Summary
이 프로토콜은 오로 위관을 통해 CCl4 노출을 통해 급성 간 손상 (ALI)을 유도하는 일반적이고 실행 가능한 방법을 설명합니다. CCl4 노출은 간에서의 생체 변환 동안 반응성 산소 종의 형성을 통해 ALI를 유도합니다. 이 방법은 ALI의 병리생리학을 분석하고 다른 간 보호 전략을 검사하는 데 사용됩니다.
Abstract
급성 간 손상 (ALI) 간 실패의 개발에 중요 한 역, 간 뇌 증 및 장애인된 단백질 합성 등 합병증을 포함 하 여 심한 간 기능 장애를 특징으로 하는. 적절한 동물 모델은 ALI의 메커니즘과 병리생리학을 테스트하고 다른 간 보호 전략을 조사하는 데 필수적입니다. 화학적 변형을 수행하는 능력으로 인해 탄소 사염소산화물 (CCl4)은반응성 산소 종의 형성을 통해 ALI를 유도하기 위해 간에서 널리 사용됩니다. CCl4 노출은 복강 내, 흡입, 또는 비위 관 또는 오로 위관을 통해 수행 될 수 있습니다. 여기에서, 우리는 ALI가 oro위관을 통해CCl4 노출에 의해 유도되는 설치류 모형을 기술합니다. 이 방법은 저렴하고 쉽게 수행되며 위험 위험이 최소화됩니다. 이 모델은 매우 재현 가능하며 잠재적 인 간 보호 전략의 효능을 확인하고 간 손상의 마커를 평가하는 데 널리 사용할 수 있습니다.
Introduction
특히 알코올 및 약물 남용으로 인해 간에서 독성 모욕의 빈도가 증가하고 있습니다. 급성 간 손상 (ALI)은 높은 사망률과 관련이 있으며 임상 적 우려를 일으켰습니다1,,2. 독성 상해는 간세포 세포 사멸, 괴사 증, 또는 pyroptosis의 결과로 간에서 죽음 신호 통로로 이끌어 냅니다. ALI는 간뇌병증 및 단백질 합성 장애 등의 합병증을 포함하는 중증 간 기능 장애를 특징으로 하는 간 부전의 발달에 중요한 역할을 한다3,,4. 최근 연구는 간 실패를 동반하는 생리적 및 병리학적 변화에 대한 우리의 지식을 증가시켰지만, 세포 사멸의 메커니즘에 영향을 미치는 병리 분자 특징을 완전히 설명하지는 못했습니다. 게다가, 어떤 약물은 현재 ALI 환자에 있는 진보적인 악화를 반전하기 위하여 유효하지 않습니다. 현재, 유일하게 유의하고 효과적인 치료법은 간 이식5,,6.
ALI의 메커니즘 및 병리생리학을 조사하고 상이한 간보호 전략을 테스트하기 위해, 다른 동물 모델이 ALI를 유도하는 데 사용된다. ALI의 바람직한 동물 모델은 신뢰할 수 있고, 검증되고, 저렴하고 적용하기 쉬운 방법을 통해 질병의 병리학 적 과정을 모방해야합니다. 실험 모델의 예로는 간독성 제제, 전체 또는 부분 간절제술과 같은 외과 적 시술, 완전 또는 일시적인 편환성 및 감염 시술7,,8,,9가포함된다. 알려진 간독성 물질에는 갈락토사민, 아세트아미노펜, 티오아세타미드, 아조시메탄 및 CCl4가포함된다. 이들 중, CCl4는 아직잘 10,11,,,12,,13을특징으로하지 않았지만 널리 사용된다.
CCl4는 달콤한 냄새가 나고 낮은 온도에서 가연성이 거의 없는 유기 무색 액체 화합물입니다. CCl4의 고농도에 노출은 간 및 신장의 악화를 포함하여 중추 신경계에 손상을 일으킬 수 있습니다. CCl4는 반응성 산소 종을 형성하는 간에서의 생체 변환을 통해 ALI를 유도합니다. 이는 P450 시토크롬 효소 2E1을 통해 발생하며, 활성 대사 산물을 형성하고 거대 분자 결합에 의한 세포 손상을 초래하고, 지질 과산화의 향상 및 세포 내 칼슘 항상성의교란을 초래한다 14. 또한, CCl4 모델은 RNA 합성15의수준에서 성상 세포체를 자극하는데 사용될 수 있다. 이 간독소는 복강 내, 인트라포탈, 구강 및 위내 경로16에의해 투여되고 있다.
이 프로토콜에서, 우리는 오로위관을 통해 쥐에서 CCl4-유도ALI를 상세히 기술한다. 이 방법은 ALI의 병인을 조사하는 데 사용할 수 있는 강력하고 재현 가능한 ALI를 유도합니다. 간 질환 중증도의 결정은 혈청 글루타메이트 피루베이트 트랜스아미나제(GPT), 글루타믹 옥살로아세틱 트랜스아미나제(GOT) 효소 및 총 빌리루빈(TB)의 측정뿐만 아니라 헤마톡실린과 에오신(H&E)의 스테인드 간 조직에 의한 확실한 조직학적 진단을 통해 모니터링됩니다. 위내 접근을 통해 CCl4에 노출되면 위험 위험을 최소화하면서 실용적이고 저렴하며 최소침습적인 방법을 사용할 수 있습니다.
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Protocol
실험은 헬싱키와 도쿄 선언의 권고와 유럽 공동체의 실험 동물 사용에 대한 지침에 따라 수행되었습니다. 실험은 네게브의 벤 구리온 대학의 동물 관리위원회에 의해 승인되었다.
참고: CCl4 모델은 이전 연구17에서생성되고 사용되었습니다. 프로토콜 타임라인은 표 1에서설명됩니다.
1. 실험 절차에 대한 쥐 준비
참고 : 300−350g의 무게성인 남성 스프라그 Dawley 쥐를 선택합니다.
- 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에서 실험에 대한 승인을 얻습니다.
- 12 시간 빛과 12 시간 어두운 주기와 실온 (22 ° C ± 1 ° C)에서 쥐를 유지합니다. 쥐 차우와 물 광고 리비텀을 제공합니다.
- 오전 6:00에서 오후 12:00 사이에 모든 실험을 수행합니다.
- 쥐를 면도하고 알코올로 피부를 소독하십시오.
2. 혈청 GOT, GPT 및 결핵 기준선 수준의 결정
- 마 취
- 마취를 유도하는 연속 이소플루란 투여 시스템을 준비한다. 기화기 시스템이 이소플루란으로 채워져 있는지 확인하십시오.
- 2 % 이소플루란으로 쥐를 마취시. 쥐가 외부 자극에 반응하여 움직임과 페달 반사를 관찰하여 완전히 마취되어 있는지 확인하십시오.
참고: 마취 유도 및 유지 보수를 위해 1-5% 이소플루란을 사용하십시오.
- 꼬리 정맥을 22 G 카테터로 통조합니다.
- 기준선에서 0.5 mL 혈액 샘플을 수집합니다. 검색된 혈액 량이 IACUC 지침을 초과하지 않는지 확인합니다.
- 앞서 설명한 바와 같이 혈청 GOT, GPT 및 TB의 측정을 포함하는 혈액 생화확적인 분석을수행한다.
참고: 소로카 메디컬 센터의 생화학 실험실에서 간 효소와 결핵 수준의 검사가 수행되었습니다. 혈액 샘플을 화학분석기(물자 표)에서형광 방법을 사용하여 분석하였다.
3. 쥐에 있는 심각한 간 상해의 유도
주의: CCl4의고농도에 노출, 증기 또는 피부를 통해 흡수를 포함 하 여, 중추 신 경계에 부정적인 영향을 미칠 수 있으며 간 및 신장의 변성을 일으킬. 장기간 노출되면 혼수 상태에 빠질 수 있습니다.
- CCl4와 올리브 오일을 1:1 비율로 혼합하여 CCl4(재료 표)의50% 용액을 준비합니다.
참고: 용액은 비 제약 등급 화합물에 대한 IACUC 지침에 따라 준비되어야 합니다. - 오로위관을 통해 CCl4 투여에 의해 생체 내 간독성을 유도한다.
- 쥐의 구강을 통해 16G oro위관 (3 인치 깊이)을 삽입하십시오.
- 1 mL/kg (온화한 ALI), 2.5 mL/kg (온건한 ALI), 또는 5 mL/kg (심한 ALI) 50% 용액의 : 쥐의 위장에 다음과 같은 희석 된 용액 중 하나와 주사기를 주입하여 CCl4의 다른 용량에 쥐를 노출. 가짜 조작 대조군의 경우, 쥐를 5 mL/kg 올리브 오일에만 노출시다.
4. 24 시간 후에 혈청 GOT, GPT 및 결핵 수준의 결정
- 마 취
- 마취를 유도하는 연속 이소플루란 투여 시스템을 준비한다. 기화기 시스템이 이소플루란으로 채워져 있는지 확인하십시오.
- 2% 이소플루란으로 쥐를 마취시다. 쥐가 외부 자극에 반응하여 움직임과 페달 반사를 관찰하여 완전히 마취되어 있는지 확인하십시오.
- CCl4 노출에서 24 시간에서 혈액 샘플을 수집합니다.
- 혈청 GOT, GPT 및 결핵의 측정을 포함하여 혈액 생화확적인 분석을 수행합니다.
5. 조직학적 검사를 위한 간 수집
- 영감 받은 가스 혼합물을 20% O 2/80%CO2로대체하여 쥐를 안락사시한다.2 IACUC 지침에 따라CO2가 소정의 속도로 전달되도록 합니다.
- 심장 박동의 부족을 확인 하 여 죽음을 보장 하 고 IACUC 지침에 따라 보조 방법으로 확인.
- 쥐를 해부 보드에 놓고 등지 표면이 아래를 향하고 복부를 위로 향합니다. 쥐의 복부를 면도하십시오.
- 메스로 항문에서 턱까지 뇌 피부 전체를 절개합니다. 피부를 분리합니다. 항문에서 자이포이드 연골까지 메스로 복벽을 절개하여 복부 내장을 노출시하십시오.
- 가위와 집게를 사용하여 인대와 부착부에서 해부하여 간을 분리하십시오. 간 hilum에서 시작하여 부착에서 모든 간 엽을 방출하여 간 절제술을 신중하게 수행하십시오. 해부하고 모든 인대와 혈관을 잘라.
- 간을 페트리 접시에 옮김을 넣습니다. 적어도 24 시간 동안 4 % 버퍼링 된 포름알데히드 용액(재료 표)에간을 고정시.
6. 조직학 검사
- 샘플 준비
- 고정 후 샘플을 마이크로토메 단면으로 5 μm 두께의 슬라이스 시리즈로 자른다.
- 부드러운 브러쉬로 슬라이스를 슬라이드당 1슬라이스로 유리 슬라이드에 부드럽게 놓습니다.
- 앞에서 설명한 대로 H&E염색을 수행합니다 19.
- 20mm 대물 렌즈(재료 표)를 사용하여 200배 배율로 현미경으로슬라이스를검사합니다.
참고 : 간 절은 치료 프로토콜에 눈을 멀게 한 전문 병리학자에 의해 등급이 매겨져야합니다. 점수0은 간 이상이 없음을 나타내고, 1-2는 경미한 간 손상을 나타내고, 3-4는 중간 간 손상을 나타내고, 5-6은 심각한 간 손상을 나타냅니다20,,21,,22.
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Representative Results
TB, GOT 및 GPT 수준은 SHAM-조작 대조군(p&0.001)에 비해 ALI(더 높은 CCl4 투여량에서 더 많은)를 유도한 후 24시간 크게 증가하였다(그림1). 기준선에서 결핵, GOT 및 GPT의 수준은 정상이었고, sham-operate 컨트롤과 크게 다르지 않았습니다. 24 시간에서, 모든 3개의 개입 군, 1 mL/kg CCl4 (1, 1−2), 2.5 mL/kg CCl4 (3, 3−4), 및 5 mL/kg CCl4 (4, 4−5.75) sham-operate 대조군(0, 0−0) (p< 0.05, 데이터) 보다 훨씬 더 높은 조직학적 등급 점수를 가졌다. 샴 작동 대조군(그림2A)과상이한 CCl4 투여량에 노출된 그룹의 H&E 이미지(그림2B-D)는CCl4 노출 후 24시간 동안 조직병리학적 변화를 보여준다. CCl4에 의한 간세포 구조의 붕괴는 큰 섬유성 패혈증 변형, 섬유의 연장, 콜라겐 축적 및 간절에서의 의사 엽 분리를 가진 높은 수준의 조직 손상에 의해 입증되었다(그림2).
도 1: 혈청 결핵(A), GOT(B), 및 GPT(C) 혈료 샘플에서 24시간 동안 다른 CCl에 노출된 후4회 투여량이 샴 작동 대조군과 비교된다. 파란색 막대: 제어; 빨간색 막대 : CCl4 노출 후 24 시간. CCl4-노출된쥐와 노출되지 않은 쥐 사이의 비교의 중요성은 Mann-Whitney 시험을 사용하여 결정됩니다. p값 <0.05는 유의한 것으로 간주되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: H&E로 염색된 간 조직의 조직병리학적 변화는 다양한 용량의 24h CCl4 중독 후. (A)sham-operate 컨트롤, (B) 1 mL/kg CCl4,(C)2.5 mL/kg CCl4,(D)5 mL/kg CCl4. 배율 막대 = 50 μm. 조직학적 결과의 분포는 선형 회귀에 의해 예측되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 그룹 | 0시간 | 24시간 |
| 샴 (15 마리) | GOT, GPT, 결핵 기준 수준 | GOT, GPT, 결핵 수준 |
| 마일드 알리 (15 마리) | ||
| 보통 ALI (15 마리) | 샴 그룹을 위한 ALI 그룹 및 올리브 오일을 위한 CCl4 노출 | 조직학적 검사 |
| 심한 알리 (18 마리) |
표 1: 프로토콜 타임라인의 데모입니다. 상이한 시간에 쥐의 다양한 그룹은 sham-operate 대조군, 온화한 ALI (1 mL/kg CCl4에노출), 온건한 ALI (2.5 mL/kg CCl4에노출), 및 가혹한 ALI (5 mL/kg CCl4에노출)를 포함합니다. 시간에 24 시간, 혈청 GOT, GPT 및 결핵 수준을 측정하고, 조직학적 검사는 네 그룹 모두에 대해 수행되었다.
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Discussion
이 프로토콜에서, CCl4는 쥐에서 ALI를 유도하기 위해 간 독소로서 사용된다. ALI는 간 자렌치의 손실과 간 대사 및 합성 기능의 후속 dysregulation특징입니다. 약물, 바이러스, 독소, 자가 면역 질환, 대사 성 질환 및 혈관 장애는 모두 간세포 사망을 유발하며, 후속 염증 반응은 ALI의 발병기전에 기여합니다.
간으로의 초기 모욕은 사이토카인 생산, 케모카인 방출 및 염증 성 세포의 후속 침투로 이어집니다. ALI 평가를 위한 일반적으로 시험된 바이오마커의 3개는 GPT, GOT 및 결핵 수준입니다. GPT와 GOT는 활동 수준으로 측정된 효소이며, 결핵 수준은 혈청 농도에 따라 간 기능을 측정합니다. 상승하는 때, 혈청 효소 활동 수준은 간세포 또는 담관옥시23에 상해를 나타냅니다.23 급속 한 분광 광도 방법은 1955년 24에서 아서 카르멘의 연구에서 처음 보고되었으며, 이는 혈청 효소 측정의 광범위한 임상 적용을 허용했습니다. 그 이후로, GOT및 GPT 측정은 또한 간세포 상해를 검출하기 위하여 적용되었습니다. GPT는 더 자주 사용되며, 동시 GPT 테스트는 일반적으로 중복 결과를 보여줍니다. 부상당한 세포로부터의 방출 속도와 클리어런스 속도 사이의 GOT 및 GPT의 활성 수준 증가는 세포에 대한 부상의 대략적인 비율을 측정하는 데 사용될 수 있다. 부상당한 간 세포가 담즙으로 빌리루빈을 처리하고 제거하는 것과 같은 정상적인 활동에 실패하게되면 ALI가 더 심각하다는 것을 나타냅니다.
프로토콜에는 중요하고 신중하게 고려해야 할 몇 가지 단계가 있습니다. 대부분의 프로토콜은 혈청 효소 농도 수준에서 표고가 일반적이기 때문에 조사 에이전트에 노출전후혈청 바이오마커 테스트를 요구합니다. 그러나, 높은 ALT의 타이밍의 변동으로 인해, 어떤 고도를 검출하기 위해 정기적으로 여러 테스트를 수행해야합니다. 이 프로토콜에서는, 우리는 독소에 노출 후에 기준선에 있는 GOT, GPT 및 결핵 수준을 시험하고 24 시간 선택했습니다. 최근 연구에 따르면, 이러한 바이오마커의 수준은 이 시간 간격 동안 ALI의 중증도와 잘상관17. 도 1에도시된 바와 같이, 혈액 GOT, GPT 및 결핵의 수준은 ALI를 유도한 후 24시간 모든 샘플에서 상승하였다. 이는 모델이 CCl4에노출된 이후 매우 짧은 시간 간격으로 결과를 정량화했음을 나타냅니다. 하나는 심각한 ALI에서 간 GOT와 GPT를 합성 하는 능력을 잃는다는 것을 고려 해야 한다. 따라서, 이러한 경우에 이들 효소는 문헌에서 입증된 바와 같이 그들의 예측 값이 부족할 수 있다.
CCl4에 노출된 쥐의 조직학적 발견은 세포의 풍선, 중구 괴사 및 의원 몸의 존재25를특징으로한다. 이 모델에서는 CCl4 투여량에 비례하는 것으로 나타난 광범위한 손상이 투여되었다.
오로 위 CCl4 노출을 통해 ALI를 유도하는 이 방법은 많은 장점이 있습니다. 그것은 간단하고 저렴하며 최소한의 위험 위험입니다. 이 프로토콜은 매우 짧은 시간 간격으로 중요한 결과를 제공합니다. 이 모델은 매우 재현 가능하며 잠재적 인 간 보호 전략의 효능을 확인하고 간 손상의 마커를 평가하는 데 일반적으로 사용할 수 있습니다.
CCl4는 주로 인간의 간 부전에서 일반적으로 볼 수있는 거대한 괴사와 일치하지 않는 간 중앙 영역에 영향을 미친다는 점에 유의하는 것이 중요합니다. 더욱이, CCl4는 간에서 완전히 대사되지 않으며, 일부 비대사화 CCl4는 폐 및신장(16)을포함한 다른 장기를 손상시킬 수 있다. 또한, 시토크롬 P450의 상이한 수준으로 인해 개발 및 효능이 있으며, 종 및26세에따라 민감도의 큰 변화가 있다. 이러한 제한에도 불구하고, 오류 위 CCl4-유도ALI의 방법은 여전히 귀중한 설치류 모델의 역할을한다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
저자는 감사하게도 베르사 델가도, 병리학과, 소로카 의료 센터, 건강 과학 학부, 네게브의 벤 구리온 대학, 실험실에서뿐만 아니라 조직학 분석에 그녀의 도움을 인정합니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 G catheter BD Neoflon TM | Becton Dickinson Infusion Therapy AB | ||
| 4% buffered formaldehyde solution | Sigma - Aldrich lab materials technologies | ||
| BD Microtainer SST TM Tubes | Becton Dickinson and Company | ||
| Carbone tetrachloride | Sigma - Aldrich lab materials technologies | CAS 56-23-5 | |
| Isofluran, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | ||
| Olympus AU2700 Chemistry-Immuno Analyzer | Olympus (MN, USA) | Analysis of blood samples was done by the fluorescence method | |
| Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
| RAT Feeding Needles | ORCHID SCIENTIFICS | ||
| SYRINGE SET 1 and 2 ml MEDI -PLUS | Shandong Zibo Shanchuan Medical Instruments Co., Ltd |
References
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