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Immunology and Infection

미세 혈관 내피 세포를 통해 미생물 통과에 의해 혈액 - 뇌 장벽의 투과성 분석

doi: 10.3791/60692 Published: February 14, 2020

Summary

인간의 혈액-뇌 장벽은 선택적으로 친수성 분자와 병원체가 뇌에 침투하는 것을 방지합니다. 수막염과 수술 후 정신 착란을 포함한 여러 가지 병리는 혈액 - 뇌 장벽의 침투성 증가와 관련이 있습니다. 여기서, 우리는 미생물 통과에 의한 장벽 투과성을 시험하기 위해 내피 세포 배양 모델을 기술한다.

Abstract

인간 혈액-뇌 장벽 (BBB)은 뇌의 신진 대사를 보호하고 조절하기 위해 생체 분자에 대한 매우 낮은 투과성을 특징으로합니다. BBB는 주로 콜라겐 IV및 섬유넥틴이 풍부한 지하 막에 내장된 내피 세포에서 형성됩니다. 몇몇 병리현상은 BBB의 역기능에서 유래하고, 수막염과 같은 질병을 일으키는 원인이 되는 미생물 통과에 선행됩니다. 다른 약물과 마취제를 포함한 여러 파라미터의 효과를 테스트하기 위해 BBB의 투과성에 대한 효과를 테스트하기 위해 BBB를 인간 뇌 미세 혈관 내피 세포로 모방한 새로운 인간 세포 배양 모델을 확립했습니다. 내피 세포는 합류 할 때까지 콜라겐 IV 및 섬유넥틴 코팅 필터 단위에서 성장하고 관심있는 다른 화합물로 치료 할 수 있습니다. 미생물 통과를 입증하기 위해, 내피 세포의 상피 표면을 가진 상부 챔버는 박테리아로 접종된다. 잠복기 후, 하부 챔버의 샘플은 한천 플레이트에 도금되고 얻은 식민지는 계산되며, 이에 따라 식민지 의 수는 BBB의 투과성과 상관 관계가 있습니다. 내인성 세포 인자는 BBB에 기여하는 내피 세포의 기본 세포 메커니즘을 밝히기 위해 이 실험 설정에서 분석될 수 있다. 또한,이 플랫폼은 내피 세포의 투과성에 영향을 미칠 수있는 화합물에 대한 화면을 수행 할 수 있습니다. 마지막으로, 세균성 통과는 뇌막염과 같은 다른 병리학에 연구되고 연결될 수 있습니다. BBB를 통해 모델을 확장하고 박테리아의 경로를 분석하는 것이 가능할 수 있습니다. 이 문서에서는, 우리는 BBB의 투과성을 조사하기 위하여 기술된 방법의 상세한 프로토콜을 제공한다.

Introduction

인간 BBB는 혈액에서 두뇌를 분리하는 두뇌 조직의 유일한 경계입니다. 그것은 엄격하게 더 크고 친수성 분자의 통행을 통제하고, 파라셀로탈 확산을 막고, 두뇌 항상성을 유지합니다. 그것은 또한 플라즈마 변동에서 뇌를 보호, 독 소, 미생물, 중추 신 경계의 일환으로 염증 세포를 안내 (CNS) 면역. 1세기발견 이후, BBB의 구조와 기능을 이해하기 위해 많은 연구가 수행되었습니다. 세포, 단백질, 그리고 두뇌와 혈액 수요에서 신호의 복잡 한 상호 작용 여전히 추가 조사 및 모델.

인간 BBB는 3개의 세포 모형으로 이루어집니다: 두뇌 미세혈관 내피 세포 (BMECs), 상혈세포 및 성상세포2,3. BMECs는 체내 내피 세포의 대다수와 는 달리 그들은 단단한 접합의 높은 숫자를 소유하고 접합부4,낮은 pinocytotic 활동2,5,및 연속 지하 막6,7 파라셀비아확산을 차단합니다. 작은 친유성 분자는 그들의 농도 구배 다음 BBB를 확산하고 통과할 수 있습니다; 더 크고 친수성 분자는 편광된 표현된 선택적 수송 시스템을 통해서만 뇌에 들어가거나 떠난다8. 이 규정은 1,500-2,000Ω·cm2의 높은 경피전기저항(TEER)을 초래하며, 이는 투과성9,10과반비례한다. BMECs는 단단한 장벽을 구축하지만, 그들은 로컬 및 주변 신호11,12에반응 할 수 있습니다. BMECs와 성상 세포(13)사이의 긴밀한 상호 작용이있다; 성상 세포 말단 발은 혈관 주위에 층을 구축하고 단단한접합부 (13,14)의형성을 유도한다. 이들은 성장인자-β(TGF-β)15,16을변형시키는 것을 포함하는 상이한 인자를 가진 BBB 성숙에 관여한다. 또한, 회구는혈관신생(17)의 조절에 중요한 역할을 하며 세포 분화에서 내피의 세포사멸을 예방한다(도18). 이들은 지하 막에 내장되어 있으며 용기벽(19)의구조적 안정성을 제공한다.

Figure 1
그림 1: 혈액-뇌 장벽의 개략적 구조. 인간 BBB의 독특한 구조는 3가지 의 상이한 세포 유형으로 구성된다. 마이크로 혈관 루멘은 단단한 접합부에서 농축되고 경질되지 않는 내피 세포로 둘러싸여 있습니다. 그들은 지하 막에 내장되어 있습니다, pericytes처럼. 이들 세포는 용기 벽의 구조적 안정성에 중요하며 성상 세포 옆에 있는 BBB의 개발에 중요한 역할을 한다. 그들의 끝 발은 선박 주위에 가까운 층을 구축하고 단단한 접합의 건물을 지원합니다. BBB의 모든 구성 요소는 생리 기능에 중요합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

많은 다른 병리학은 BBB의 붕괴와 관련이 있습니다 (예를 들어, 패혈성 뇌증). 영향을 받은 환자는 뇌척수액20에서단백질 수치가 증가하고, 영향을 받는 설치류의 뇌 실증은 표시된 콜로이드 철산화물과 아미노산의 증가된 관능적 인 관능을 나타낸다21,22. 이러한 결과는 BMECs21 및 내피활성화(23)에서증가된 피노사이토시스와 함께 발생하는 BBB의 투과성 증가를 향한 것이다. 변경된 BBB와 관련되었던 또 다른 관련되는 병리는 뇌막염, 신경 세포 죽음으로 이끌어 낼 수 있는 대뇌 부종과 함께 응급 의료 및 복잡한 염증입니다. 순환균의 1차 진입부위는마이크로혈관(24)이어야한다. 그러나, BBB는 박테리아의 진입을 방지합니다. BBB의 투과성은 항상 실험적인 혈생수막염(25)의 증가에 연결되지 않으며 메커니즘은 다인성일 수 있다. 수술 후 정신 착란 (POD)26및 수술 전 감염과의 연관성(27,28)과 패혈증의 우연은 세균에 직접 노출이 세균 병인으로 더 나은 이해를 얻을 수 있도록 하는 BBB 모델의 필요성을 나타낸다.

BBB를 통해 미생물 통과를 이해하고 정량화하는 데는 많은 차이가 있습니다. 따라서, 우리는 BBB의 투과성에 대한 세균 통과와 영향 사이의 직접적인 상관 관계와 다른 요인과 조건의 편리한 테스트를 허용하는 모델을 개발했다. 이전 작업은 파라셀룰러 투과성에 초점을 맞추고 TEER 측정 및 추적자 플럭스를 포함했습니다. 또한, 거대분자 수송은 공액 분자 또는 항체에 의해 분석되었고, 이에 의해 상체 세포 및 상체 세포와의 조합만을 사용하는 상이한 모델이 개발되었다. 정기적으로 인간의 조직을 얻기에 어려움으로 인해, 많은 동물 기반 모델이 사용된다. 소와 돼지 기원의 뇌 내피 세포는 잘 모양의 정점 기저 극성을 형성하고 BBB를 통해 소 분자 수송의 조사에 적합 높은 TEER와 단단한 단층을 형성한다. 단백질은 그들의 인간 상동체29,30에서순서에서 다릅니다, 치료 항체의 조사를 어렵게 만듭니다. 이러한 이유로, 뮤린 또는 인간 배양 모델은 바람직할 수 있다. 샘플 공급원으로서 마우스 또는 랫트는 잘 특성화된 종으로부터 수득되는 장점이 있지만 연구 목적을 위해 몇 개의 세포를 산출한다. 이것은 불멸의 마우스 뇌 내피종 (END) 세포주 bEND.3, bEND.5 또는 cEND31,32,33의사용에 의해 우회 될 수 있다.

인간 조직으로부터의 1차 배양 세포는 정기적으로 수득및 처리하기가 어렵다. 따라서, 인간 BBB를 조사하는 연구에 사용되는 대부분의 인간 세포 모델은 불멸의 내피 세포주이다. 간행된 세포주는 인간 대뇌 미세 혈관 내피 세포주 hCMEC/D3이며, 이는 약물 섭취를 연구하는 데 적합하며 다루기 쉽습니다. 세포는 단층을 구축하고 BBB34의특징적인 단단한 접합 단백질을 발현하는 반면, 클라우딘-5의 발현 수준은 본래마이크로혈관(35)보다 낮은 것으로 보고되고 많은 특정 수송기는 프로테오믹 연구34뿐만 아니라 전사체 수준에서 검출되었다. 30-50 Ω·cm2 의 범위에서 상대적으로 낮은 TEER은 여전히37도전이다. 뇌내피세포의 또 다른 공급원은 인간 다능성 줄기세포(hPSCs)38 및 순환하는 내피 전구 및 조혈 혈통의 인간 코드 혈액 유래줄기세포(39,40)이다. 분화의 두 프로토콜은 단단한 셀 단층 및 높은 TEER 값 (예를 들어, 공동 배양에서 1,450 Ω·cm2)을 초래합니다38. 이 줄기 세포 모형은 재배를 위한 극단적인 배려를 요구합니다, 그러나 BBB 발달에 유전 배경을 가진 호르몬41 또는 질병을 통제의 영향을 공부하는 기회를제안합니다.

이 연구에서, 우리는 BBB를 모방하고 세균 통과를 연구하기 위하여 불멸의 형질감염된 인간 두뇌 미세 혈관 내피 세포주, THBMEC43를설치했습니다. 세포는 필터상에 시드되고 이 세포 배양 모델에서 100% 합류로 성장한다. 박테리아는 세포 배양 챔버의 상부에 접종된다. 대장균(대장균)을시료 연구에서 사용하므로 대장균 수막염 발생률이 44.입니다. 세포 단층의 가장 낮은 투과성은 파종13일과 15일 사이에 발생하는 것으로 나타났다. 따라서, THBMEC 단층의 치료는 이 시간 후에 수행되고 박테리아는 단층의 정점 표면에 매질에서 나중에 접종된다. 배양 시간 후에, 장벽을 교차할 수 있던 박테리아는 한천 접시에 박테리아를 가진 도금 매체를 통해 정량화되고 식민지를 계수합니다. 식민지의 증가 수는 BBB를 통해 더 높은 세균 통과와 상관 관계가 있습니다. TEER은 약 70 Ω·cm246입니다. 그러나, 설명된 방법에서 TEER을 측정할 필요는 없다. 그것은 BBB의 투과성에 대 한 잘 확립 된 값, 그것은 BBB를 통해 박테리아의 통과에 영향을 미칠 것 같다. 처리되지 않은 세포는 우리의 모형에 있는 압박감의 통제로 봉사합니다. 세포가 전염증성 사이토카인에 반응하고 전형적인 타이트 접합 단백질47을발현할 수 있다는 것을 이전 작업에서 나타났다. 이를 통해 더 큰 수송기 기판 및 수용체 세트의 화합물 스크리닝 및 검증이 가능합니다.

Protocol

1. 완충제 및 시약 의 준비

  1. 염화나트륨 80g(NaCl), 염화칼륨 2g(KCl), 14.4g의 디나트륨-수소-인산염 디하이드레이트(Na2 HPO4 · 2H2O)및 2를 첨가하여 10x 인산완충액(10x PBS)을 준비합니다. g의 칼륨-디수소 인산염(KH2 PO4)을1L 의 유리 플라스크에 1L의 이중 증류H2O. 오토클레이브 10x PBS 용액을 및 이중 증류수900 mL에서 100 mL로 희석하여 1x PBS를 얻습니다.
    1. 오토클레이브를 사용하여 용액을 살균합니다. 유리 플라스크를 바구니에 넣고 뚜껑을 닫고 121 °C 및 98.9 kPa에서 15 분 동안 살균하십시오.
      참고: 이 프로토콜은 항상 추가 단계에서 솔루션을 오토클레이브하는 데 사용됩니다.
  2. 0.5 mg/mL 섬유넥틴 용액과 0.3 mg/mL 콜라겐 IV 용액을 1.5 mL 마이크로 튜브에서 100 mg/μL aliquots로 각각 희석하여 10 μg/mL 콜라겐 IV 및 10 μg/mL fibronectin 용액을 준비합니다. 그 후, 2 mL 마이크로 튜브에 1,800 μL의 1,800 μL과 두 개의 양현서를 혼합하고 -20 °C에 저장합니다.
  3. DMEM/F-12 배지를 4% 태아 소 혈청과 2 mM L-글루타민 및 100 mg/L 페니실린/스트렙토마이신을 배지에 첨가하여 4°C에 보관합니다.
  4. 10x 농축 트립신-EDTA 용액의 5 mL을 50 mL 튜브에 45 mL의 1x PBS로 희석하여 1x 트립신-EDTA 용액을 50 mL 튜브에 저장하여 1x 트립신-EDTA 용액을 준비합니다.
  5. 500 mL 유리 플라스크에 LB 국물 베이스 10g의 무게로 LB 배지 500 mL를 준비합니다. 멸균수 500mL를 넣고 오토클레이브합니다.
  6. LB 국물 베이스 10g과 한천 7.5 g을 500 mL 유리 플라스크에 넣고 LB 한천을 준비합니다. 오토클레이브 전에 멸균된 물 500mL를 추가하고 플라스크 뚜껑을 닫지 마십시오. 오토클레이브를 하고 용액이 따뜻해질 때까지 식힙니다.
  7. 4% 태아 소 혈청과 2 mM L-글루타민을 첨가하여 항생제 없는 배지를 준비하지만, DMEM/F-12 배지에 페니실린/스트렙토마이신이 없고 1.3단계에서와 같이 4°C에 보관한다.

2. 세포를 모방 하는 혈액-뇌 장벽의 성장

  1. 12개의 웰 플레이트를 조립하려면, 세포 배양 삽입을 웰에 넣는다(도2A).
    1. 생물학적 안전 캐비닛에 플레이트와 각 인서트를 압축을 풀고 추가 단계를 수행합니다. 멸균 된 집게를 사용하여 넓은 베이스에서 인서트를 잡고 이동하십시오.
  2. 각 삽입물의 다공성 멤브레인을 90 μL의 10 μg/mL 콜라겐 IV와 10 μg/mL 피브로넥틴 혼합물로 코팅합니다. 세포 배양 인큐베이터에서 37°C에서 24시간 동안 12웰 플레이트를 배양하였다(도2B).
  3. 각 인서트에 1mL의 1mL를 파이펫팅하여 인서트를 두 번 세척하고 셀 배양용 진공 펌프로 용액을 흡인합니다.
  4. 상부에 미리 온지어 DMEM/F-12 배지0.5 mL, 하부 챔버에서 1.5 mL를 파이펫팅하여 멤브레인을 평형화합니다. 37°C에서 30분 동안 플레이트를 5%CO2 분위기로 세포 배양 인큐베이터에서 배양하였다(도2C).
  5. 종자 2 x 105 인간 미세 혈관 내피 세포를 각 상부 챔버 내로 넣고 세포 배양 인큐베이터에서 37°C에서 12웰 플레이트를 배양한다(도2D).
    1. 세포 배양용 진공 펌프를 이용하여 세포 배양 플라스크로부터 배지를 흡인하고 1x PBS의 10 mL를 파이펫팅하고 이후에 진공 펌프로 용액을 흡인하여 단층을 세척한다.
    2. 용액의 5 mL을 세포 배양 플라스크내로 피펫팅하여 1x 농축 트립신-EDTA로 세포를 완전히 덮습니다. 플라스크를 세포 배양 인큐베이터에서 37°C에서 3-5분 동안 배양한다.
      참고: 세포가 해리되지 않으면 손바닥에 플라스크를 단단히 눌러 세포를 빼내세요.
    3. 15 mL 튜브에서 세포 현탁액으로부터 의aliquot로 피펫으로 5 mL을 취하고 효소 반응을 중지하기 위해 FCS 함유 배지의 5 mL를 추가합니다.
    4. 210 x g에서3 분 동안 현탁액을 원심 분리하고 진공 펌프로 상급자를 제거하고 파이펫으로 5 mL의 매체에서 펠릿을 다시 일시 중단하십시오.
    5. 셀 카운터를 1.5 mL 마이크로 튜브에 0.4% 트리판 블루 얼룩의 10 μL과 10 μL로 혼합하여 사용한다. 혼합물의 10 μL을 계수 챔버 슬라이드에 넣고 셀 카운터에 넣고 계수를 시작합니다.
      1. 카운터를 셀에 집중하여 가장자리가 진한 파란색이고 중간 흰색이 되도록 합니다. 그 후, 세포 계산에 적합한 프로그램을 시작합니다.
    6. 각 인서트가 차지하는 부피를 계산하려면 인서트가 얻은 2 x 105 셀을 셀 현탁액의 계산된 농도로 나눕니다.

3. 혈액 뇌 장벽 모델 의 재배

  1. 37°C에서 14일 동안 12웰 플레이트를 배양하였다.
  2. 상부 챔버에 대한 배지의 0.5 mL및 2-3 일마다 하부에 대한 배지의 1.5 mL를 변경합니다. 배지를 세포 플라스크에 넣기 전에 따뜻하게 합니다. 진공 펌프와 흡인(그림 2E).
    참고: 멤브레인이 닿지 않도록 주의 깊게 작업하십시오.
  3. 현미경으로 그(것)들을 화상 진찰에 의하여 세포의 상태를 확인하고 conflues를 결정합니다. 14일 후 동급이 100%인지 확인합니다.

4. 박테리아의 준비

  1. 측정 하루 전에, 대장균 균주 GM2163의 콜로니를 LB 배지에 넣었다. 배양튜브를 37°C에서 24시간 동안 배양쉐이커에서 180 rpm으로 인큐베이션쉐이커(도2F)로배양한다.
    1. 4 °C에서 LB 한천 플레이트에 대장균 변형을 경작. 멸균된 픽으로 1개의 콜로니를 취하고 3 mL의 LB 배지로 제조된 배양 튜브에 픽을 넣습니다.
    2. 따뜻한 LB 한천 용액으로 각 인서트에 대해 LB 한천 접시를 준비하고 페트리 접시를 전체 부피의 절반으로 채웁니다. 그들이 단단해지고 4 °C에 보관하십시오.

5. 세포의 치료

  1. 14일째에, 파종 후, 세포를 화합물로 치료하거나 계획된 경우 경피전기저항(TEER)을 측정한다(도2G).
    참고 : 항상 대조군으로 치료되지 않은 세포를 가지고 있습니다.
    1. 관심 있는 화합물로 세포를 치료하려면 화합물을 DMEM/F-12 배지의 최종 농도로 희석합니다. 이 혼합물의 0.5 mL을 상부 챔버에 넣고 1.5 mL를 하부 챔버에 넣습니다. 원하는 시간 동안 세포 배양 인큐베이터에서 플레이트를 배양한다.
  2. 그 후, 진공 펌프 및 파이펫팅(그림2H)을흡입하여 완전 배지를 항생제 없는 배지와 교환한다.

6. 투과성 측정

  1. 박테리아의 일정한 농도를 얻으려면 600 nm의 파장에서 광계로 광학 밀도를 측정하십시오. 50 mL 팔콘 튜브에서 LB 배지로 박테리아의 하룻밤 용액을 0.5±0.05의 OD600으로 희석한다. 얼음에 작업.
    1. LB 배지 1mL를 큐벳에 채웁니다. 포토미터를 시작하고 큐벳을 앞으로 표시된 쪽에 넣습니다. 나중에 빈 값을 측정하기 위해 아래쪽"공백"을누릅니다.
    2. 큐벳에 채우고, 넣고, 바닥 샘플을 눌러 박테리아 용액의 밀도를 측정합니다. 최종 농도를 얻을 때까지 희석 시 측정을 반복한다.
  2. OD600 = 0.5에서 제조 된 12 웰 플레이트 및 세균 용액으로 박테리아를 처리 할 수있는 생물학적 안전 캐비닛에서 작동합니다. 배지0.5 mL을 함유하는 각 상부 챔버에만 450 μL의 세균 용액을첨가한다(도2I).
  3. 인큐베이터에서 37°C에서 6시간 동안 12웰 플레이트를 배양한다.
    참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지하도록 지시합니다.
  4. 각 하부 챔버로부터 파이펫을 사용하여 배지의 50 μL을 집게로 인서트를 제거하였다(도2J). 상부 챔버에서 하부 챔버로 매질을 흘리지 않도록주의하십시오.
  5. 각 샘플을 별도의 한천 판상에플레이트(도 2K). 샘플을 플레이트에 떨어뜨리고 셀 스프레더로 용액을 줄무늬.
  6. 인큐베이터에서 37°C에서 24시간 동안 한천 판을 배양한다.
  7. 각 접시의 식민지를계산합니다(그림 2L).

7. 데이터 분석

  1. 테이블에 데이터를 작성하고 처리 및 치료되지 않은 세포의 관찰 된 콜로니의 평균 및 표준 편차를 계산합니다.
  2. 평균을 절대 콜로니 수로 표시합니다.
    1. 결과를 정규화하려면 모든 결과를 컨트롤 값으로 나누어 상대적인 콜로니 수를 계산합니다.

Figure 2
그림 2: 프로토콜의 개별 단계에 대한 자세한 프레젠테이션입니다. (A)멸균된 집게가 있는 인서트를 12개의 웰 플레이트에 넣습니다. (B)각 삽입물마다 섬유넥틴과 콜라겐 IV 혼합물90 μL을 코팅하고 24시간 동안 배양하고(C)30분 동안 미리 온화한 배지로 막을 평형화시켰다.(D)씨앗 2 x 105 인간 뇌 미세혈관 내피 세포를 삽입당. (E)적절한 시간 동안 접시를 경작한다. (F)측정 하기 하루 전에, LB 배지 배양 튜브에 대장균 콜로니를 넣고 24 시간 동안 배양 (G)세포를 치료하거나 TEER을 측정하십시오. (H)항생제없는 배지로 완전한 배지를 교환하십시오. (I)세균 용액 (OD600 = 0.5)의 450 μL을 각 상부 챔버에 넣고 6 시간 동안 배양합니다.(J)포셉으로 인서트를 제거하는 각 하부 챔버에서 배지 50 μL을 배양하십시오. (K)한천 접시에 샘플을 접시에 접시와 24 시간 동안 배양 . (L)식민지를 계산하고 데이터를 분석한다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

   

Representative Results

프로토콜에 따라 셀을 시드하고 BBB 모델을 구축했습니다. 14일째에, 세포는 반응성 알데히드로 글리옥살로 처리하였다. 실험의 목적은 POD27에서 연령과 당뇨병 사이의 상관관계를 조사하고 노인환자48에서뇌막염의 높은 발생률을 조사하는 것이었다. 나이와 당뇨병 모두에서 고급 당화 최종 제품 (AGEs)의 증가 수준은BBB를 통해 미생물 통과의 병인에 있는 당화의 효력의 추가 검사를 요구합니다. 당화는 탄수화물 또는 다른 카보닐 화합물을 감소시키는 탄산기 그룹과 단백질에서 자유 아미노 그룹의 비 효소 반응이다. 포도당은 카보닐 그룹의 기증자로 잘 알려져 있다; 그러나, 알려진 더 많은 반응하는 것들이 있다. 불안정한 Schiff의 기지를 구축 한 후, 그들은 글리옥살과 같은 보다 안정적이고 반응성 디카보닐 화합물로 재배열합니다. 최종 제품인 AGEs는 단백질50사이의 교차링크를 유발할 수 있습니다. 그(것)들은 세포 구조물을 손상하고 AGEs의 수용체와의 상호 작용에 의해 세포 기능을 바꿀 수 있습니다 (RAGE)51.

세포는 1시간 동안 0.05 및 0.15 mM 글리옥살(GO) 용액으로 처리하였고, 치료되지 않은 세포는 대조군으로 작용하였다. 당화는 항-AGE 항체를 통한 면역블롯팅 및 검출을 통해 검출되었다(도3). 얻어진 세균 콜로니는 대조군으로 정규화된 콜로니의 절대수(도 4A)또는 대조군으로 정규화된 콜로니의 절대 수로 계수(도4B)로나타났다. 처리되지 않은 세포와 우물에서 취한 배지는 거의 식민지를 형성하지 않았다. 이 결과는 처리되지 않은 세포가 장벽을 건설할 수 있고 통제로 봉사할 수 있었다는 것을 보여주었습니다. 글리옥살로 처리된 샘플은 콜로니의 수가 증가하여 THBMECs 및 세포 장벽 밀도에 글리옥살의 효과가 있다는 결론을 내렸는데, 이는 콜로니수가 치료되지 않은 세포와 처리된 세포 사이의 유의한 차이를 보여주었기 때문입니다. glyoxal를 가진 처리 후에 장벽의 증가한 세균성 교차는 왜 당뇨병이 BBB 고장과 질병과 상관되는지 설명할 수 있었습니다.

Figure 3
그림 3: 면역 블로팅을 통한 단백질 당화 검출. THBMECs는 1 시간 동안 상이한 농도로 GO로 처리하였다. 총 단백질은 SDS-PAGE를 사용하여 분리하고 분리하였다. 단백질의 당화는 항-AGE 항체(CML-26)를 사용하여 면역블롯팅을 통해 검출되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

상이한 환경에서, THBMECs의 단백질 당화는 포도당에 의해 유도되었다. 멸균된 포도당은 DMEM/F-12 배지에 첨가하여 정상 포도당 배지(NG)에서 42.5 mM의 고혈당 배지(HG)로 17.5 mM의 포도당 농도를 증가시켰다. THBMECs는 두 개의 상이한 세포 배양 플라스크에서 재배되었다: 하나는 정상 포도당 (NG) 배지에서 이고 다른 하나는 높은 포도당 (HG) 배지에서. 이 2개의 상이한 매체는 또한 12개의 웰 플레이트에 있는 필터에 BBB의 성장을 위해 이용되었습니다. NG 배지에서 배양된 세포는 대조군으로 작용하였다. 얻어진 콜로니는 대조군으로 정규화된 콜로니의 절대수(도 4C)또는 상대적인 콜로니 수로 표현된다(도4D). 결과는 인간 BBB를 통해 박테리아의 통과에 유의한 효력을 나타내지 않으며, NG 대 HG의 효력이 BBB의 무결성에 영향을 미칠 만큼 충분히 심각하지 않다는 결론으로 이끌어 냅니다. 다른 시나리오는 BBB를 모방하는 셀의 모델 과 무결성을 증명하도록 설계되었습니다.

Figure 4
그림 4: THBMECs를 가진 BBB 모형에 있는 계산된 세균성 식민지의 절대 그리고 상대적인 수. THBMECs는 1시간 동안 0.15 mM GO로 처리하였고, 치료되지 않은 세포는 대조군으로 작용하였다. 총 450 μL의 대장균 현탁액(OD600 = 0.5)을 각 상부 챔버에 첨가하였다. 하부 챔버로부터 배지는 6시간 후 한천 플레이트상에 도금되었다.(A)그래프는 계수된 콜로니의 평균 평균 +/-SEM을 나타낸다. (B)그래프는 처리되지 않은 셀에 정규화된 카운트된 콜로니를 대조군 +/- SEM(n =4)으로 나타낸다. (C)(D)THBMECs를 NG 및 HG 배지로 재배하였다. 총 450 μL의 대장균 현탁액(OD600 = 0.5)을 각 상부 챔버에 첨가하였다. 하부 챔버로부터 배지는 6시간 후 한천 플레이트상에 도금되었다.(C)그래프는 계수된 콜로니의 평균 평균 +/-SEM을 나타낸다. (D)그래프는 처리되지 않은 셀에 정규화된 카운트된 콜로니를 대조군 +/- SEM(n = 3)으로 나타낸다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

Discussion

미생물 통과의 병인에 대한 제한된 통찰력은 POD 또는 뇌막염에 대한 치료법의 추가 개발을 제한합니다. 이 질병의 사망률 그리고 이환율은 더 나은 참을성 있는 처리를 요구하고, 근본적인 기계장치의 연구를 요구하고, 복합 검열을 위한 강력한 단상을 필요로 합니다. 다인성 사건은 인간 BMECs로 연구될 수 있습니다. 다수의 종으로부터 BMECs의 여러 성공적인 보고 격리 절차는 세포의 특성 분자시그니처(52,53)의손실을 나타내고 있다. 이 절차에서 기술된 THBMECs는 특정 두뇌 내피 세포 특성을 전시하고그(것)들을 43를보존하는 아주 초기 통로에서 형질감염되었습니다. 이것은 중요한, 영향 받은 통로에 있는 모든 단계가 지금까지 발견되지 않았기 때문에, 이 모형은 전통적인 BMECs를 모방하는 것처럼 보입니다. 우리의 제시된 모형은 BMECs및 BBB를 통해 미생물 통과에 직접적인 영향을 보여줍니다.

THBMEC 세포의 처리는 간단하며, 필요한 기술 장비는 대부분의 생명 과학 실험실에 존재합니다. 우리의 모델은 THBMECs가 단단한 단층을 구축 한 후 조사 절차의 즉각적인 시작을 허용합니다. 응용 분야는 새로운 테스트와 TEER 측정 또는 추적자54로라벨링과 같은 기존 실험 사이의 가능한 조합으로 인해 광범위할 수 있습니다. 또한 성상 세포 또는 pericytes를 추가하여 공동 또는 삼중 배양 모델을 만들 수도 있습니다. 미생물 통과에 대한 약물의 영향은 또한 박테리아로 상부 챔버를 접종하기 전에 화합물로 THBMECs를 치료함으로써 우리의 모델에서 테스트 할 수 있습니다. 사실, 절차의 자동화를 허용 96 웰 플레이트 필터인서트를 구입할 수 있습니다. 이는 언급된 질병에 대하여 약물의 발견을 가속화하고 약물 개발 동안 BBB에 대한 부작용을 감소시키기 위해 고처리량 약물 스크리닝 시스템의 구현을 용이하게 할 수 있다.

제시된 방법에서 중요한 단계는 상부 챔버에 박테리아를 첨가한 후 배양 시간이다. 대장균의 생성 시간은 20 분55에불과하기 때문에 프로토콜의 타임 라인으로 시간을 사용하는 것이 중요합니다. 그렇지 않으면 다른 시간 포인트를 사용하면 오해의 소지가 있는 결과가 발생할 수 있습니다. 또한 플레이트를 주의하여 취급하지 않으면 세균 노출 시 상부 챔버와 하부 챔버 사이에 오염될 수 있습니다. 이 시점에서 12 웰 플레이트에 대한 모든 변경은 하부 챔버의 매질을 오염시킬 수 있습니다.

대장균은 세균성 뇌막염의 잘 알려진, 아주 일반적인 원인 입니다. 추가 조사는 또한 Neisseria 뇌막염과같은 뇌막염과 연관되는 다른 박테리아를 시험해야합니다 56 또는 연쇄상 구균 폐렴57. 이들은 BBB를 교차하기 위하여 다른 기계장치를 사용하는 것을 보이고 환자의 처리를 위해 더 잘 이해될 필요가 있습니다. 노인 환자에서, POD에 대 한 발생률 증가26 발생 동반 변의 수 뿐만 아니라. 그것은 다른 질병 사이 상호 작용이 알려져 있다, 특히 전신 것 들 당뇨병 같은. 우리의 모형에서는, 박테리아를 추가하기 전에 그 조건을 시뮬레이션하거나 세포를 취급하는 것이 가능합니다.

모델은 THBMECs와 박테리아의 직접적인 접촉에 의해 제한되고, 추가 연구는 관련시킨 통로 및 단백질을 검출하기 위하여 접촉의 잠재적인 기계장치를 조사하기 위하여 필요합니다. 그러나, 추가 분석을 위해 삽입을 제거하고 세포를 수확할 수 있다. 모델의 TEER은 줄기 세포 모델38,39,40에비해 낮다. 우리는 6 시간 후에 처리되지 않은 세포에서 BBB를 교차하지 않은 세균 농도를 사용하여 이를 확인하였다.

요약하면, 이 방법은 높은 처리량 의 약물 스크리닝을 위해 그것을 확장할 수 있는 잠재력을 가진 BBB를 통해 박테리아의 통과를 분석하는 강력한 플랫폼을 나타냅니다.

Disclosures

저자는 공개 할 것이 없다.

Acknowledgments

저자는 이 방법에 대한 이전 작업에 대한 메리암 후세인 박사를 인정, PD 박사 커스틴 댄커의 그룹 (샤리테 Universitätsmedizin, 베를린) 비판적으로 원고를 읽고 THBMECs와 줄리안 베버를 제공하기위한. 이 연구는 RTK 2155 (ProMoAge)에 의해 지원되었다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar - Agar Carl Roth 6494.3 BioScience-Grade
Autoclave Systec VX-150
Bacteria E.coli strain GM2163 Fermentas Life Sciences, Lithuania
Photometer Eppendorf 6131
Cells THBMEC Group of M. F. Stins
Cell culture flasks Greiner Bio-One 658175
Centrifuge Universal 320 Hettrichlab 1401
Collagen IV SIGMA Aldrich C6745 from human cell culture
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% Invitrogen C10311
Culture tubes Greiner Bio-One 191180
Cuvettes BRAND 759015
Di sodium hydrogen phosphate di hydrate MERCK 1065800500
DMEM/F-12 GIBCO/ Thermo Sc. 11330032 HEPES
Falcon tubes 15 ml Greiner Bio-One 188271
Falcon tubes 50 ml Greiner Bio-One 227261
Fetal Bovine Serum GIBCO/ Thermo Sc. 10270 value FBS -Brazil
Fibronectin SIGMA Aldrich F0556 solution human fibroblasts
Heracell 150 CO2 Incubator Heraeus 50116047
Incubator shaker I 26 New Brunswick Eppendorf M1324-0000
Inoculation loop Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel 641000
LB Broth Base GIBCO/ Thermo Sc. 12780029
L-Glutamine GIBCO/ Thermo Sc. 25030-081
Microbial incubator B 6200 Heraeus 51015192
Microbiological Safety Cabinet AURA 2000 M.A.C. Class II BIOAIR 12469
Microscope inverse Zeiss TELAVAL 31
Micro tubes 2 ml Sarstedt 72,695,400
Micro tubes 1,5 ml Sarstedt 72,706,400
Penicillin / Streptomycin GIBCO/ Thermo Sc. 15140122
Petri dish Dr. Ilona Schubert - Laborfachhandel 464-800
Potassium chloride Roth HN02.3
Potassium-di-hydrogen phosphate Roth P018.2
Sodium chloride Roth 9265.2
ThinCerts + Multiwell Plates Greiner Bio-One 665631 12 well, pore size 3.0 µm
Trypsin - EDTA GIBCO/ Thermo Sc. 15400054
Vacuumpump Laboport KNF N 86 KT.18

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Weber, V., Bork, K., Horstkorte, R., Olzscha, H. Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (156), e60692, doi:10.3791/60692 (2020).More

Weber, V., Bork, K., Horstkorte, R., Olzscha, H. Analyzing the Permeability of the Blood-Brain Barrier by Microbial Traversal through Microvascular Endothelial Cells. J. Vis. Exp. (156), e60692, doi:10.3791/60692 (2020).

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