Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

Analyseren van de permeability van de bloed-hersenbarrière door microbiële traversal door middel van microvasculaire endotheliale cellen

doi: 10.3791/60692 Published: February 14, 2020

Summary

De menselijke bloed-hersenbarrière voorkomt selectief penetratie van hydrofiele moleculen en ziekteverwekkers in de hersenen. Verschillende pathologieën, waaronder meningitis en postoperatief delirium, worden geassocieerd met een verhoogde doorlaatbaarheid van de bloed-hersenbarrière. Hier beschrijven we een endothelial celkweekmodel om de barrièredoorlaatbaarheid te testen door microbiële traversal.

Abstract

De menselijke bloed-hersenbarrière (BBB) wordt gekenmerkt door een zeer lage doorlaatbaarheid voor biomoleculen om het metabolisme van de hersenen te beschermen en te reguleren. De BBB wordt voornamelijk gevormd uit endotheliale cellen ingebed in collageen IV en fibronectine-rijke keldermembranen. Verschillende pathologieën zijn het gevolg van disfunctie van de BBB gevolgd door microbiële traversal, waardoor ziekten zoals meningitis. Om het effect van meerdere parameters, waaronder verschillende geneesmiddelen en verdovingsmiddelen, te testen op de doorlaatbaarheid van de BBB hebben we een nieuw menselijke celkweekmodel vastgesteld dat de BBB nabootst met microvasculaire endothelialcellen van de menselijke hersenen. De endotheelcellen worden geteeld op collageen IV en fibronectine-gecoate filtereenheden tot samenvloeiing en kan vervolgens worden behandeld met verschillende verbindingen van belang. Om een microbiële traversal aan te tonen, wordt de bovenste kamer met het apicale oppervlak van de endotheelcellen ingeënt met bacteriën. Na een incubatietijd worden monsters van de onderste kamer verguld op agarplaten en worden de verkregen kolonies geteld, waarbij het aantal kolonies correleert met de doorlaatbaarheid van de BBB. Endogene cellulaire factoren kunnen worden geanalyseerd in deze experimentele set-up om elementaire cellulaire mechanismen van de endotheelcellen bij te dragen aan de BBB op te helderen. Bovendien maakt dit platform het mogelijk om een scherm uit te voeren voor verbindingen die de doorlaatbaarheid van de endothelialcellen kunnen beïnvloeden. Ten slotte kan bacteriële traversal worden bestudeerd en gekoppeld aan verschillende pathologieën, zoals meningitis. Het is mogelijk om het model uit te breiden en de paden van de bacteriën te analyseren via de BBB. In dit artikel geven we een gedetailleerd protocol van de beschreven methode om de doorlaatbaarheid van de BBB te onderzoeken.

Introduction

De menselijke BBB is een unieke grens van hersenweefsel, het scheiden van de hersenen van het bloed. Het reguleert strikt de passage van grotere en hydrofiele moleculen, blokkeert paracellulaire diffusie, en onderhoudt hersenen homeostase. Het beschermt ook de hersenen tegen plasmaschommelingen, toxines, microben, en begeleidt ontstekingscellen als onderdeel van het centrale zenuwstelsel (CNS) immuniteit. Sinds de ontdekking een eeuw geleden1, zijn veel studies uitgevoerd om de structuur en functie van de BBB te begrijpen. De complexe interacties van cellen, eiwitten en signalen van hersenen en bloed vragen nog verder onderzoek en modellen.

De menselijke BBB bestaat uit drie celtypen: hersenmicrovasculaire endotheliale cellen (BMECs), pericyten en astrocyten2,3. De BMECs verschillen van de meerderheid van de endotheelcellen in het lichaam in die plaats dat ze beschikken over een groot aantal strakke knooppunten en hecht knooppunten4, lage pinocytotische activiteit2,5, en een continue kelder membraan6,7 om paracellulaire diffusie te blokkeren. Kleine lipofiele moleculen kunnen diffuus en passeren de BBB na hun concentratie gradiënt; grotere en hydrofiele moleculen binnenkomen of verlaten de hersenen alleen door gepolariseerde selectieve transportsystemen8. Deze verordening resulteert in een hoge transendotheliale elektrische weerstand (TEER) van 1.500-2.000 Ω·cm2 die omgekeerd gecorreleerd is aan permeability9,10. Hoewel BMECs een strakke barrière bouwen, kunnen ze reageren op lokale en perifere signalen11,12. Er is een nauwe interactie tussen BMECs en astrocyten13; de astrocyte eindvoeten bouwen een laag rond de vaten en veroorzaken de vorming van strakke knooppunten13,14. Zij zijn betrokken bij bbb-rijping met verschillende factoren, waaronder het transformeren van groeifactor-β (TGF-β)15,16. Bovendien spelen pericyten een sleutelrol bij de regulatie van angiogenese17 en voorkomen apoptose van het endotheel in cellulaire differentiatie18 (figuur 1). Ze zijn ingebed in de kelder membraan en zorgen voor structurele stabiliteit van het schip muur19.

Figure 1
Figuur 1: Schematische structuur van de bloed-hersenbarrière. De unieke structuur van de menselijke BBB bestaat uit drie verschillende celtypes. Het microvatlumen wordt omringd door endotheelcellen, die zijn verrijkt met strakke verbindingen, en niet worden gefedereerd. Ze zijn ingebed in de kelder membraan, net als de pericytes. Deze cellen zijn belangrijk voor de structurele stabiliteit van de vaatwand en spelen een rol bij de ontwikkeling van de BBB naast de astrocyten. Hun eindvoeten bouwen een nauwe laag rond het schip en ondersteunen de bouw van strakke kruispunten. Alle componenten van de BBB zijn belangrijk voor fysiologische functionaliteit. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Veel verschillende pathologieën zijn gerelateerd aan de ineenstorting van de BBB (bijvoorbeeld septische encefalopathie). De getroffen patiënten hebben verhoogde eiwitniveaus in het hersenvocht20, en de hersenen parenchyma in de getroffen knaagdieren toont een verhoogde opname van gemarkeerdcolloïdaal ijzeroxide en aminozuren21,22. Deze resultaten wijzen op een verhoogde doorlaatbaarheid van de BBB die optreedt naast een verhoogde pinocytose in BMECs21 en endothelial activatie23. Een andere geassocieerde pathologie gerelateerd aan een veranderde BBB is meningitis, een medische noodsituatie en een complexe ontsteking vergezeld van hersenoedeem dat kan leiden tot neuronale celdood. De primaire ingangsplaats van circulerende bacteriën wordt verondersteld om microvaten24te zijn ; de BBB voorkomt echter de binnenkomst van bacteriën. De doorlaatbaarheid van de BBB is niet altijd gekoppeld aan een toename van experimentele hematogene meningitis25 en de mechanismen kunnen multifactorieiaal zijn. Toeval van sepsis met postoperatieve delirium (POD)26 en de associatie met preoperatieve infecties27,28 geeft de noodzaak aan van een BBB-model dat de directe blootstelling aan bacteriën in staat stelt om een beter begrip te krijgen in bacteriële pathogenese.

Er zijn veel hiaten in het begrijpen en kwantificeren van de microbiële traversal door de BBB. Daarom hebben we een model ontwikkeld dat een handige test van verschillende factoren en omstandigheden mogelijk maakt met een directe correlatie tussen bacteriële traversal en invloeden op de doorlaatbaarheid van de BBB. Eerdere werkzaamheden waren gericht op de paracellulaire doorlaatbaarheid en omvatten TEER-meting en tracerflux. Bovendien werd macromolecuultransport geanalyseerd door geconjugeerde moleculen of antilichamen, waarbij verschillende modellen met alleen endotheliale cellen of combinaties met astrocyten en pericyten werden ontwikkeld. Vanwege de moeilijkheid bij het verkrijgen van menselijk weefsel op een regelmatige basis, veel dier-gebaseerde modellen worden gebruikt. Hersencellen van runderen en varkens oorsprong vormen strakke monolagen met een hoge TEER die goed gevormde apical-basale polariteit vormen en geschikt zijn voor onderzoeken van klein molecuultransport door de BBB. De eiwitten verschillen in volgorde van hun menselijke homologen29,30, waardoor het onderzoek van therapeutische antilichamen moeilijk. Om deze reden kunnen murine- of menselijke kweekmodellen de voorkeur krijgen. Muis of ratten als monsterbronnen hebben het voordeel dat ze worden verkregen uit goed gekarakteriseerde soorten, maar leveren weinig cellen op voor studiedoeleinden. Dit kan worden omzeild door het gebruik van vereeuwigde muis hersenen endothelioom (END) cellijnen bEND.3, bEND.5 of cEND31,32,33.

Primaire gekweekte cellen uit menselijk weefsel zijn moeilijk te verkrijgen en regelmatig te verwerken. Daarom zijn de meeste menselijke cellulaire modellen gebruikt in onderzoek naar de menselijke BBB zijn vereeuwigde endotheel cellijnen. Een gepubliceerde cellijn is menselijke cerebrale microvasculaire endotheelcellijn hCMEC/D3, die zeer geschikt is voor het bestuderen van de opname van geneesmiddelen en gemakkelijk te hanteren is. De cellen bouwen een monolayer en uitdrukken de karakteristieke strakke kruising eiwitten van de BBB34, terwijl het expressieniveau van claudin-5 wordt gemeld lager te zijn dan in intacte microvaten35 en veel specifieke vervoerders zijn gedetecteerd op transcript niveau36 en in proteomic studies34. Een relatief lage TEER in het bereik van 30-50 Ω·cm2 is nog steeds een uitdaging37. Een andere bron voor hersenendotheelcellen zijn menselijke pluripotente stamcellen (hPSCs)38 en menselijke navelstrengbloed afgeleide stamcellen van circulerende endotheel vererver en hematopoietische geslachten39,40. Beide differentiatieprotocollen resulteren in strakke celmonolagen en hoge TEER-waarden (bijvoorbeeld 1.450 Ω·cm2 in coculturen)38. Deze stamcelmodellen vereisen extreme zorg voor de teelt, maar bieden de mogelijkheid om de invloed van het reguleren van hormonen41 of ziekten met genetische achtergronden42 op BBB-ontwikkeling te bestuderen.

In deze studie hebben we een vereeuwigde transfected menselijke hersenen microvasculaire endotheel cellijn, THBMEC43,om de BBB na te bootsen en bacteriële traversal te bestuderen. Cellen worden gezaaid op een filter en gegroeid tot 100% samenvloeiing in deze cel kweek model. Bacteriën worden ingeënt in het bovenste deel van de celkweekkamer. We gebruiken Escherichia coli (E. coli)in onze steekproefstudie vanwege de hoge incidentie van E. coli meningitis44. Er is aangetoond dat de laagste doorlaatbaarheid van celmonolayer optreedt tussen dag 13 en dag 15 na het zaaienvan 45. Daarom wordt de behandeling van de THBMEC-monolayer na deze tijd uitgevoerd en worden bacteriën daarna inhet medium op het apicale oppervlak van de monolaag ingeënt. Na een incubatietijd worden bacteriën die de barrière konden oversteken gekwantificeerd via beplatingsmedium met de bacteriën op agarplaten en het tellen van de kolonies. Een toename van het aantal kolonies correleert met hogere bacteriële traversal door de BBB. De TEER is ongeveer 70 Ω·cm246. Het is echter niet nodig om de TEER te meten volgens de beschreven methode. Hoewel het een gevestigde waarde is voor de doorlaatbaarheid van de BBB, lijkt het geen invloed te hebben op de doorloop van bacteriën door de BBB. Onbehandelde cellen dienen als een controle van de dichtheid in ons model. In eerdere werkzaamheden is aangetoond dat de cellen kunnen reageren op ontstekingsremmende cytokinen en typische strakke verbindingseiwitten47uitdrukken. Dit maakt samengestelde screening en validatie van een grotere set transporter substraten en receptoren mogelijk.

Protocol

1. Voorbereiding van buffer- en reagentia

  1. Bereid 10x fosfaatbuffer zoutlijn (10x PBS) voor door 80 g natriumchloride (NaCl), 2 g kaliumchloride (KCl), 14,4 g dinatrium-waterstof-fosfaatdihydraat (Na2HPO4 · 2 H2O) en 2 g kaliumdiwaterstoffosfaat (KH2PO4)toe te voegen in een glaskolf van 1 L in 1 L van dubbel gedistilleerde H2O. Autoclave de 10x PBS oplossing en verdun 100 mL van deze oplossing in 900 mL dubbel gedestilleerd water om 1x PBS te krijgen.
    1. Gebruik het autoclave om oplossingen te steriliseren. Doe de glazen kolf in de mand, sluit het deksel en steriliseer het gedurende 15 min bij 121 °C en 98,9 kPa.
      OPMERKING: Dit protocol wordt altijd gebruikt voor autoclaving oplossingen in verdere stappen.
  2. Bereid een 10 μg/mL collageen IV en 10 μg/mL fibronectine oplossing door verdunning 0,5 mg/mL fibronectine oplossing en de 0,3 mg/mL collageen IV oplossing elk met 1x PBS tot 100 mg/μL aliquots in 1,5 mL micro buizen. Meng daarna 100 μL van beide aliquots met 1.800 μL 1x PBS in 2 mL microbuizen en bewaar ze bij -20 °C.
  3. Bereid DMEM/F-12 medium voor door 4% foetaal runderserum en 2 mM L-glutamine en 100 mg/L penicilline/streptomycine toe te voegen aan het medium en op te slaan bij 4 °C.
  4. Bereid 1x trypsin-EDTA oplossing voor door 5 mL van de 10x geconcentreerde trypsin-EDTA-oplossing te verdunnen met 45 mL 1x PBS in een 50 mL buis en deze op te slaan bij 4 °C.
  5. Bereid 500 mL LB medium door een gewicht van 10 g LB bouillon basis in een 500 mL glazen kolf. Voeg 500 mL gesteriliseerd water toe en autoclave.
  6. Bereid LB agar door een gewicht van 10 g LB bouillon basis en 7,5 g agar-agar in een 500 mL glazen kolf. Voeg 500 mL gesteriliseerd water toe voordat u autoclaven en sluit het deksel van de kolf niet. Autoclave en laat de oplossing afkoelen tot het warm is om aan te raken.
  7. Bereid antibioticavrij medium voor door 4% foetaal runderserum en 2 mM L-glutamine toe te voegen, maar geen penicilline/streptomycine aan het DMEM/F-12 medium en bewaar het op 4 °C zoals in stap 1.3.

2. Groei van de bloed-hersenbarrière nabootsen cellen

  1. Om de 12 putplaat te monteren, plaatst u de celkweekinserts in de putten (figuur 2A).
    1. Pak de plaat en elke insert in een biologische veiligheidskast en voer daar verdere stappen uit. Gebruik gesteriliseerde tangen om de insert te grijpen op zijn brede basis om het te verplaatsen.
  2. Bedek het poreuze membraan van elke insert met 90 μL van 10 μg/mL collageen IV en 10 μg/mL fibronectinemengsel. Incubeer de 12 putplaat gedurende 24 uur bij 37 °C in een celkweekincubator (figuur 2B).
  3. Was de wisselplaten twee maal door 1 mL 1x PBS in elke wisselplaat te besuialeren en de oplossing aan te zuigen met een vacuümpomp voor celculturen.
  4. Equilibrate de membranen door pipetteren 0,5 mL van voorverwarmde DMEM / F-12 medium in de bovenste en 1,5 mL in de onderste kamer. Bebroed de plaat 30 min bij 37 °C in een celkweekincubator met 5% CO2-atmosfeer (figuur 2C).
  5. Zaad 2 x 105 menselijke microvasculaire endotheelcellen in elke bovenste kamer en de 12 putplaat bij 37 °C uitbroeden in een celkweekincubator (figuur 2D).
    1. Zuig het medium uit de celkweekkolf aan met behulp van een vacuümpomp voor celculturen en was de monolayer door 10 mL 1x PBS te besuifen en de oplossing daarna te besmeifen met een vacuümpomp.
    2. Bedek de cellen volledig met 1x geconcentreerde trypsin-EDTA door 5 mL van de oplossing in de celkweekkolf te besmeien. Incubeer de kolf 3-5 min bij 37 °C in een celkweekincubator.
      OPMERKING: Als de cellen niet zijn gescheiden, tikt u de kolf stevig tegen de palm van de hand om de cellen los te maken.
    3. Neem 5 mL met een pipet als een aliquot van de celvering in een 15 mL buis en voeg 5 mL van de FCS-bevattende medium om de enzymatische reactie te stoppen.
    4. Centrifugeer de suspensie gedurende 3 min bij 210 x g,verwijder de supernatant met een vacuümpomp en breg de pellet opnieuw in 5 mL medium met een pipet.
    5. Gebruik de celteller door 10 μL van de celsuspensie te mengen met 10 μL van 0,4% trypanblauwe vlek in een microbuis van 1,5 mL. Voeg 10 μL van het mengsel toe aan een schuif van de telkamer, zet het in de celteller en begin te tellen.
      1. Richt de teller op de cellen, zodat hun rand is donkerblauw en het midden wit. Start daarna het juiste programma voor celtelling.
    6. Als u het volume voor elke wisselplaat wilt berekenen, verdeelt u de verkregen 2 x 105 cellen per wisselplaat met de berekende concentratie van de celsuspensie.

3. Teelt van het Bloed-hersenbarrièremodel

  1. Incubeer de 12 putplaat gedurende 14 dagen bij 37 °C.
  2. Verander 0,5 mL medium voor de bovenste kamer en 1,5 mL medium voor de onderste om de 2-3 dagen. Verwarm het medium voordat u het in de celfles. Aanzuigen met de vacuümpomp (figuur 2E).
    OPMERKING: Werk zorgvuldig om te voorkomen dat het membraan raakt.
  3. Controleer de status van de cellen door ze te imagingen met een microscoop en de samenvloeiing te bepalen. Zorg ervoor dat de samenloop na 14 dagen 100% is.

4. Bereiding van bacteriën

  1. Een dag voor de meting, zet een kolonie van de E. coli stam GM2163 in LB medium. Incubeer de kweekbuis gedurende 24 uur bij 37 °C met 180 tpm in een incubatieshaker (figuur 2F).
    1. Cultiver de E. coli-stam op een LB agarplaat bij 4 °C. Neem een kolonie met een gesteriliseerde pick en zet de pick in de bereide kweekbuis met 3 mL LB medium.
    2. Bereid een LB agar plaat voor elke insert met warme LB agar oplossing en vul de petrischaaltjes tot de helft van hun totale volume. Laat ze stevig worden en bewaar ze bij 4 °C.

5. Behandeling van cellen

  1. Behandel op dag 14 na het zaaien cellen met verbindingen of meet de transendotheel elektrische weerstand (TEER), indien gepland (figuur 2G).
    LET OP: Altijd een aantal onbehandelde cellen als een controle.
    1. Om cellen met de samenstelling van belang te behandelen, verdunt u de verbinding tot de uiteindelijke concentratie in DMEM/F-12 medium. Voeg 0,5 mL van dit mengsel toe in de bovenste kamer en 1,5 mL in de onderste kamer. Incubeer de plaat in een celkweekincubator voor de gewenste tijd.
  2. Wissel daarna het volledige medium om met antibioticavrij medium door te aspiratingen met de vacuümpomp en pipetteren (figuur 2H).

6. Meting van de doorlaatbaarheid

  1. Om constante concentraties bacteriën te krijgen, meet de optische dichtheid met een fotometer op een golflengte van 600 nm. Verdun de nachtoplossing van bacteriën met LB-medium in een 50 mL-valkenbuis tot een OD600 van 0,5 ± 0,05. Werk op ijs.
    1. Vul 1 mL LB medium in een cuvette. Start de fotometer en zet de cuvette in, gemarkeerd kant naar voren. Druk op de bodem "Blank" voor het meten van de lege waarde achteraf.
    2. Meet de dichtheid van de bacteriële oplossing door het te vullen in een cuvette, zetten het in, en het indrukken van de onderste monster. Herhaal de meting tijdens het verdunnen tot het verkrijgen van de uiteindelijke concentratie.
  2. Werk in een biologische veiligheidskast waar bacteriën kunnen worden behandeld met de voorbereide 12 putplaat en bacteriële oplossing bij OD600 = 0,5. Voeg slechts 450 μL bacteriële oplossing toe aan elke bovenste kamer met 0,5 mL medium (figuur 2I).
  3. Incubeer de 12 putplaat gedurende 6 uur bij 37 °C in een couveuse.
    LET OP: Het protocol dicteert om hier te pauzeren.
  4. Monster 50 μL van het medium met een pipet uit elke onderste kamer door de wisselplaat met tangen te verwijderen (figuur 2J). Zorg ervoor dat het medium niet van de bovenste kamers naar de onderste kamers wordt gemorst.
  5. Plaat elk monster op een aparte agar-plaat(figuur 2K). Laat het monster op de plaat vallen en streep de oplossing eruit met een celverspreider.
  6. Incubeer de agarplaten 24 uur bij 37 °C in een couveuse.
  7. Tel de kolonies in elke plaat (figuur 2L).

7. Gegevens analyseren

  1. Schrijf de gegevens in een tabel en bereken de gemiddelde en standaarddeviatie van de waargenomen kolonies van behandelde en onbehandelde cellen.
  2. Geef het gemiddelde weer als het absolute aantal kolonies.
    1. Om de resultaten te normaliseren, berekent u het relatieve aantal kolonies door alle resultaten te delen met de controlewaarde.

Figure 2
Figuur 2: Gedetailleerde presentatie van de afzonderlijke stappen in het protocol. (A) Zet de inzetstukken met gesteriliseerde tangen in de 12 putplaat. (B) Bestrijk elke insert met 90 μL fibronectine en collageen IV mengsel en incubeer gedurende 24 uur. (C) Equilibrate de membranen met voorverwarmde medium voor 30 min. (D) Zaad 2 x 105 menselijke hersenen microvasculaire endotheelcellen per insert. (E) Cultiveren van de plaat voor de juiste hoeveelheid tijd. (F) Een dag voor het meten, zet een E. coli kolonie in een LB medium kweekbuis en incubeer voor 24 uur. (G) Behandel cellen of meet TEER. (H) Uitwisseling volledig medium met antibiotica-vrij medium. (I) Voeg 450 μL bacteriële oplossing (OD600 = 0,5) toe aan elke bovenste kamer en broed gedurende 6 uur. (J) Monster 50 μL medium uit elke onderste kamer verwijderen insert met tangen. (K) Plaats het monster op agarplaten en uitbroed gedurende 24 uur. (L) Tel de kolonies en analyseer de gegevens. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

   

Representative Results

Volgens het protocol werden de cellen ingezaaid en werd het BBB-model gebouwd. Op dag 14 na het zaaien werden de cellen behandeld met glyoxaal als reactieve aldehyde. Het doel van het experiment was om de correlatie tussen leeftijd en diabetes in POD27 en de hoge incidentie van meningitis bij oudere patiënten48te onderzoeken. De verhoogde niveaus van geavanceerde glycatie eindproducten (AME's) in zowel leeftijd als diabetes49 vragen om verder onderzoek naar het effect van glycatie in de pathogenese van microbiële traversal door de BBB. Glycatie is een niet-enzymatische reactie van vrije aminogroepen in eiwitten met carbonylgroepen van het verminderen van koolhydraten of andere carbonylverbindingen. Glucose staat bekend als donor van carbonylgroepen; er zijn echter meer reactieve bekenden bekend. Na het bouwen van een onstabiele Schiff's basis, herschikken ze naar stabielere en reactieve dicarbonylverbindingen zoals glyoxal. AME's, de eindproducten, kunnen kruisverbindingen veroorzaken tussen eiwitten50. Ze kunnen cellulaire structuren beschadigen en de cellulaire functie veranderen door interactie met de receptor van AME's (RAGE)51.

Cellen werden behandeld met een 0,05 en 0,15 mM glyoxal (GO) oplossing voor 1 uur, en onbehandelde cellen dienden als een controle. Glycatie werd gedetecteerd via immunoblotting en detectie met een anti-AGE-antilichaam (figuur 3). De verkregen bacteriële kolonies werden geteld en vertegenwoordigd als het absolute aantal kolonies (figuur 4A) of het relatieve aantal kolonies genormaliseerd aan de controle (figuur 4B). Het medium uit putten met de onbehandelde cellen vormde zeer weinig kolonies. Dit resultaat toonde aan dat de onbehandelde cellen in staat waren om een barrière te bouwen en als controle kon dienen. Monsters die met glyoxal werden behandeld, vertoonden een toename van het aantal kolonies, wat leidde tot de conclusie dat er een effect van glyoxaal is op de THBMEC's en de cellulaire barrièredichtheid, omdat het aantal kolonies een significant verschil aantoonde tussen onbehandelde en behandelde cellen. De verhoogde bacteriële kruising van de barrière na de behandeling met glyoxal kan verklaren waarom diabetes is gecorreleerd aan ziekten met een BBB-afbraak.

Figure 3
Figuur 3: Detectie van eiwitglycatie via immunoblotting. THBMECs werden behandeld met GO in verschillende concentraties voor 1 uur. Totaal eiwit werd geïsoleerd en gescheiden met behulp van SDS-PAGE. Glycatie van de eiwitten werd gedetecteerd via immunoblotting met behulp van anti-AGE-antilichaam (CML-26). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

In een andere setting werd eiwitglyccation van THBMECs veroorzaakt door glucose. Gesteriliseerde glucose werd toegevoegd aan het DMEM/F-12 medium om de glucoseconcentratie te verhogen van het normale glucosemedium (NG) met 17,5 mM tot hoog glucosemedium (HG) met 42,5 mM. ThbMECs werden gekweekt in twee verschillende celkweekkolven: een in het medium normale glucose (NG) en de andere in hoogglucosemedium (HG). Deze twee verschillende media werden ook gebruikt voor de groei van de BBB op filters in 12 put platen. Cellen gekweekt in NG medium diende als een controle. De verkregen kolonies worden weergegeven als het absolute aantal kolonies (figuur 4C) of het relatieve aantal kolonies genormaliseerd aan de controle (figuur 4D). De resultaten wijzen op geen significant effect op de traversal van bacteriën door de menselijke BBB, wat leidt tot de conclusie dat het effect van NG vs HG niet ernstig genoeg was om de integriteit van de BBB te beïnvloeden. De verschillende scenario's zijn ontworpen om het model en de integriteit van de cellen na te bootsen de BBB te bewijzen.

Figure 4
Figuur 4: Absolute en relatieve aantallen getelde bacteriële kolonies in het BBB-model met THBMECs. ThbMECs werden behandeld met 0,15 mM GO voor 1 uur, onbehandelde cellen dienden als een controle. Aan elke bovenste kamer werd in totaal 450 μL E. coli-suspensie (OD600 = 0,5) toegevoegd. Medium uit de onderste kamers werd verguld op agar platen na 6 uur. (A) De grafiek toont het gemiddelde gemiddelde +/- SEM van getelde kolonies. (B) De grafiek toont de getelde kolonies genormaliseerd naar de onbehandelde cellen als controle +/- SEM (n = 4). In (C) en (D) werden THBMECs geteeld in NG en HG medium. Aan elke bovenste kamer werd in totaal 450 μL E. coli-suspensie (OD600 = 0,5) toegevoegd. Medium uit de onderste kamer werd verguld op agar platen na 6 uur. (C) De grafiek toont het gemiddelde gemiddelde +/- SEM van getelde kolonies. (D) De grafiek toont de getelde kolonies genormaliseerd naar de onbehandelde cellen als controle +/- SEM (n = 3). Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.

Discussion

Beperkt inzicht in de pathogenese van microbiële traversal beperkt verdere ontwikkeling van therapieën voor POD of meningitis. De mortaliteit en morbiditeit van deze ziekten vereisen een betere behandeling van de patiënt, vereisen onderzoek van de onderliggende mechanismen en hebben een robuust platform nodig voor samengestelde screening. De multifactoriële gebeurtenissen kunnen worden bestudeerd met menselijke BMECs. Verschillende succesvolle gerapporteerde isolatieprocedures van BMECs van een aantal soorten hebben aangetoond dat de kenmerken van de cellen moleculaire signatuur52,53verloren zijn gegaan . De beschreven THBMECs in deze procedure werden getransfected in zeer vroege passages, waar zij specifieke hersenen endotheelcelkenmerken tentoonstelden en hen43bewaarden . Dit is belangrijk, omdat niet alle stappen in de getroffen trajecten tot nu toe zijn ontdekt, en dit model lijkt conventionele BMECs na te bootsen. Ons gepresenteerde model toont directe invloeden op BMECs en de microbiële traversal door de BBB.

De behandeling van THBMEC-cellen is eenvoudig en de benodigde technische apparatuur bestaat in de meeste life science-laboratoria. Ons model zorgt voor een onmiddellijke start van onderzoeksprocedures nadat de THBMEC's een strakke monolayer hebben gebouwd. Het gebied van toepassingen kan uitgebreid zijn vanwege de mogelijke combinaties tussen nieuwe tests en conventionele testen zoals TEER-meting of etikettering met tracers54. Het is ook mogelijk om astrocyten of pericytes toe te voegen om een co- of triple-cultuurmodel te maken. De invloed van geneesmiddelen op de microbiële traversal kan ook worden getest in ons model door de THBMECs te behandelen met verbindingen voordat de bovenste kamer met bacteriën wordt ingeënt. In feite is het mogelijk om wisselplaten met filters voor 96 putplaten te kopen, waardoor de automatisering van de procedure mogelijk is. Dit kan de implementatie van systemen voor geneesmiddelen met een hoge doorvoer vergemakkelijken om de ontdekking van geneesmiddelen tegen de genoemde ziekten te versnellen en de bijwerkingen op de BBB tijdens de ontwikkeling van geneesmiddelen te verminderen.

Een kritieke stap in de gepresenteerde methode is de incubatietijd na het toevoegen van de bacteriën aan de bovenste kamer. Het is belangrijk om uren te gebruiken als tijdlijnen in het protocol, omdat de generatietijd van E. coli slechts 20 min55is. Anders kan het gebruik van verschillende tijdpunten leiden tot misleidende resultaten. Er is ook een mogelijk risico op besmetting tussen de bovenste en onderste kamer tijdens de bacteriële blootstelling als de platen niet met zorg worden behandeld. Eventuele wijzigingen aan de 12 putplaat op dit punt kunnen het medium in de onderste kamer vervuilen.

E. coli is een bekende, veel voorkomende oorzaak van bacteriële meningitis. Verder onderzoek moet verschillende bacteriën testen die ook geassocieerd worden met meningitis, zoals Neisseria meningitidis56 of Streptococcus pneumoniae57. Deze lijken verschillende mechanismen te gebruiken om de BBB over te steken en moeten beter worden begrepen voor de behandeling van patiënten. Bij oudere patiënten neemt de incidentie voor POD met26 toe en het aantal voorkomende comorbiditeiten. Het is bekend dat er interacties zijn tussen verschillende ziekten, vooral systemische ziekten zoals diabetes. In ons model is het mogelijk om deze omstandigheden te simuleren of de cellen te behandelen voordat de bacteriën worden toegevoegd.

Het model wordt beperkt door het directe contact van THBMECs en bacteriën, en verder onderzoek is nodig om mogelijke mechanismen van contact te onderzoeken om de betrokken trajecten en eiwitten te detecteren. Het is echter mogelijk om wisselplaten te verwijderen en de cellen te oogsten voor verdere analyse. De TEER van het model is lager in vergelijking met stamcelmodellen38,39,40. We bevestigden dit door gebruik te maken van een bacteriële concentratie die de BBB na 6 uur niet in onbehandelde cellen kruiste.

Samengevat, deze methode vertegenwoordigt een robuust platform om de traversal van bacteriën te analyseren door de BBB met het potentieel om het uit te breiden voor high-throughput drug screenings.

Disclosures

De auteurs hebben niets te onthullen.

Acknowledgments

De auteurs erkennen Dr Maryam Hussain voor eerdere werkzaamheden aan deze methode, de groep van PD Dr Kerstin Danker (Charité-Universitätsmedizin, Berlijn) voor het verstrekken van de THBMECs en Juliane Weber voor het kritisch lezen van het manuscript. Deze studie werd ondersteund door de RTK 2155 (ProMoAge).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar - Agar Carl Roth 6494.3 BioScience-Grade
Autoclave Systec VX-150
Bacteria E.coli strain GM2163 Fermentas Life Sciences, Lithuania
Photometer Eppendorf 6131
Cells THBMEC Group of M. F. Stins
Cell culture flasks Greiner Bio-One 658175
Centrifuge Universal 320 Hettrichlab 1401
Collagen IV SIGMA Aldrich C6745 from human cell culture
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% Invitrogen C10311
Culture tubes Greiner Bio-One 191180
Cuvettes BRAND 759015
Di sodium hydrogen phosphate di hydrate MERCK 1065800500
DMEM/F-12 GIBCO/ Thermo Sc. 11330032 HEPES
Falcon tubes 15 ml Greiner Bio-One 188271
Falcon tubes 50 ml Greiner Bio-One 227261
Fetal Bovine Serum GIBCO/ Thermo Sc. 10270 value FBS -Brazil
Fibronectin SIGMA Aldrich F0556 solution human fibroblasts
Heracell 150 CO2 Incubator Heraeus 50116047
Incubator shaker I 26 New Brunswick Eppendorf M1324-0000
Inoculation loop Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel 641000
LB Broth Base GIBCO/ Thermo Sc. 12780029
L-Glutamine GIBCO/ Thermo Sc. 25030-081
Microbial incubator B 6200 Heraeus 51015192
Microbiological Safety Cabinet AURA 2000 M.A.C. Class II BIOAIR 12469
Microscope inverse Zeiss TELAVAL 31
Micro tubes 2 ml Sarstedt 72,695,400
Micro tubes 1,5 ml Sarstedt 72,706,400
Penicillin / Streptomycin GIBCO/ Thermo Sc. 15140122
Petri dish Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel 464-800
Potassium chloride Roth HN02.3
Potassium-di-hydrogen phosphate Roth P018.2
Sodium chloride Roth 9265.2
ThinCerts + Multiwell Plates Greiner Bio-One 665631 12 well, pore size 3.0 µm
Trypsin - EDTA GIBCO/ Thermo Sc. 15400054
Vacuumpump Laboport KNF N 86 KT.18

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Goldmann, E. E. Vitalfärbung am Zentralnervensystem: Beitrag z. Physio-Pathologie d Plexus chorioideus ud Hirnhäute. (1913).
  2. Reese, T. S., Karnovsky, M. J. Fine structural localization of a blood-brain barrier to exogenous peroxidase. Journal of Cell Biology. 34, (1), 207-217 (1967).
  3. Risau, W., Dingler, A., Albrecht, U., Dehouck, M. P., Cecchelli, R. Blood-brain barrier pericytes are the main source of gamma-glutamyltranspeptidase activity in brain capillaries. Journal of Neurochemistry. 58, (2), 667-672 (1992).
  4. Brightman, M. W., Reese, T. S. Junctions between intimately apposed cell membranes in the vertebrate brain. Journal of Cell Biology. 40, (3), 648-677 (1969).
  5. Coomber, B. L., Stewart, P. A. Morphometric analysis of CNS microvascular endothelium. Microvascular Research. 30, (1), 99-115 (1985).
  6. Tilling, T., Korte, D., Hoheisel, D., Galla, H. J. Basement membrane proteins influence brain capillary endothelial barrier function in vitro. Journal of Neurochemistry. 71, (3), 1151-1157 (1998).
  7. Morris, A. W., et al. Vascular basement membranes as pathways for the passage of fluid into and out of the brain. Acta Neuropathologica. 131, (5), 725-736 (2016).
  8. Betz, A. L., Goldstein, G. W. Polarity of the blood-brain barrier: neutral amino acid transport into isolated brain capillaries. Science. 202, (4364), 225-227 (1978).
  9. Butt, A. M., Jones, H. C., Abbott, N. J. Electrical resistance across the blood-brain barrier in anaesthetized rats: a developmental study. Journal of Physiology. 429, 47-62 (1990).
  10. Calabria, A. R., Weidenfeller, C., Jones, A. R., de Vries, H. E., Shusta, E. V. Puromycin-purified rat brain microvascular endothelial cell cultures exhibit improved barrier properties in response to glucocorticoid induction. Journal of Neurochemistry. 97, (4), 922-933 (2006).
  11. O'Carroll, S. J., et al. Pro-inflammatory TNFalpha and IL-1beta differentially regulate the inflammatory phenotype of brain microvascular endothelial cells. Journal of Neuroinflammation. 12, (131), (2015).
  12. Simi, A., Tsakiri, N., Wang, P., Rothwell, N. J. Interleukin-1 and inflammatory neurodegeneration. Biochemical Society Transactions. 35, (Pt 5), 1122-1126 (2007).
  13. Janzer, R. C., Raff, M. C. Astrocytes induce blood-brain barrier properties in endothelial cells. Nature. 325, (6101), 253-257 (1987).
  14. Tao-Cheng, J. H., Nagy, Z., Brightman, M. W. Tight junctions of brain endothelium in vitro are enhanced by astroglia. Journal of Neuroscience. 7, (10), 3293-3299 (1987).
  15. Utsumi, H., et al. Expression of GFRalpha-1, receptor for GDNF, in rat brain capillary during postnatal development of the BBB. American Journal of Physiology and Cell Physiology. 279, (2), (2000).
  16. Tran, N. D., Correale, J., Schreiber, S. S., Fisher, M. Transforming growth factor-beta mediates astrocyte-specific regulation of brain endothelial anticoagulant factors. Stroke. 30, (8), 1671-1678 (1999).
  17. Balabanov, R., Washington, R., Wagnerova, J., Dore-Duffy, P. CNS microvascular pericytes express macrophage-like function, cell surface integrin alpha M, and macrophage marker ED-2. Microvascular Research. 52, (2), 127-142 (1996).
  18. Ramsauer, M., Krause, D., Dermietzel, R. Angiogenesis of the blood-brain barrier in vitro and the function of cerebral pericytes. Faseb Journal. 16, (10), 1274-1276 (2002).
  19. Lindahl, P., Johansson, B. R., Leveen, P., Betsholtz, C. Pericyte loss and microaneurysm formation in PDGF-B-deficient mice. Science. 277, (5323), 242-245 (1997).
  20. Young, G. B., Bolton, C. F., Archibald, Y. M., Austin, T. W., Wells, G. A. The electroencephalogram in sepsis-associated encephalopathy. Journal of Clinical Neurophysiology. 9, (1), 145-152 (1992).
  21. Carlyle Clawson, C., Francis Hartmann, J., Vernier, R. L. Electron microscopy of the effect of gram-negative endotoxin on the blood-brain barrier. Journal of Comparative Neurology. 127, (2), 183-197 (1966).
  22. Jeppsson, B., et al. Blood-brain barrier derangement in sepsis: cause of septic encephalopathy? The American Journal of Surgery. 141, (1), 136-142 (1981).
  23. Tighe, D., Moss, R., Bennett, D. Cell surface adrenergic receptor stimulation modifies the endothelial response to SIRS. Systemic Inflammatory Response Syndrome. New Horizons (Baltimore, Md). 4, (4), 426-442 (1996).
  24. Kim, K. S., et al. The K1 capsule is the critical determinant in the development of Escherichia coli meningitis in the rat. Journal of Clinical Investigation. 90, (3), 897-905 (1992).
  25. Kim, K. S., Wass, C. A., Cross, A. S. Blood-brain barrier permeability during the development of experimental bacterial meningitis in the rat. Experimental Neurology. 145, (1), 253-257 (1997).
  26. Arshi, A., et al. Predictors and Sequelae of Postoperative Delirium in Geriatric Hip Fracture Patients. Geriatric Orthopaedic Surgery and Rehabililation. 9, 2151459318814823 (2018).
  27. Smulter, N., Lingehall, H. C., Gustafson, Y., Olofsson, B., Engstrom, K. G. Delirium after cardiac surgery: incidence and risk factors. Interactive CardioVascular and Thoracic Surgery. 17, (5), (2013).
  28. Kratz, T., Heinrich, M., Schlauss, E., Diefenbacher, A. Preventing postoperative delirium. Deutsches Arzteblatt International. 112, (17), 289-296 (2015).
  29. Uchida, Y., et al. Quantitative targeted absolute proteomics of human blood-brain barrier transporters and receptors. Journal of Neurochemistry. 117, (2), 333-345 (2011).
  30. Warren, M. S., et al. Comparative gene expression profiles of ABC transporters in brain microvessel endothelial cells and brain in five species including human. Pharmacology Research. 59, (6), 404-413 (2009).
  31. Omidi, Y., et al. Evaluation of the immortalised mouse brain capillary endothelial cell line, b.End3, as an in vitro blood-brain barrier model for drug uptake and transport studies. Brain Research. 990, (1-2), 95-112 (2003).
  32. Steiner, O., Coisne, C., Engelhardt, B., Lyck, R. Comparison of immortalized bEnd5 and primary mouse brain microvascular endothelial cells as in vitro blood-brain barrier models for the study of T cell extravasation. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 31, (1), 315-327 (2011).
  33. Burek, M., Salvador, E., Forster, C. Y. Generation of an immortalized murine brain microvascular endothelial cell line as an in vitro blood brain barrier model. Journal of Visualized Experiments. (66), e4022 (2012).
  34. Ohtsuki, S., et al. Quantitative targeted absolute proteomic analysis of transporters, receptors and junction proteins for validation of human cerebral microvascular endothelial cell line hCMEC/D3 as a human blood-brain barrier model. Molecular Pharmacolgy. 10, (1), 289-296 (2013).
  35. Urich, E., Lazic, S. E., Molnos, J., Wells, I., Freskgard, P. O. Transcriptional profiling of human brain endothelial cells reveals key properties crucial for predictive in vitro blood-brain barrier models. PLoS One. 7, (5), e38149 (2012).
  36. Lopez-Ramirez, M. A., et al. Cytokine-induced changes in the gene expression profile of a human cerebral microvascular endothelial cell-line, hCMEC/D3. Fluid Barrier CNS. 10, (27), (2013).
  37. Cucullo, L., et al. Immortalized human brain endothelial cells and flow-based vascular modeling: a marriage of convenience for rational neurovascular studies. Journal of Cerebral Blood Flow Metabolism. 28, (2), 312-328 (2008).
  38. Lippmann, E. S., et al. Derivation of blood-brain barrier endothelial cells from human pluripotent stem cells. Nature Biotechnology. 30, (8), 783-791 (2012).
  39. Boyer-Di Ponio, J., et al. Instruction of circulating endothelial progenitors in vitro towards specialized blood-brain barrier and arterial phenotypes. PLoS One. 9, (1), e84179 (2014).
  40. Cecchelli, R., et al. A stable and reproducible human blood-brain barrier model derived from hematopoietic stem cells. PLoS One. 9, (6), e99733 (2014).
  41. Lippmann, E. S., Al-Ahmad, A., Azarin, S. M., Palecek, S. P., Shusta, E. V. A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources. Science Reports. 4, 4160 (2014).
  42. Lim, R. G., et al. Huntington's Disease iPSC-Derived Brain Microvascular Endothelial Cells Reveal WNT-Mediated Angiogenic and Blood-Brain Barrier Deficits. Cell Reports. 19, (7), 1365-1377 (2017).
  43. Stins, M. F., Badger, J., Sik Kim, K. Bacterial invasion and transcytosis in transfected human brain microvascular endothelial cells. Microbiological Pathogens. 30, (1), 19-28 (2001).
  44. Gaschignard, J., et al. Neonatal Bacterial Meningitis: 444 Cases in 7 Years. Pediatric Infectious Disease Journal. 30, (3), 212-217 (2011).
  45. Hussain, M. The Effect of Glycation on the Permeability of an in vitro Blood-brain Barrier Model. University Halle-Wittenberg. (2015).
  46. Weber, V. The effect of glycation on the permeability of human blood-brain barrier. University Halle-Wittenberg. (2019).
  47. Hussain, M., et al. Novel insights in the dysfunction of human blood-brain barrier after glycation. Mechanism of Ageing Development. 155, 48-54 (2016).
  48. Choi, C. Bacterial meningitis in aging adults. Clinical Infectious Disease. 33, (8), 1380-1385 (2001).
  49. Furth, A. J. Glycated proteins in diabetes. British Journal of Biomedical Science. 54, (3), 192-200 (1997).
  50. Sajithlal, G. B., Chithra, P., Chandrakasan, G. Advanced glycation end products induce crosslinking of collagen in vitro. Biochimica and Biophysica Acta. 1407, (3), 215-224 (1998).
  51. Ray, R., Juranek, J. K., Rai, V. RAGE axis in neuroinflammation, neurodegeneration and its emerging role in the pathogenesis of amyotrophic lateral sclerosis. Neuroscience and Biobehavior Reviews. 62, 48-55 (2016).
  52. DeBault, L. E., Cancilla, P. A. Gamma-Glutamyl transpeptidase in isolated brain endothelial cells: induction by glial cells in vitro. Science. 207, (4431), 653-655 (1980).
  53. Diglio, C. A., Grammas, P., Giacomelli, F., Wiener, J. Primary culture of rat cerebral microvascular endothelial cells. Isolation, growth, and characterization. Laboratory Investigation. 46, (6), 554-563 (1982).
  54. Buchert, M., Turksen, K., Hollande, F. Methods to examine tight junction physiology in cancer stem cells: TEER, paracellular permeability, and dilution potential measurements. Stem Cell Reviews. 8, (3), 1030-1034 (2012).
  55. Gibson, B., Wilson, D. J., Feil, E., Eyre-Walker, A. The distribution of bacterial doubling times in the wild. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences. 285, (1880), (2018).
  56. Pron, B., et al. Interaction of Neisseria maningitidis with the components of the blood-brain barrier correlates with an increased expression of PilC. Journal of Infectious Diseases. 176, (5), 1285-1292 (1997).
  57. Iovino, F., Orihuela, C. J., Moorlag, H. E., Molema, G., Bijlsma, J. J. Interactions between blood-borne Streptococcus pneumoniae and the blood-brain barrier preceding meningitis. PLoS One. 8, (7), e68408 (2013).
Analyseren van de permeability van de bloed-hersenbarrière door microbiële traversal door middel van microvasculaire endotheliale cellen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Weber, V., Bork, K., Horstkorte, R., Olzscha, H. Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (156), e60692, doi:10.3791/60692 (2020).More

Weber, V., Bork, K., Horstkorte, R., Olzscha, H. Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (156), e60692, doi:10.3791/60692 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter