच की आवश्यकता होगी।
ब्रिटाइन25,26 द्वारा पिछले काम ने समाधान में संक्रमण धातुओं की उपस्थिति की पहचान करने के तरीके के रूप में हाइड्रोक्सीनैपथोल ब्लू (एचएनबी) के उपयोग की जांच की। हालांकि, डेटा20 में कई आंतरिक विरोधाभास थे और वे काम पर्याप्त प्रोटोकॉल पेश करने में विफल रहे । टेमेल एट अल27 और फरेरा एट अल.28 द्वारा अध्ययन एक संभावित धातु संकेतक के रूप में एचएनबी के साथ ब्रिटाइन के काम पर विस्तारित किया गया। हालांकि, टेमेल ने एक प्रोटोकॉल विकसित किया जो नमूना विश्लेषण के लिए एएएस का उपयोग करता है, केवल एक चेलेटिंग एजेंट के रूप में एचएनबी का उपयोग करता है। फरेरा के अध्ययन में ५६३ एनएम, मुक्त रंगे HNB स्पेक्ट्रा का एक क्षेत्र है कि पीएच ५.७ में HNB धातु परिसरों के स्पेक्ट्रा के साथ भारी ओवरलैप के एक क्षेत्र में HNB अवशोषण स्पेक्ट्रा में परिवर्तन का इस्तेमाल किया, assay संवेदनशीलता काफी कम बनाने के रूप में के रूप में अच्छी तरह से अपेक्षाकृत कमजोर बाध्यकारी धातु आत्मीयता20में जिसके परिणामस्वरूप । IMAC से नी 2+ लीचिंग के साथ हमारी अपनी प्रयोगशाला में मुद्दों को संबोधित करने के लिए, हमने ब्रिटाइन25,26 और फेरेरिया28 द्वारा किए गए कार्य का विस्तार किया है ताकि कई संक्रमण धातुओं के नैनोमोलर स्तर का पता लगाने में सक्षम एक आसान परख विकसित की जा सके। हमने दिखाया कि एचएनबी उप-नैनोमोलर बाध्यकारी समानताओं के साथ आईमैक धातुओं के लिए निकल और अन्य आम को बांधता है और पीएच मूल्यों की एक विस्तृत श्रृंखला पर 1:1 जटिल बनाताहै। यहां बताई गई परख इन निष्कर्षों पर आधारित है और धातु क्वाटिफिकेशन के लिए 647 एनएम पर एचएनबी स्पेक्ट्रम में अवशोषण परिवर्तन का उपयोग करता है। परख शारीरिक पीएच रेंज में किया जा सकता है आम बफ़र्स और उपकरण एक ठेठ बायोकेमिस्ट्री लैब में पाया यंत्र का उपयोग करके colorimetric पता लगाने और धातु के मात्रा का उपयोग करके-डाइ परिसरों और मुक्त रंगे के अवशोषण में जुड़े परिवर्तन जब यह धातु से बांधता है ।
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Protocol
1. परख घटक तैयारी
- प्रोटीन समृद्ध अंशों की पहचान करने के लिए प्रोटीन क्वांटिफिकेशन के 280 एनएम या वैकल्पिक तरीकों पर ऑप्टिकल अवशोषण का उपयोग करके क्रोमेटोग्राफी अंशों को परायोजित करने के लिए निर्धारित करें।
नोट: इस काम के लिए, हमने एक डायोड व्यूयू-विस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर का उपयोग किया। थ्रूपुट को बढ़ाने के लिए यूवी-विस अवशोषण को मापने में सक्षम प्लेट रीडर का उपयोग किया जा सकता है। - आवश्यक परख घटकों की तैयारी
- 7 से 12 के बीच पीएच के साथ 10-100 एमएम बफर ("नमूना बफर") तैयार या प्राप्त करें।
नोट: तटस्थ या बुनियादी पीएच पर ट्रिस, हेप्स, एमओपीएस और फॉस्फेट जैसे सामान्य जैव रासायनिक बफ़र्स परख के लिए सभी स्वीकार्य हैं। ट्रिसिन और हिस्टिडीन का उपयोग किया जा सकता है लेकिन अंशांकन घटता की आवश्यकता होगी क्योंकि वे दोनों काफी हद तक धातु आयनों को चेलेट करते हैं। हिस्टीडीन के लिए अंशांकन का एक उदाहरणसंदर्भ 20में दिखाया गया है । - तैयार स्टॉक सॉल्यूशन के प्रत्येक मिलीलीटर के लिए 120 मिलीग्राम एचएनबी रिएजेंट का उपयोग करके नमूना बफर में हाइड्रोक्सीनैपथोल ब्लू (एचएनबी) फैलाव का 12% w/v (20 गुना केंद्रित) समाधान तैयार करें।
सावधानी: आंखों के लिए एचएनबी के एक्सपोजर गंभीर नुकसान और जलन का कारण बन सकता है। एचएनबी को संभालते समय आंखों की सुरक्षा का उपयोग किया जाना चाहिए और हाथों को संभालने के बाद अच्छी तरह से धोया जाना चाहिए।
नोट: एचएनबी को वैज्ञानिक अभिकर्मकों के प्रमुख आपूर्तिकर्ताओं द्वारा केसीएल पर फैलाव के रूप में बेचा जाता है। जैसे, समाधान में वास्तविक एकाग्रता विभिन्न विनिर्माण, बैचों से भिन्न होगी, और बोतल में एचएनबी फैलाव कहां से लिया जाता है। आदर्श रूप से, स्टॉक के 20 गुना कमजोर पड़ने के बाद 647 एनएम पर 0.5-0.8 के बीच एक अवशोषण प्राप्त किया जाना चाहिए।
- 7 से 12 के बीच पीएच के साथ 10-100 एमएम बफर ("नमूना बफर") तैयार या प्राप्त करें।
2. नमूना तैयारी और माप
- डेटा संग्रह के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर की तैयारी
- यूवी-विस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर को चालू करें और गर्म करें। 647 एनएम पर डेटा एकत्र करने के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर सेट करें।
नोट: यदि स्पेक्ट्रोफोटोमीटर अनुमति देता है, तो आधारभूत सुधार के लिए उपयोग किए जाने वाले डाई-मेटल और डाई स्पेक्ट्रा से संबंधित महत्वपूर्ण परिवर्तनों के बिना 850 एनएम, या कुछ अन्य तरंगदैर्ध्य पर डेटा एकत्र करें। - नमूना बफर का उपयोग करस्पेक्टरोफोटोमीटर को खाली करें।
नोट: क्वार्ट्ज या डिस्पोजेबल प्लास्टिक क्यूवेट का उपयोग किया जा सकता है। क्वार्ट्ज क्यूवेट को मात्रात्मक विश्लेषण के लिए पसंद किया जाता है क्योंकि वे डिस्पोजेबल प्लास्टिक क्यूवेट पर उच्च सटीकता और सटीकता की अनुमति देंगे। हालांकि, प्लास्टिक क्यूवेट यूवी लाइट को ब्लॉक करते हैं, जो कुछ डायोड-व्यूर स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के मापने वाले बीम में मौजूद हो सकते हैं। तीव्र यूवी प्रकाश के लिए एचएनबी के एक्सपोजर उल्लेखनीय रंगे गिरावट और एक अवांछित धीमी गति से अवशोषण कमी का कारण बनता है जिसे धीमी धातु बाध्यकारी के साथ भ्रमित किया जा सकता है (उदाहरण के लिए, संदर्भ 20 की सहायक जानकारी में चित्रा 1 देखें)।
- यूवी-विस स्पेक्ट्रोफोटोमीटर को चालू करें और गर्म करें। 647 एनएम पर डेटा एकत्र करने के लिए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर सेट करें।
- नियंत्रण की तैयारी और अवशोषण माप
- कुल परख की मात्रा के प्रति मिलीलीटर एचएनबी स्टॉक के 50 माइक्रोन युक्त एक नियंत्रण समाधान तैयार करें। सभी नमूनों का अच्छा मिश्रण सुनिश्चित करने के लिए, पहले छोटे वॉल्यूम को पिपेट करें फिर नमूना बफर जोड़ें जिसके बाद पाइपटिंग द्वारा मिश्रण किया जाता है। पतला एचएनबी समाधान ताजा तैयार किया जाना चाहिए लेकिन एचएनबी स्टॉक को 4 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है और महत्वपूर्ण गिरावट के बिना हफ्तों तक प्रकाश से परिरक्षित किया जा सकता है।
- नियंत्रण को कमरे के तापमान पर न्यूनतम 3 न्यूनतम 3 न्यूनतम के लिए इनक्यूबेट करने की अनुमति दें।
नोट: क्षारीय पीएच में नमूनों के लिए या खराब घुलनशील धातु परिसरों के गठन के कारण फॉस्फेट की उपस्थिति में एक लंबा ऊष्मायन समय आवश्यक हो सकता है जिसके परिणामस्वरूप धीमी संतुलन होता है। - नियंत्रण नमूने के लिए 647 एनएम पर अवशोषण को मापें और रिकॉर्ड करें।
- नमूनों की तैयारी और अवशोषण माप
- नमूना बफर के साथ उचित रूप से पतला प्रोटीन अंशों के 950 माइक्रोन के साथ एचएनबी स्टॉक के 50 माइक्रोन मिलाकर परख के नमूने तैयार करें।
नोट: चूंकि साहित्य में सूचित धातु संदूषण का स्तर16,20एल्यूशन स्थितियों के आधार पर 1000 से अधिक के कारक से भिन्न होता है, इसलिए परख की गतिशील सीमा के भीतर परिवर्तन ों को अवशोषित करने के लिए नमूना बफर के साथ परायोजित प्रोटीन अंशों के कुछ कमजोर होने की कोशिश करना आवश्यक हो सकता है (ऊपर चरण 1.2.1 देखें) ।
सावधानी: निकेल और अन्य IMAC में इस्तेमाल धातुओं त्वचा अड़चन जाना जाता है, कैंसरजनक होने का संदेह है, और लंबे समय तक जोखिम के बाद गुर्दे और रक्त को नुकसान पहुंचाने में सक्षम हैं । आईमैक के साथ तैयार प्रोटीन नमूनों को संभालते समय दस्ताने और आंखों की सुरक्षा का उपयोग किया जाना चाहिए। - नमूने को कमरे के तापमान पर न्यूनतम 3 न्यूनतम 3 न्यूनतम के लिए इनक्यूबेट करने और 647 एनएम पर अवशोषण को मापने की अनुमति दें।
नोट: निवेश किए गए समय के संदर्भ में परख का सीमित कदम ऊष्मायन कदम है। इस पेपर के लिए डेटा एक क्वार्ट्ज क्यूवेट का उपयोग करके एकत्र किया गया था जिसे प्रत्येक नमूने के बीच सावधानीपूर्वक धोया गया था। यहां तक कि जोड़ा धोने के समय और एचएनबी स्टॉक की तैयारी के साथ, 14 नमूनों और नियंत्रण के लिए डेटा संग्रह लगभग एक घंटे और एक आधा लिया और इस तरह के रूप में, प्रोटोकॉल आसानी से रुकावट की आवश्यकता के बिना पूरा किया जा सकता है । - प्रत्येक अंश के लिए चरण 2.3.1 और 2.3.2 दोहराएं जो मापा जाएगा।
नोट: यदि कई cuvettes कई नमूनों के लिए इस्तेमाल किया जाएगा, नमूने एक तरह से तैयार किया जाना चाहिए कि तुलनीय ऊष्मायन समय और परिवेश प्रकाश के लिए जोखिम के लिए अनुमति देता है ।
- नमूना बफर के साथ उचित रूप से पतला प्रोटीन अंशों के 950 माइक्रोन के साथ एचएनबी स्टॉक के 50 माइक्रोन मिलाकर परख के नमूने तैयार करें।
3. धातु की मात्रा
- प्रत्येक नमूने में धातु की एकाग्रता का निर्धारण
- एचएनबी नियंत्रण से 647 एनएम पर प्रत्येक नमूना अवशोषण का अंतर खोजें।
- नीचे दिए गए सूत्र का उपयोग करके धातु एकाग्रता (μM में) निर्धारित करें:
जहां DF परख अंश के लिए कमजोर पड़ने का कारक है, Abs647 647 एनएम पर अवशोषण परिवर्तन है, 3.65x10-2 एचएनबी के विलुप्त होने गुणांक का प्रतिनिधित्व करता है (ε = 36.5mM -1·cm-1 अधिक जानकारी के लिए संदर्भ20 देखें) और एल सीएम में क्यूवेट का ऑप्टिकल पथ है।
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Representative Results
तटस्थ पीएच (ब्लैक लाइन) पर मुक्त एचएनबी का स्पेक्ट्रम और न्यूनतम समर्थन मूल्य 1E3D129 के अलगाव से एनआई2 + के लिए परसाद अंशों के प्रतिनिधि स्पेक्ट्रा को चित्रा 2में दिखाया गया है। एक सफल परख श्रृंखला एचएनबी नियंत्रण की तुलना में 647 एनएम पर कम अवशोषित प्रदर्शित करना चाहिए, जो संक्रमण धातु की उपस्थिति में एचएनबी परिसरों के गठन से मेल खाती है। एक असफल परख ६४७ एनएम पर अवशोषण में वृद्धि से संकेत दिया जाएगा । वैकल्पिक रूप से, 647 एनएम पर प्रारंभिक अवशोषण से 90% से अधिक की कमी बहुत अधिक धातु सामग्री और अधिक पतला अंशों को परख ने की आवश्यकता का संकेत देगी। मुक्त एचएनबी नियंत्रण से कोई अवशोषित परिवर्तन के साथ एक परख जरूरी विफलता का संकेत नहीं है । यह संभव है कि नमूनों में अनिवार्य रूप से कोई लीच धातुएं नहीं होती हैं। हालांकि, यह संभावना नहीं है और कोई अवशोषक परिवर्तन दिखा किसी भी नमूना तैयार किया जाना चाहिए और फिर से मापा जाना चाहिए, अधिमानतः कम कमजोर पड़ने के साथ, परिणाम की पुष्टि करने के लिए । कुल मिलाकर, अपेक्षित अवशोषण परिवर्तन का निरीक्षण करने में अधिकांश विफलताओं को नमूना तैयारी के दौरान अनुचित पाइपिंग के लिए जिम्मेदार ठहराया जा सकता है, माप से पहले एक अपर्याप्त ऊष्मायन समय, या अनुशंसित 7-12 रेंज के बाहर पीएच मान।
इस परख के आवेदन को प्रदर्शित करने के लिए, हमने 2 उसके टैग झिल्ली पाड़ प्रोटीन MSP1E3D1 का विश्लेषण किया (डेनिसोव में अलग, I. G. एट अल.29),MSP2N2 (ग्रिंकोवा, वाई वी30)में अलग-थलग, और जियोबैक्टर सल्फरकमसे से एक उपन्यास 3-हेम सी-टाइप साइटोक्रोम GSU0105, जिसे ई कोलाई में फिर से व्यक्त किया गया था और 500 मीटर इमिडाजोल के साथ eluted किया गया था। नी-एनटीए रेसिन कॉलम (सामग्री की तालिकादेखें) से नी2 + की एलुशन प्रोफाइल और इन 3 प्रोटीन के लिए संबद्ध प्रोटीन एल्यूशन प्रोफाइल को चित्रा 3में दिखाया गया है। किसी भी प्रोटीन में एक अद्वितीय निकल एल्यूशन होगा जो प्रोटीन एल्यूशन प्रोफाइल के साथ संरेखित हो सकता है या नहीं कर सकता है जैसा कि 280 एनएम पर मापा जाता है। उदाहरण के लिए, चित्रा 3सी से पता चलता है कि GSU0105 के लिए प्रत्येक अंश की प्रोटीन और नी 2+ सामग्री काफी एक दूसरे से स्थानांतरित कर रहे हैं, जबकि MSP1E3D1 और MSP2N2(चित्रा 3ए, बी)के लिए अंश जिनमें सबसे अधिक प्रोटीन होता है, उनमें सबसे अधिक नी2 + सामग्री भी होती है। चित्रा 3ए, बी यह भी वर्णन करता है कि धातु सामग्री आईमैक का उपयोग करके एकत्र किए गए अंशों के बीच समान रूप से वितरित नहीं की जा सकती है। कॉलम पैकिंग, एल्यूशन बफर, पंपिंग उपकरण और शर्तों की संरचना के आधार पर, उन अंशों की प्रोटीन सामग्री से स्वतंत्र बहुत अलग सांद्रता पर लगातार अंशों में धातु elute होना संभव है।
चित्रा 1: हाइड्रोक्सीनैपथॉल ब्लू (एचएनबी) की संरचना। परख की कार्यात्मक पीएच रेंज में, सभी सल्फोनेट समूहों और हाइड्रोक्साइल समूहों में से एक आयनीकृत हैं। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 2: चयनित MSP1E3D1 अंशों और HNB के लिए अवशोषण स्पेक्ट्रा। एचएनबी नियंत्रण (काली मोटी रेखा) की तुलना में एमएसपी1ई3डी1 (रंग) के तीन अंशों का सापेक्ष अवशोषण दिखाया गया है। 20 एमएम ट्रिस, पीएच 7.5 में नमूने तैयार किए गए। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
चित्रा 3: 3 प्रतिनिधि उसके टैग प्रोटीन के लिए नी2 + क्वांटिफिकेशन । प्रोटीनऔर नी2 + ए ) एमएसपी1E3D1,(B)MSP2N2, और(C)GSU0105 के लिए elution प्रोफाइल । प्रोटीन एलुशन क्रमशः 300 mM, 300 mM, और 500 mM इमिडाजोल का उपयोग कर के किया गया था। नी2 + क्वांटिफिकेशन 20 एमएम ट्रिस, पीएच 7.5 में किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें ।
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Discussion
एचएनबी का उपयोग करके धातुओं का रंगीन पता लगाने से आईमैक रेसिन से संक्रमण धातु आयनों द्वारा प्रोटीन संदूषण की मात्रा निर्धारित करने का एक सरल तरीका प्रदान करता है। जैसा कि हमने रेफरी 20 में स्थापित किया, नी2 + एचएनबी को 1:1 स्टोइचियोमेट्री के साथ बांधता है और पीएच के साथ एनआई-एचएनबी जटिल परिवर्तनों के लिए लगातार विच्छेदन करता है। हालांकि, जटिल कश्मीरडी सभी अनुशंसित (7-12) पीएच मूल्यों के लिए उप-एनएम रेंज में है। व्यावहारिक दृष्टि से, इसका मतलब है कि किसी भी परीक्षण अंशों में सभी एनआई2 + एचएनबी को तब तक बांधे रखेंगे जब तक कि ईडीटीए जैसे कोई अन्य मजबूत चेलेटिंग एजेंट मौजूद नहीं हैं। इन सभी गुणों के साथ रैखिक नी2 + टिट्रेशन घटता है, जो हम प्रयोगात्मक रूप से मनाया में परिणाम है । उस रिपोर्ट20में, हमने यह भी स्थापित किया कि धातु-रंग परिसर गठन के कारण स्पेक्ट्रल परिवर्तन पूरे 7-12 पीएच रेंज में समान होंगे । पता लगाने के लिए न्यूनतम विश्वसनीय अवशोषण परिवर्तन माप (10-4 - 10-3 ओडी का उपयोग किए गए स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के आधार पर) द्वारा सीमित किया जाता है। ऊपरी रेंज वर्तमान एचएनबी की मात्रा से सीमित है। हमारे काम में, हम ~ 15 माइक्रोन का उपयोग करते हैं, जो 647 एनएम पर ~ 0.6 ओडी के अनुरूप है। हालांकि, यदि आवश्यक हो तो इसे 50-80 माइक्रोन एचएनबी तक बढ़ाया जा सकता है। व्यावहारिक रूप से, हमने ऊपरी सीमा से तुलनीय या उससे अधिक क्रोमेटोग्राफिक अंशों में नी2 + संदूषण का स्तर देखा, जिससे हमें परखों के अंशों के 10 से 50 गुना कमजोर बनाने के लिए मजबूर होना पड़ता है। हालांकि, यह अतिरिक्त कमजोर पड़ने वाला कदम एक अंश में निकल एकाग्रता का निर्धारण करते समय सापेक्ष त्रुटियों को बढ़ा सकता है।
हालांकि हम विवरण की जांच नहीं की है, यह दिखाई दिया है कि अंय IMAC resins (कं, Zn, Fe) में इस्तेमाल धातुओं के बाध्यकारी भी उप μM विच्छेदन स्थिरांक और लगभग ६४७ एनएम पर डाइ और डाइ धातु अवशोषण स्पेक्ट्रा के बीच कोई ओवरलैप है, मुक्त की पीक तरंगदैर्ध्य एचएनबी। इसलिए, पूरी धातु के लिए बाध्यकारी और रंग के संबंधित स्पेक्ट्रल परिवर्तन पूरे अनुशंसित पीएच रेंज में पूर्ण धातु निर्धारण के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
प्रोटोकॉल का निष्पादन सीधा है और उचित प्रयोगशाला तकनीक पर सबसे अधिक निर्भर करता है। आधुनिक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर में अत्यधिक रैखिक प्रतिक्रियाएं और परिमाण के 3-4 आदेशों की गतिशील श्रेणियां होती हैं। नतीजतन, विधि में त्रुटि की शुरुआत के लिए सबसे अधिक संभावना जगह नमूना तैयार करने के लिए पाइपिंग चरणों के माध्यम से है। जैसा कि इस पाठ में वर्णित है, विधि एक मुक्त एचएनबी नियंत्रण और एचएनबी के साथ एक धातु के साथ जटिल नमूनों से 647 एनएम पर एचएनबी अवशोषण चोटी में अंतर के आधार पर धातु सामग्री की मात्रा पर आधारित है। यदि एचएनबी एलिकोट्स या बफर वॉल्यूम को सही ढंग से पिपेट करने के लिए देखभाल नहीं की जाती है, तो 647 एनएम पर नियंत्रण और नमूना अवशोषण की तुलना त्रुटि का बिंदु बन जाती है। इसी तरह, नमूना तैयारकरने के लिए प्रोटीन अंशों की खराब पाइपिंग एक अंश में धातु की कथित एकाग्रता को तिरछा कर सकती है। यह सिफारिश की जाती है कि परख की संवेदनशीलता के कारण, विश्लेषण के लिए उपयोग किए जा रहे किसी भी पिपेट का उपयोग किया जा रहा है जहां उपयोग करने से पहले सटीक मात्रा की आवश्यकता होती है।
विधि की प्राथमिक सीमाएं परख की कार्यात्मक पीएच रेंज और मजबूत चेटिंग एजेंटों की उपस्थिति के साथ आती हैं। परख का उपयोग 7-12 से पीएच रेंज में किया जाता है। पीएच 7 के नीचे, मुक्त एचएनबी रंग का स्पेक्ट्रम बदलता है,जो 20क्वांटिफिकेशन के लिए उपयोग किए जाने वाले 647 एनएम पर चोटी खोता है। पीएच 12 से ऊपर, कई धातु हाइड्रोक्साइड्स आमतौर पर आईमैक रेजिन में पाए जाने वाले धातुओं सहित उपजी शुरू करते हैं, जिससे क्वांटिफिकेशन धीमी और कम प्रजनन योग्य हो जाता है। जबकि क्षारीय अधिकतम शुद्धिकरण प्रक्रियाओं के रूप में एक महत्वपूर्ण समस्या पैदा नहीं करता है शायद ही कभी इस तरह के एक उच्च पीएच के लिए कहते हैं, अम्लीय ंयूनतम अधिक एक सीमित कारक होने की संभावना है । चूंकि नी2 + और अन्य संक्रमण धातुओं के लिए पता लगाने की सीमा लगभग 1000 गुना धातु संदूषण के स्तर से कम है ऊपर प्रदर्शन किया(चित्रा 3),परख के लिए कम पीएच सीमा तटस्थ पीएच मूल्यों और पर्याप्त रूप से उच्च बफरिंग क्षमता के साथ बफ़र्स में सैयद अम्लीय प्रोटीन अंशों के कमजोर पड़ने से दरकिनार किया जा सकता है। वैकल्पिक रूप से, विश्लेषण किए गए अंशों के पीएच को समायोजित किया जा सकता है या एचएनबी स्टॉक समाधान को मिश्रण के बाद वांछित पीएच को बनाए रखने के लिए अधिक दृढ़ता से बफर किया जा सकता है।
यदि प्रोटीन शुद्ध होने के लिए अलगाव प्रक्रिया ज्ञात या संदिग्ध संक्रमण धातु chelating गुणों के साथ अभिकर्मकों के उपयोग की आवश्यकता है, विधि का एक संशोधन नमकीन धातुओं के उचित मात्रा के लिए अनुमति देने के लिए आवश्यक होगा । चेलेटर की उपस्थिति में लीच धातु की एकाग्रता को सही ढंग से निर्धारित करने के लिए प्रोटीन एल्यूशन और धातु मानकों की ज्ञात सांद्रता के लिए उपयोग किए जाने वाले चेलेटिंग एजेंट का उपयोग करके एक मानक वक्र तैयार करने की आवश्यकता होगी। हिस्टिडीन की उपस्थिति में धातु की मात्रा का एक उदाहरण कोखान और मार्जोल्फ20में उपलब्ध है।
जैविक नमूनों में धातुओं का सटीक मात्राकरण अभी भी काफी हद तक विश्लेषणात्मक तकनीकों और इंस्ट्रूमेंटेशन के उपयोग पर निर्भर है, जैसे कि आस और आईसीपी-एमएस, जो ठेठ बायोकेमिस्ट31,32के दायरे से बाहर रहते हैं। बोंटा एट अलने आईसीपी-एमएस द्वारा विश्लेषण के लिए आम फिल्टर पेपर पर जीवविज्ञान के नमूनों की सरल तैयारी का वर्णन किया है, हालांकि, उनकी विधि अभी भी बायोकेमिस्ट31के लिए अमानक इंस्ट्रूमेंटेशन पर निर्भर करती है। विधि हम वर्णन एक नमूने में धातु सामग्री की माप के लिए नए इंस्ट्रूमेंटेशन या दूसरों के लिए आउटसोर्सिंग पर अतिरिक्त प्रशिक्षण के बिना लिया जा करने के लिए अनुमति देता है । जैविक नमूनों33में धातु विश्लेषण के लिए इसी तरह के रंगेमेट्रिक प्रोटोकॉल विकसित किए गए हैं। हालांकि, शैमल एट अल द्वारा वर्णित विधि३३ एक फ्लोरेसेंस परख पर निर्भर करता है एक व्यावसायिक रूप से अनुपलब्ध फ्लोरोसेंट जांच का उपयोग कर कि इस कागज में से पता लगाने की एक उच्च सीमा देता है । जिस सापेक्ष आसानी से वर्णित विधि का प्रदर्शन किया जा सकता है और जलीय नमूनों के लिए पोर्टेबल धातु का पता लगाने प्रोटोकॉल के विकास में हाल ही में रुचि34,35को ध्यान में रखते हुए, इसे आसानी से पानी के नमूनों के क्षेत्र परीक्षण के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। एक पोर्टेबल परीक्षण के रूप में, हमारी विधि को क्वांटिफिकेशन के लिए पोर्टेबल स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ उपयोग के लिए या एक निश्चित परीक्षण स्थान पर आगे विश्लेषण के लिए नमूनों की पहचान करने के लिए गुणात्मक उपाय के रूप में संशोधित किया जा सकता है।
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Disclosures
लेखकों के पास खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।
Acknowledgments
यह सामग्री ग्रांट एमसीबी-1817448 के तहत राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा समर्थित काम पर आधारित है और थॉमस एफ और केट मिलर जेफरीस मेमोरियल ट्रस्ट, बैंक ऑफ अमेरिका, ट्रस्टी और निर्दिष्ट दाता हेज़ल थोर्प कारमैन और जॉर्ज गे कारमैन के एक पुरस्कार से विश्वास.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2xYT broth | Fisher Scientific | BP9743-500 | media for E.coli growth |
| HEPES, free acid | BioBasic | HB0264 | alternative buffer |
| HisPur Ni-NTA resin | Thermo Scientific | 88222 | |
| Hydroxynaphthol blue disoidum salt | Sigma-Aldrich | 219916-5g | |
| Imidazole | Fisher Scientific | O3196-500 | |
| Imidazole | BioBasic | IB0277 | |
| MOPS, free acid | BioBasic | MB0360 | alternative buffer |
| Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
| Sodium phosphate | Fisher Scientific | S369-500 | alternative buffer |
| Tricine | Gold Bio | T870-100 | |
| Tris base | Fisher Scientific | BP152-500 | |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284-500 |
References
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