Den menneskelige blod-hjernebarrieren forhindrer selektivt penetrasjon av hydrofile molekyler og patogener inn i hjernen. Flere patologier, inkludert meningitt og postoperativ delirium, er forbundet med økt permeabilitet av blod-hjernebarrieren. Her beskriver vi en endotelcellekulturmodell for å teste barrierenpermeabiliteten ved mikrobiell traversering.
Den menneskelige blod-hjernebarrieren (BBB) er preget av en svært lav permeabilitet for biomolekyler for å beskytte og regulere metabolismen av hjernen. BBB er hovedsakelig dannet ut av endotelceller innebygd i kollagen IV og fibronectin-rike kjellermembraner. Flere patologier skyldes dysfunksjon av BBB etterfulgt av mikrobiell traversering, forårsaker sykdommer som meningitt. For å teste effekten av flere parametere, inkludert forskjellige stoffer og bedøvelse, på permeabiliteten til BBB etablerte vi en ny menneskelig cellekulturmodell som etterlignet BBB med humane hjernemikrovaskulære endotelceller. Endotelcellene dyrkes på kollagen IV og fibronectinbelagte filterenheter til samløpet og kan deretter behandles med forskjellige forbindelser av interesse. For å demonstrere en mikrobiell traversering, er det øvre kammeret med den apikale overflaten av endotelcellene inokulert med bakterier. Etter en inkubasjonsperiode er prøver av det nedre kammeret belagt på agarplater og de oppnådde koloniene telles, hvorantall kolonier korrelerer med permeabiliteten til BBB. Endogene cellulære faktorer kan analyseres i dette eksperimentelle oppsettet for å belyse grunnleggende cellulære mekanismer i endotelcellene som bidrar til BBB. I tillegg gjør denne plattformen det mulig å utføre en skjerm for forbindelser som kan påvirke permeabiliteten til endotelcellene. Til slutt kan bakteriell traversering studeres og knyttes til forskjellige patologier, som meningitt. Det kan være mulig å utvide modellen og analysere bakterienes veier gjennom BBB. I denne artikkelen gir vi en detaljert protokoll av den beskrevne metoden for å undersøke permeabiliteten til BBB.
Den menneskelige BBB er en unik grense for hjernevev, som skiller hjernen fra blodet. Det regulerer strengt passasjen av større og hydrofile molekyler, blokkerer paracellulær diffusjon, og opprettholder hjernenhomeostase. Det beskytter også hjernen mot plasmasvingninger, giftstoffer, mikrober og guider inflammatoriske celler som en del av sentralnervesystemet (CNS) immunitet. Siden oppdagelsen for hundre år siden1, mange studier har blitt utført for å forstå strukturen og funksjonen til BBB. De komplekse interaksjonene mellom celler, proteiner og signaler fra hjerne- og blodkrever fortsatt videre undersøkelse og modeller.
Den menneskelige BBB består av tre celletyper: hjernemikrovaskulærendotelceller (BMECer), pericytes og astrocytter2,3. BMECs skiller seg fra flertallet av endotelcellene i kroppen ved at de har et høyt antall tette veikryss og fester veikryss4, lav pinocytotisk aktivitet2,5og en kontinuerlig kjellermembran6,7 for å blokkere paracellulær diffusjon. Små lipofile molekyler kan spre og passere BBB etter konsentrasjonsgradienten; større og hydrofile molekyler kommer inn eller forlater hjernen bare gjennom polariserte uttrykte selektive transportsystemer8. Denne forskriften resulterer i en høy transendothelial elektrisk motstand (TEER) på 1500-2000 Ω·cm2 som er omvendt korrelert til permeabilitet9,10. Selv om BMECs bygger en stram barriere, kan de reagere på lokale og perifere signaler11,12. Det er en tett interaksjon mellom BMECs og astrocytter13; de astrocyttende endeføttene bygger et lag rundt fartøyene og induserer dannelsen av stramme veikryss13,14. De er involvert i BBB modning med ulike faktorer, inkludert transformere vekstfaktor-β (TGF-β)15,16. I tillegg spiller pericytes en nøkkelrolle i reguleringen av angiogenese17 og forhindrer apoptose av endotelet i cellulær differensiering18 (Figur 1). De er innebygd i kjellermembranen og gir strukturell stabilitet av fartøyetveggen19.
Figur 1: Skjematisk struktur av blod-hjernebarrieren. Den unike strukturen til den menneskelige BBB består av tre forskjellige celletyper. Mikrokarlumen er omgitt av endotelceller, som er beriket i trange veikryss, og er ikke fenestrated. De er innebygd i kjellermembranen, som pericytes. Disse cellene er viktige for strukturell stabilitet av fartøyetveggen og spiller en rolle i utviklingen av BBB ved siden av astrocytter. Deres ende-føtter bygge et nært lag rundt fartøyet og støtte bygging av trange veikryss. Alle komponenter i BBB er viktige for fysiologisk funksjonalitet. Vennligst klikk her for å vise en større versjon av dette tallet.
Mange forskjellige patologier er relatert til sammenbruddet av BBB (f.eks. septisk encefalopati). De berørte pasientene har økt proteinnivåer i cerebrospinalvæsken20,og hjerneparenchyma hos berørte gnagere viser økt opptak av markert kolloidalt jernoksid og aminosyrer21,22. Disse resultatene peker mot økt permeabilitet av BBB som oppstår sammen med en økt pinocytose i BMECs21 og endotelaktivering23. En annen assosiert patologi relatert til en endret BBB er meningitt, en medisinsk nødsituasjon og en kompleks betennelse ledsaget av cerebralt ødem som kan føre til nevronal celledød. Det primære inngangsstedet for sirkulerende bakterier skal være mikrofartøyene24; BBB forhindrer imidlertid at bakterier kommer inn. Permeabiliteten til BBB er ikke alltid knyttet til en økning i eksperimentell hematogen meningitt25 og mekanismene kan være multifaktorielle. Tilfeldighet av sepsis med postoperativ delirium (POD)26 og foreningen med preoperative infeksjoner27,28 indikerer behovet for en BBB-modell som gjør det mulig for direkte eksponering for bakterier å få en bedre forståelse i bakteriell patogenese.
Det er mange hull i å forstå og kvantifisere mikrobiell traversgjennom BBB. Derfor utviklet vi en modell som muliggjør en praktisk testing av ulike faktorer og forhold med en direkte sammenheng mellom bakteriell traversog påvirkningpå permeabiliteten til BBB. Tidligere arbeid fokuserte på paracellulær permeabilitet og inkluderte TEER-måling og tracer flux. I tillegg ble makromolekyltransport analysert av konjugerte molekyler eller antistoffer, der forskjellige modeller som bare brukte endotelceller eller kombinasjoner med astrocytter og pericytes ble utviklet. På grunn av vanskeligheten med å skaffe menneskelig vev regelmessig, brukes mange dyrebaserte modeller. Hjerneendotelceller av storfe og svineopprinnelse danner stramme monolag med høy TEER som danner velformet apikal-basal polaritet og er egnet for undersøkelser av små molekyltransport gjennom BBB. Proteinene varierer i rekkefølge fra deres menneskelige homologer29,30, noe som gjør undersøkelse av terapeutiske antistoffer vanskelig. Av denne grunn kan murine eller menneskelig kultur modeller være å foretrekke. Mus eller rotter som utvalgskilder har fordelen av å bli hentet fra velkarakteriserte arter, men gir få celler for studieformål. Dette kan omgås ved bruk av udødeliggjort mus hjernen endothelioma (END) cellelinjer bEND.3, bEND.5 eller cEND31,32,33.
Primære kultiverte celler fra menneskelig vev er vanskelig å oppnå og å håndtere regelmessig. Derfor er de fleste menneskelige cellulære modeller som brukes i forskning som undersøker den menneskelige BBB udødeliggjort endotelcellelinjer. En publisert cellelinje er human cerebral mikrovaskulær endotelcellelinje hCMEC/D3, som er godt egnet for å studere legemiddelopptak og er lett å håndtere. Cellene bygger en monolayer og uttrykker de karakteristiske tette koblingsproteinene til BBB34, mens uttrykksnivået for claudin-5 rapporteres å være lavere enn i intakte mikrofartøy35 og mange spesifikke transportører har blitt oppdaget på transkripsjonsnivå36, samt i proteomiske studier34. En relativt lav TEER i området 30-50 Ω·cm2 er fortsatt en utfordring37. En annen kilde for hjerneendotelceller er humane pluripotente stamceller (hPSCs)38 og humane ledningen blod-avledede stamceller av sirkulerende endotelstamceller og hematopoetiske linjer39,40. Begge protokollene for differensiering resulterer i trange cellemonolag og høye TEER-verdier (f.eks. 1450 Ω·cm2 i co-kulturer)38. Disse stamcellemodellene krever ekstrem omsorg for dyrking, men gir likevel mulighet til å studere påvirkning av å regulere hormoner41 eller sykdommer med genetisk bakgrunn42 på BBB utvikling.
I denne studien etablerte vi en udødeliggjort transinfisert human hjerne mikrovaskulær endotelcellelinje, THBMEC43, for å etterligne BBB og for å studere bakteriell traversal. Celler seedes på et filter og dyrkes til 100% samflyt i denne cellekulturmodellen. Bakterier er vaksinert i den øvre delen av cellekulturkammeret. Vi bruker Escherichia coli (E. coli) i vår prøvestudie på grunn av den høye forekomsten av E. coli meningitt44. Det har vist seg at den laveste permeabiliteten til cellemonolayer oppstår mellom dag 13 og dag 15 etter seeding45. Derfor utføres behandling av THBMEC monolayer etter denne tiden, og bakterier inokulerer etterpå i mediet på monolayerens apikale overflate. Etter en inkubasjonstid kvantifiseres bakterier som var i stand til å krysse barrieren via platingmedium med bakteriene på agarplater og teller koloniene. Et økt antall kolonier korrelerer med høyere bakteriell traversering gjennom BBB. TEER er ca 70 Ω·cm246. Det er imidlertid ikke nødvendig å måle TEER i den beskrevne metoden. Selv om det er en veletablert verdi for permeabiliteten til BBB, synes det ikke å ha noen innvirkning på traverseringen av bakterier gjennom BBB. Ubehandlede celler tjener som en kontroll av tetthet i vår modell. Det har blitt vist i tidligere arbeid at cellene er i stand til å reagere på proinflammatoriske cytokiner og uttrykke typiske stramme koblingsproteiner47. Dette gjør det mulig for sammensatt screening og validering av et større sett med transportørsubstrater og reseptorer.
Begrenset innsikt i patogenesen av mikrobiell traversering begrenser videre utvikling av terapier for POD eller meningitt. Dødeligheten og sykeligheten til disse sykdommene krever bedre pasientbehandling, krever forskning på de underliggende mekanismene, og trenger en robust plattform for sammensatt screening. De multifaktorielle hendelsene kan studeres med menneskelige BMECer. Flere vellykkede rapporterte isolasjonsprosedyrer av BMECer fra en rekke arter har vist tap av cellenes egenskaper molekylær signatur52,53. De beskrevne THBMECs i denne prosedyren ble transinfisert i svært tidlige passasjer, hvor de viste spesifikke hjerneendotelcelleegenskaper og bevarte dem43. Dette er viktig, fordi ikke alle trinnene i de berørte banene har blitt oppdaget så langt, og denne modellen ser ut til å etterligne konvensjonelle BMECs. Vår presenterte modell viser direkte påvirkninger på BMECs og mikrobiell traversgjennom BBB.
Håndteringen av THBMEC-celler er enkel, og det nødvendige tekniske utstyret finnes i de fleste biovitenskapelige laboratorier. Vår modell åpner for en umiddelbar start på undersøkende prosedyrer etter at THBMECs har bygget et stramt monolayer. Bruksområder kan være omfattende på grunn av mulige kombinasjoner mellom nye tester og konvensjonelle analyser som TEER-måling eller merking med tracers54. Det er også mulig å legge til astrocytter eller pericytes for å lage en co- eller trippel-kultur modell. Påvirkningen av legemidler på mikrobiell traverskan også testes i vår modell ved å behandle THBMECs med forbindelser før inokulering av det øvre kammeret med bakterier. Faktisk er det mulig å kjøpe innsatser med filtre for 96 brønnplater slik at automatisering av prosedyren. Dette kan lette gjennomføringen av høy gjennomstrømning narkotika screening systemer for å akselerere oppdagelsen av narkotika mot nevnte sykdommer og redusere bivirkninger på BBB under narkotikautvikling.
Et kritisk skritt i den presenterte metoden er inkubasjonstiden etter å ha tillagt bakteriene til det øvre kammeret. Det er viktig å bruke timer som tidslinjer i protokollen, fordi generasjonstiden til E. coli er bare 20 min55. Ellers kan bruk av forskjellige tidspunkter føre til villedende resultater. Det er også en mulig risiko for forurensning mellom øvre og nedre kammer under bakteriell eksponering hvis platene ikke håndteres med forsiktighet. Eventuelle endringer i 12 brønnplaten på dette tidspunktet kan forurense mediet i det nedre kammeret.
E. coli er en velkjent, svært vanlig årsak til bakteriell meningitt. Videre undersøkelser bør teste forskjellige bakterier som også er forbundet med meningitt, som Neisseria meningitidis56 eller Streptococcus pneumoniae57. Disse ser ut til å bruke forskjellige mekanismer for å krysse BBB og må forstås bedre for behandling av pasienter. Hos eldre pasienter øker forekomsten for POD26, samt antall forekommende komorbiditeter. Det er kjent at det er interaksjoner mellom ulike sykdommer, spesielt systemiske som diabetes. I vår modell er det mulig å simulere disse forholdene eller behandle cellene før du legger til bakteriene.
Modellen er begrenset av direkte kontakt med THBMECs og bakterier, og videre forskning er nødvendig for å undersøke potensielle kontaktmekanismer for å oppdage de involverte veier og proteiner. Det er imidlertid mulig å fjerne innsatser og høste cellene for videre analyse. TEER-en til modellen er lavere sammenlignet med stamcellemodellene38,39,40. Vi bekreftet dette ved hjelp av en bakteriell konsentrasjon som ikke krysset BBB i ubehandlede celler etter 6 timer.
Oppsummert representerer denne metoden en robust plattform for å analysere traversering av bakterier gjennom BBB med potensial til å utvide den for høy gjennomstrømning narkotika screenings.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne erkjenner Dr. Maryam Hussain for tidligere arbeid på denne metoden, gruppen av PD Dr. Kerstin Danker (Charité-Universitätsmedizin, Berlin) for å gi THBMECs og Juliane Weber for kritisk lesing manuskriptet. Denne studien ble støttet av RTK 2155 (ProMoAge).
Agar – Agar | Carl Roth | 6494.3 | BioScience-Grade |
Autoclave | Systec | VX-150 | |
Bacteria E.coli strain GM2163 | Fermentas Life Sciences, Lithuania | ||
Photometer | Eppendorf | 6131 | |
Cells THBMEC | Group of M. F. Stins | ||
Cell culture flasks | Greiner Bio-One | 658175 | |
Centrifuge Universal 320 | Hettrichlab | 1401 | |
Collagen IV | SIGMA Aldrich | C6745 | from human cell culture |
Countess Automated Cell Counter with cell counting chamber slides and Trypan Blue stain 0.4% | Invitrogen | C10311 | |
Culture tubes | Greiner Bio-One | 191180 | |
Cuvettes | BRAND | 759015 | |
Di sodium hydrogen phosphate di hydrate | MERCK | 1065800500 | |
DMEM/F-12 | GIBCO/ Thermo Sc. | 11330032 | HEPES |
Falcon tubes 15 ml | Greiner Bio-One | 188271 | |
Falcon tubes 50 ml | Greiner Bio-One | 227261 | |
Fetal Bovine Serum | GIBCO/ Thermo Sc. | 10270 | value FBS -Brazil |
Fibronectin | SIGMA Aldrich | F0556 | solution human fibroblasts |
Heracell 150 CO2 Incubator | Heraeus | 50116047 | |
Incubator shaker I 26 New Brunswick | Eppendorf | M1324-0000 | |
Inoculation loop | Dr. Ilona Schubert – Laborfachhandel | 641000 | |
LB Broth Base | GIBCO/ Thermo Sc. | 12780029 | |
L-Glutamine | GIBCO/ Thermo Sc. | 25030-081 | |
Microbial incubator B 6200 | Heraeus | 51015192 | |
Microbiological Safety Cabinet AURA 2000 M.A.C. Class II | BIOAIR | 12469 | |
Microscope inverse | Zeiss | TELAVAL 31 | |
Micro tubes 2 ml | Sarstedt | 72,695,400 | |
Micro tubes 1,5 ml | Sarstedt | 72,706,400 | |
Penicillin / Streptomycin | GIBCO/ Thermo Sc. | 15140122 | |
Petri dish | Dr. Ilona Schubert – Laborfachhandel | 464-800 | |
Potassium chloride | Roth | HN02.3 | |
Potassium-di-hydrogen phosphate | Roth | P018.2 | |
Sodium chloride | Roth | 9265.2 | |
ThinCerts + Multiwell Plates | Greiner Bio-One | 665631 | 12 well, pore size 3.0 µm |
Trypsin – EDTA | GIBCO/ Thermo Sc. | 15400054 | |
Vacuumpump Laboport | KNF | N 86 KT.18 |