حاجز الدم البشري في الدماغ يمنع بشكل انتقائي تغلغل الجزيئات المائية ومسببات الأمراض في الدماغ. ترتبط العديد من الأمراض ، بما في ذلك التهاب السحايا والهذيان بعد الجراحة ، بزيادة نفاذية حاجز الدم في الدماغ. هنا، نصف نموذج ثقافة الخلايا البُنفية لاختبار نفاذية الحاجز عن طريق اجتياز الميكروبات.
يتميز حاجز الدم البشري (BBB) بنفاذية منخفضة جدًا للجزيئات الحيوية من أجل حماية وتنظيم عملية التمثيل الغذائي للدماغ. يتم تشكيل BBB أساسا من الخلايا البطانة جزءا لا يتجزأ من الكولاجين الرابع والأغشية السفلية الغنية بالفيفينكتين. تنتج العديد من الأمراض عن خلل في BBB يليه اجتياز الميكروبات ، مما يسبب أمراضًا مثل التهاب السحايا. من أجل اختبار تأثير معلمات متعددة، بما في ذلك الأدوية والتخدير المختلفة، على نفاذية BBB أنشأنا نموذج ثقافة الخلايا البشرية رواية تحاكي BBB مع خلايا البوائية الدقيقة في الدماغ البشري. تزرع الخلايا الفيوثيلية على الكولاجين الرابع ووحدات التصفية المغلفة بالفينكتين حتى التقاء ويمكن بعد ذلك علاجها بمركبات مختلفة ذات أهمية. من أجل إظهار اجتياز الميكروبات ، يتم تلقيح الغرفة العليا مع السطح apical للخلايا الفيوليلية مع البكتيريا. بعد فترة الحضانة ، يتم وضع عينات من الغرفة السفلية على لوحات أجار ويتم حساب المستعمرات التي تم الحصول عليها ، حيث يرتبط عدد المستعمرات بنفاذية BBB. يمكن تحليل العوامل الخلوية الذاتية في هذا الإعداد التجريبي من أجل توضيح الآليات الخلوية الأساسية للخلايا الفيوليلية التي تساهم في BBB. بالإضافة إلى ذلك، يسمح هذا النظام الأساسي بتنفيذ شاشة للمركبات التي قد تؤثر على نفاذية الخلايا البُنائية. وأخيراً، يمكن دراسة اجتياز البكتيريا وربطها بالأمراض المختلفة، مثل التهاب السحايا. قد يكون من الممكن توسيع النموذج وتحليل مسارات البكتيريا من خلال BBB. في هذه المقالة، نقدم بروتوكول مفصل للطريقة الموصوفة للتحقيق في نفاذية BBB.
BBB الإنسان هو حدود فريدة من أنسجة الدماغ، وفصل الدماغ من الدم. وهو ينظم بدقة مرور الجزيئات الأكبر والمائية، ويمنع الانتشار شبه الخلوي، ويحافظ على التوازن الدماغي. كما أنه يحمي الدماغ من تقلبات البلازما والسموم والميكروبات، ويوجه الخلايا الالتهابية كجزء من مناعة الجهاز العصبي المركزي (CNS). منذ اكتشافه قبل قرن من الزمان1، تم إجراء العديد من الدراسات لفهم بنية ووظيفة BBB. التفاعلات المعقدة من الخلايا والبروتينات، والإشارات من الدماغ والدم الطلب لا يزال مزيد من التحقيق والنماذج.
يتكون BBB البشري من ثلاثة أنواع من الخلايا: الخلايا الفيوائية الوعائية الدقيقة في الدماغ (BMECs) ، pericytes ، والخلايا الفلكية2،3. وBMECs تختلف عن غالبية الخلايا البطانة في الجسم في أنها تمتلك عددا كبيرا من تقاطعات ضيقة والتقيد تقاطعات4،النشاط البينوسيتوتيك منخفضة2،5،وغشاء الطابق السفلي المستمر6،7 لمنع انتشار شبه الخلوية. جزيئات الدهون الصغيرة يمكن أن تنتشر وتمر BBB بعد تدرج تركيزها; الجزيئات الكبيرة والمائية تدخل أو تغادر الدماغ فقط من خلال أنظمة النقل الانتقائية المستقطبة المعبر عنها8. ينتج عن هذه اللائحة مقاومة كهربائية نقلية عالية (TEER) من 1,500-2,000 Ο·cm2 التي ترتبط عكسياً بنفاذية9,10. على الرغم من أن BMECs بناء حاجز ضيق، فإنها يمكن أن تتفاعل مع الإشارات المحلية والطرفية11،12. هناك تفاعل وثيق بين BMECs والخلايا الفلكية13؛ الخلايا الفلكية نهاية القدمين بناء طبقة حول السفن والحث على تشكيل تقاطعات ضيقة13،14. وهم يشاركون في نضوج BBB مع عوامل مختلفة، بما في ذلك تحويل عامل النمو-α (TGF-α)15،16. وبالإضافة إلى ذلك، pericytes تلعب دورا رئيسيا في تنظيم تولد الأوعية17 ومنع الخلايا المبرمج في التمايز الخلوي18 (الشكل 1). وهي جزءا لا يتجزأ من غشاء الطابق السفلي وتوفير الاستقرار الهيكلي للسفينة الجدار19.
الشكل 1: البنية التخطيطية لحاجز الدم في الدماغ. يتكون الهيكل الفريد لـ BBB البشري من ثلاثة أنواع مختلفة من الخلايا. ويحيط تجويف السفينة الصغيرة من قبل الخلايا الفيولوميلية، والتي يتم إثراؤها في تقاطعات ضيقة، وليس fenestrated. وهي مضمنة في غشاء الطابق السفلي، مثل pericytes. هذه الخلايا مهمة للاستقرار الهيكلي لجدار السفينة وتلعب دورا في تطوير BBB بجوار الخلايا الفلكية. أقدامهم النهائية بناء طبقة قريبة حول السفينة ودعم بناء تقاطعات ضيقة. جميع مكونات BBB مهمة للوظائف الفسيولوجية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
ترتبط العديد من الأمراض المختلفة بانهيار BBB (على سبيل المثال ، اعتلال الدماغ الانتاني). وقد زاد المرضى المتضررين من مستويات البروتين في السائل النخاعي20، ويظهر parenchyma الدماغ في القوارض المتضررة زيادة في تناول أكسيد الحديد الغرواني ملحوظ والأحماض الأمينية21،22. تشير هذه النتائج إلى زيادة نفاذية BBB التي تحدث إلى جانب زيادة الخلايا البينوسيتوسية في BMECs21 وتنشيط البوثيليال23. علم الأمراض الأخرى المرتبطة المرتبطة BBB غيرت هو التهاب السحايا، وحالة طبية طارئة والتهاب معقد يرافقه وذمة دماغية التي يمكن أن تؤدي إلى موت الخلايا العصبية. من المفترض أن يكون موقع الدخول الرئيسي للبكتيريا المتداولة هو الأوعية الدقيقة24. ومع ذلك ، فإن BBB يمنع دخول البكتيريا. لا ترتبط نفاذية BBB دائمًا بزيادة في التهاب السحايا الهيماتوس التجريبي25 ويمكن أن تكون الآليات متعددة العوامل. صدفة الإنتان مع الهذيان بعد الجراحة (POD)26 والارتباط مع العدوى قبل الجراحة27،28 يشير إلى الحاجة إلى نموذج BBB التي تمكن من التعرض المباشر للبكتيريا للحصول على فهم أفضل في الإمراض البكتيري.
هناك العديد من الثغرات في فهم وقياس اجتياز الميكروبية من خلال BBB. لذلك ، قمنا بتطوير نموذج يسمح بإجراء اختبار مناسب لعوامل وظروف مختلفة مع ارتباط مباشر بين اجتياز البكتيريا والتأثيرات على نفاذية BBB. وركزت الأعمال السابقة على نفاذية الخلايا وشملت قياس TEER وتدفق التتبع. وبالإضافة إلى ذلك، تم تحليل نقل الجزيئات الكبيرة بواسطة جزيئات مُترافقة أو أجسام مضادة، حيث تم تطوير نماذج مختلفة باستخدام الخلايا الفيوثيلية فقط أو تركيبات مع الخلايا الفلكية والبريسيت. بسبب صعوبة الحصول على الأنسجة البشرية على أساس منتظم ، يتم استخدام العديد من النماذج القائمة على الحيوانات. الخلايا البُنائية للدماغ من أصل الأبقار والخنزير تشكل أحادية ضيقة مع TEER عالية التي تشكل على شكل جيد apical-basal القطبية ومناسبة للتحقيقات في نقل الجزيئات الصغيرة من خلال BBB. تختلف البروتينات في تسلسل من المتماثلات البشرية29،30، مما يجعل التحقيق في الأجسام المضادة العلاجية صعبة. لهذا السبب، قد يكون من الأفضل نماذج المورين أو الثقافة البشرية. الفئران أو الفئران كمصادر عينة لديها ميزة الحصول عليها من الأنواع ذات الخصائص المحددة بشكل جيد ولكن هاهي خلايا قليلة لأغراض الدراسة. ويمكن التحايل على هذا من خلال استخدام الظهارة الدماغية الماوس خلدة (END) خطوط الخلية bEND.3، bEND.5 أو cEND31،32،33.
من الصعب الحصول على الخلايا المستزرعة الأولية من الأنسجة البشرية والتعامل معها على أساس منتظم. ولذلك، فإن معظم النماذج الخلوية البشرية المستخدمة في البحوث التحقيق في BBB الإنسان هي خلدخطوط الخلايا الانبوبيليالية. خط الخلية المنشورة هو الإنسان الدماغي الدقيق خط الخلية الانجيويلية hCMEC/D3، وهو مناسب تماما لدراسة تناول المخدرات وسهلة للتعامل معها. الخلايا بناء أحادية وتعبر عن البروتينات تقاطع ضيق مميزة من BBB34, في حين أن مستوى التعبير من كلودين-5 وتفيد التقارير أن تكون أقل مما كانت عليه في microvesselsسليمة 35 وقد تم الكشف عن العديد من ناقلات محددة في مستوى النص36 وكذلك في الدراسات البروتينية34. وTEER منخفضة نسبيا في حدود 30-50 · سم2 لا يزال تحديا37. مصدر آخر للخلايا البذالية الدماغ هي الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs)38 والخلايا الجذعية المشتقة من دم الحبل البشري من السلف البذالي المتداول والأنساب الدموية39،40. كلا بروتوكولي التمايز يؤدي إلى أحادية الخلية الضيقة وقيم TEER العالية (على سبيل المثال، 1,450 ·2 في الثقافات المشتركة)38. تتطلب نماذج الخلايا الجذعية هذه عناية فائقة للزراعة ، ولكنها توفر الفرصة لدراسة تأثير الهرمونات المنظمة41 أو الأمراض ذات الخلفيات الوراثية42 على تطوير BBB.
في هذه الدراسة، أنشأنا خلاثة الدماغ البشري عبر المصابين خط الخلايا الانبوبيلية الدقيقة، THBMEC43،لمحاكاة BBB ودراسة اجتياز البكتيرية. يتم بذر الخلايا على مرشح ونمت إلى التقاء 100٪ في هذا النموذج ثقافة الخلية. يتم تلقيح البكتيريا في الجزء العلوي من غرفة ثقافة الخلية. نحن نستخدم الإشريكية القولونية (E. coli)في دراسة العينة بسبب ارتفاع معدل الإصابة بالتهاب السحايا الإشريكية القولونية44. وقد تبين أن أدنى نفاذية من أحادية الخلية يحدث بين اليوم 13 واليوم 15 بعد البذر45. لذلك ، يتم تنفيذ علاج الطبقة الأحادية THBMEC بعد هذا الوقت ويتم تلقيح البكتيريا بعد ذلك في الوسط على السطح apical من الطبقة الأحادية. بعد وقت الحضانة ، يتم قياس البكتيريا التي كانت قادرة على عبور الحاجز عن طريق الطلاء المتوسط مع البكتيريا على لوحات أجار وحساب المستعمرات. يرتبط عدد متزايد من المستعمرات بارتفاع اجتياز البكتيريا من خلال BBB. وTEER حوالي 70 · سم246. ومع ذلك، ليس من الضروري قياس TEER في الأسلوب الموصوف. على الرغم من أنها قيمة راسخة لنفاذية BBB ، يبدو أنه ليس لها أي تأثير على اجتياز البكتيريا من خلال BBB. الخلايا غير المعالجة بمثابة السيطرة على ضيق في نموذجنا. وقد ثبت في العمل السابق أن الخلايا قادرة على التفاعل مع السيتوكينات proinflammatory والتعبير عن البروتينات تقاطع ضيق نموذجي47. وهذا يسمح للفحص المركب والتحقق من صحة مجموعة أكبر من ركائز الناقل ومستقبلات.
محدودية البصيرة في الإمراض من اجتياز الميكروبات يحد من مزيد من تطوير العلاجات لبود أو التهاب السحايا. وتتطلب الوفيات والمراضة الناجمة عن هذه الأمراض تحسين علاج المرضى، وتتطلب إجراء بحوث بشأن الآليات الأساسية، وتحتاج إلى منصة قوية للفحص المركب. ويمكن دراسة الأحداث المتعددة العوامل مع BMECs الإنسان. وقد أظهرت العديد من إجراءات العزل الناجحة المبلغ عنها من BMECs من عدد من الأنواع فقدان خصائص الخلايا ‘التوقيع الجزيئي52،53. تم نقل THBMECs الموصوفة في هذا الإجراء في مقاطع مبكرة جدًا ، حيث أظهرت خصائص محددة للخلايا البُنتمية في الدماغ وحافظت عليها43. وهذا أمر مهم، لأنه لم يتم اكتشاف جميع الخطوات في المسارات المتضررة حتى الآن، ويبدو أن هذا النموذج يحاكي BMECs التقليدية. نموذجنا المقدم يظهر التأثيرات المباشرة على BMECs واجتياز الميكروبات من خلال BBB.
التعامل مع خلايا THBMEC واضحة، والمعدات التقنية المطلوبة موجودة في معظم مختبرات علوم الحياة. يسمح نموذجنا بالبدء الفوري في إجراءات التحقيق بعد أن تقوم المراكز المتعددة الاتصالات بإنشاء طبقة أحادية ضيقة. يمكن أن يكون مجال التطبيقات واسعًا بسبب التركيبات المحتملة بين الاختبارات الجديدة والتجارب التقليدية مثل قياس TEER أو وضع العلامات باستخدام التتبع54. من الممكن أيضًا إضافة الخلايا الفلكية أو البيريسيتات لجعل نموذج الثقافة المشتركة أو الثلاثية. ويمكن أيضا أن يكون تأثير المخدرات على اجتياز الميكروبات اختبارها في نموذجنا عن طريق علاج THBMECs مع مركبات قبل تلقيح الغرفة العليا مع البكتيريا. في الواقع، فمن الممكن لشراء إدراج مع مرشحات للوحات بئر 96 السماح أتمتة الإجراء. وهذا يمكن أن يسهل تنفيذ نظم فحص الأدوية عالية الإنتاجية لتسريع اكتشاف الأدوية ضد الأمراض المذكورة والحد من الآثار الجانبية على BBB أثناء تطوير الدواء.
خطوة حاسمة في الطريقة المقدمة هي وقت الحضانة بعد إضافة البكتيريا إلى الغرفة العليا. من المهم استخدام ساعات كجداول زمنية في البروتوكول ، لأن وقت إنشاء الإشريكية القولونية هو 20 دقيقةفقط 55. وإلا فإن استخدام نقاط زمنية مختلفة يمكن أن يؤدي إلى نتائج مضللة. هناك أيضًا خطر محتمل للتلوث بين الغرفة العلوية والسفلية أثناء التعرض البكتيري إذا لم يتم التعامل مع اللوحات بعناية. أي تعديلات على لوحة بئر 12 في هذه المرحلة يمكن أن تلوث المتوسطة في الغرفة السفلى.
الإشريكية القولونية هو أحد الأسباب المعروفة والشائعة جدًا لالتهاب السحايا البكتيري. يجب إجراء المزيد من التحقيقات لاختبار البكتيريا المختلفة المرتبطة أيضًا بالتهاب السحايا ، مثل التهاب السحايا Neisseria56 أو المكورات العقدية الالتهابية57. ويبدو أن هذه استخدام آليات مختلفة لعبور BBB وتحتاج إلى أن تكون مفهومة بشكل أفضل لعلاج المرضى. في المرضى المسنين ، يزيد معدل الإصابة بـ POD26 بالإضافة إلى عدد المراضات المصاحبة التي تحدث. ومن المعروف أن هناك تفاعلات بين الأمراض المختلفة، وخاصة تلك الجهازية مثل مرض السكري. في نموذجنا ، من الممكن محاكاة تلك الحالات أو علاج الخلايا قبل إضافة البكتيريا.
ويقتصر هذا النموذج من خلال الاتصال المباشر من THBMECs والبكتيريا، والمزيد من البحوث اللازمة للتحقيق في آليات الاتصال المحتملة للكشف عن المسارات والبروتينات المعنية. ومع ذلك ، فمن الممكن لإزالة إدراج وحصاد الخلايا لمزيد من التحليل. وTEER من النموذج هو أقل بالمقارنة مع نماذج الخلايا الجذعية38،39،40. أكدنا ذلك باستخدام تركيز بكتيري لم يعبر BBB في الخلايا غير المعالجة بعد 6 ساعة.
باختصار ، تمثل هذه الطريقة منصة قوية لتحليل اجتياز البكتيريا من خلال BBB مع إمكانية توسيعها لفحوصات الأدوية عالية الإنتاجية.
The authors have nothing to disclose.
وينوه المؤلفان بالدكتورة مريم حسين لعملها السابق على هذا الأسلوب، ومجموعة الدكتور كيرستن دانكر (شاريتيه – يونيفرسيت، برلين) لتوفيرها مراكز التجارة والتنمية وجوليان ويبر لقراءة المخطوطة بشكل نقدي. تم دعم هذه الدراسة من قبل RTK 2155 (ProMoAge).
Agar – Agar | Carl Roth | 6494.3 | BioScience-Grade |
Autoclave | Systec | VX-150 | |
Bacteria E.coli strain GM2163 | Fermentas Life Sciences, Lithuania | ||
Photometer | Eppendorf | 6131 | |
Cells THBMEC | Group of M. F. Stins | ||
Cell culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 | |
Centrifuge Universal 320 | Hettrichlab | 1401 | |
Collagen IV | SIGMA Aldrich | C6745 | from human cell culture |
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% | Invitrogen | C10311 | |
Culture tubes | Greiner Bio-One | 191180 | |
Cuvettes | BRAND | 759015 | |
Di sodium hydrogen phosphate di hydrate | MERCK | 1065800500 | |
DMEM/F-12 | GIBCO/ Thermo Sc. | 11330032 | HEPES |
Falcon tubes 15 ml | Greiner Bio-One | 188271 | |
Falcon tubes 50 ml | Greiner Bio-One | 227261 | |
Fetal Bovine Serum | GIBCO/ Thermo Sc. | 10270 | value FBS -Brazil |
Fibronectin | SIGMA Aldrich | F0556 | solution human fibroblasts |
Heracell 150 CO2 Incubator | Heraeus | 50116047 | |
Incubator shaker I 26 New Brunswick | Eppendorf | M1324-0000 | |
Inoculation loop | Dr. Ilona Schubert – Laborfachhandel | 641000 | |
LB Broth Base | GIBCO/ Thermo Sc. | 12780029 | |
L-Glutamine | GIBCO/ Thermo Sc. | 25030-081 | |
Microbial incubator B 6200 | Heraeus | 51015192 | |
Microbiological Safety Cabinet AURA 2000 M.A.C. Class II | BIOAIR | 12469 | |
Microscope inverse | Zeiss | TELAVAL 31 | |
Micro tubes 2 ml | Sarstedt | 72,695,400 | |
Micro tubes 1,5 ml | Sarstedt | 72,706,400 | |
Penicillin / Streptomycin | GIBCO/ Thermo Sc. | 15140122 | |
Petri dish | Dr. Ilona Schubert – Laborfachhandel | 464-800 | |
Potassium chloride | Roth | HN02.3 | |
Potassium-di-hydrogen phosphate | Roth | P018.2 | |
Sodium chloride | Roth | 9265.2 | |
ThinCerts + Multiwell Plates | Greiner Bio-One | 665631 | 12 well, pore size 3.0 µm |
Trypsin – EDTA | GIBCO/ Thermo Sc. | 15400054 | |
Vacuumpump Laboport | KNF | N 86 KT.18 |