Summary
Этот протокол описывает общий и осуществимый метод индуцирования острой травмы печени (ALI) через CCl4 воздействия через орогастрическую трубку. Воздействие CCl4 вызывает АЛИ путем формирования реактивных видов кислорода во время его биотрансформации в печени. Этот метод используется для анализа патофизиологии АЛИ и изучения различных стратегий гепатопротектор.
Abstract
Острая травма печени (ALI) играет решающую роль в развитии печеночной недостаточности, которая характеризуется тяжелой дисфункцией печени, включая осложнения, такие как печеночная энцефалопатия и нарушение синтеза белка. Соответствующие модели животных имеют жизненно важное значение для проверки механизма и патофизиологии АЛИ и исследовать различные стратегии гепатозащиты. Благодаря своей способности выполнять химические преобразования, тетрахлорид углерода (CCl4) широко используется в печени, чтобы вызвать АЛИ путем формирования реактивных видов кислорода. Воздействие CCl4 может быть выполнено внутрипереперитонеально, путем вдыхания, или через назогастрическую или орогастрическую трубку. Здесь мы описываем модель грызунов, в которой ALI индуцируется воздействием CCl4 через огазовачную трубку. Этот метод является недорогим, легко выполняется, и имеет минимальный риск опасности. Модель высоко воспроизводима и может быть широко использована для определения эффективности потенциальных стратегий гепатопротекторирования и оценки маркеров повреждения печени.
Introduction
Растет частота токсичных оскорблений в печени, особенно из-за злоупотребления алкоголем и наркотиками. Острая травма печени (ALI) связана с высоким и сбольшим уровнем смертности и вызвала клинические проблемы1,,2. Токсические травмы приводит к смерти сигнализации пути в печени, в результате чего гепатоцита апоптоза, некроз, или пироптоз. ALI играет решающую роль в развитии печеночной недостаточности, которая характеризуется тяжелой дисфункцией печени, включая осложнения, такие как печеночная энцефалопатия и нарушение синтеза белка3,4. Хотя последние исследования расширили наши знания о физиологических и патологических изменениях, сопровождающих печеночную недостаточность, он не полностью объяснил патомолекулярные особенности, которые влияют на механизмы гибели клеток. Кроме того, в настоящее время нет лекарств, чтобы обратить вспять прогрессирующее ухудшение у пациентов ALI. В настоящее время единственным значительно эффективным методом лечения является трансплантация печени5,,6.
Для того, чтобы исследовать механизм и патофизиологии АЛИ и проверить различные стратегии гепатозащиты, различные модели животных используются для индуцирования АЛИ. Предпочтительная модель животных АЛИ должна имитировать патологический процесс заболевания с помощью надежного, проверенного, недорогого и простого в применении метода. Примеры экспериментальных моделей включают гепатотоксические агенты, хирургические процедуры, такие как полная или частичная гепатэктомия, полная или преходящая деваскуляризация, а также инфекционные процедуры7,,8,9. Известные гепатотоксические вещества включают галактозамин, ацетаминофен, тиоацетамид, азоксиметан и CCl4. Из них, CCl4 широко используется, хотя он еще не был хорошо характеризуется10,11,12,13.
CCl4 является органическим бесцветным жидким соединением со сладким запахом и почти без воспламеняемости при более низких температурах. Воздействие высоких концентраций CCl4 может привести к повреждению центральной нервной системы, в том числе ухудшение печени и почек. CCl4 индуцирует ALI через его биотрансформацию в печени, которая образует реактивные виды кислорода. Это происходит через P450 цитохромный фермент 2E1, образуя активный метаболит и в результате повреждения клеток при связывании макромолекулы, повышение перекисного окисления липидов и нарушение внутриклеточного гомеостаза кальция14. Кроме того, модель CCl4 может быть использована для стимуляции астроцитов на уровне синтеза РНК15. Этот гепатотоксин был введен интраперитонеальных, интрапортальных, устных и интрагастральных маршрутов16.
В этом протоколе мы подробно4описываем CCl 4-индуцированных ALI у крыс через огазовачную трубку. Этот метод индуцирует надежный и воспроизводимый АЛИ, который может быть использован для исследования патогенеза АЛИ. Определение тяжести заболевания печени контролируется путем измерения сывороточного глутамата-пирувате трансаминазы (GPT), глутамичных ферментов оксалоацетической трансаминазы (GOT) и общего билирубина (ТБ), а также окончательного гистологического диагноза гематоксилином и эозином (H и E) окрашенных тканей печени. Воздействие CCl4 через внутрижелудочный доступ позволяет практичный, недорогой, минимально инвазивный метод с минимальным риском опасности.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Эксперименты проводились в соответствии с рекомендациями Хельсинкских и Токиоских деклараций и Руководящими принципами по использованию экспериментальных животных Европейского сообщества. Эксперименты были одобрены Комитетом по уходу за животными Университета Бен-Гуриона в Негеве.
ПРИМЕЧАНИЕ: Модель CCl4 была создана и использована в предыдущем исследовании17. Хронология протокола показана в таблице 1.
1. Подготовка крыс к экспериментальной процедуре
ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите взрослых самцов крыс Sprague Dawley весом 300–350 г.
- Получить одобрение на проведение экспериментов от Институционального комитета по уходу за животными и использованию (IACUC).
- Поддерживайте крыс при комнатной температуре (22 градуса по Цельсию, 1 градус по Цельсию), с 12 ч светлыми и 12 ч темными циклами. Предоставьте крысиный чау и воду объявление libitum.
- Выполняйте все эксперименты с 6:00 до 12:00.
- Бритье крысы и дезинфицировать кожу с алкоголем.
2. Определение базовых уровней сыворотки, GPT и ТБ
- Анестезии
- Подготовьте непрерывную систему администрирования изофруран для индуцирования анестезии. Убедитесь, что система испарителей заполнена изофрураном.
- Анестезируйтесь крысы с 2% изолюран. Подтвердите, что крыса полностью обезображен, наблюдая за движением и педали рефлекс в ответ на внешние раздражители.
ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте изолюран и анестезию для индукции и обслуживания анестезии.
- Канналист кабеля вены с 22 G катетер.
- Соберите 0,5 мл крови на базовом уровне. Убедитесь, что извлеченный объем крови не превышает руководящие принципы IACUC.
- Выполните биохимический анализ крови, включая измерения сыворотки GOT, GPT и ТБ, как ранее описано18.
ПРИМЕЧАНИЕ: Обследование ферментов печени и уровня туберкулеза проводилось в биохимической лаборатории Медицинского центра Сорока. Образцы крови были проанализированы с помощью метода флуоресценции на химии анализатор (Таблица материалов).
3. Индукция острой травмы печени у крыс
ВНИМАНИЕ: Воздействие высоких концентраций CCl4, включая поглощение через пар или кожу, может иметь негативные последствия для центральной нервной системы и вызвать дегенерацию печени и почек. Длительное воздействие может привести к коме или смерти.
- Подготовьте 50% раствор CCl4 (Таблица материалов), смешивая CCl4 с оливковым маслом в качестве транспортного средства в соотношении 1:1.
ПРИМЕЧАНИЕ: Решение должно быть подготовлено в соответствии с руководящими принципами IACUC для нефармацевтических соединений класса. - Индуцировать гепатотоксичность in vivo администрацией CCl4 через огазовачную трубку.
- Вставьте 16 G орогастрической трубки (3 дюйма глубиной) через полость рта крысы.
- Выставляют крысу в различные дозы CCl4 путем введения шприца с одним из следующих разбавленных растворов в желудок крысы: 1 мл/кг (мягкий ALI), 2,5 мл/кг (умеренный ALI), или 5 мл/кг (тяжелый ALI) 50% раствора. Для фиктивной контрольной группы, подвергать крысы 5 мл/кг оливкового масла только.
4. Определение уровня сыворотки GOT, GPT и ТБ после 24 ч
- Анестезии
- Подготовьте непрерывную систему администрирования изофруран для индуцирования анестезии. Убедитесь, что система испарителей заполнена изофрураном.
- Анестезия крыс с 2% изолюран. Подтвердите, что крыса полностью обезображен, наблюдая за движением и педали рефлекс в ответ на внешние раздражители.
- Соберите образцы крови при 24 ч от воздействия CCl4.
- Выполняйте биохимический анализ крови, включая измерения сыворотки GOT, GPT и Tb.
5. Сбор печени для гистологического обследования
- Эвтаназия крысы, заменив вдохновил и газовой смеси с 20% O2/80% CO2. Убедитесь, что CO2 поставляется по заранее определенной ставке в соответствии с руководящими принципами IACUC.
- Обеспечить смерть, проверяя на отсутствие сердцебиения и подтвердить вторичным методом в соответствии с руководящими принципами IACUC.
- Поместите крысу на рассекающую доску с ее царской поверхностью вниз и животом вверх. Бритье живота крысы.
- Скальпелем, резни по всей длине кожи вентиляции от ануса до подбородка. Разделите кожу. Разрезайте брюшную стенку скальпелем из ануса в клифоидный хрящ, обнажая внутренности брюшной полости.
- Используя ножницы и щипцы, изолировать печень, рассекая ее от связок и вложений. Начиная с печени hilum, тщательно выполнять гепатэктомии, выпустив все доли печени от вложений. Вскрыть и отрезать все связки и кровеносные сосуды.
- Перенесите печень в чашку Петри. Исправить печень в 4% буферизированный раствор формальдегида (Таблица материалов) по крайней мере 24 ч.
6. Гистологическое обследование
- Подготовка образцов
- После фиксации, разрезать образец на 5 мкм толщиной срез серии микротома секции.
- Аккуратно поместите ломтики на стеклянные горки с мягкой кистью, 1 ломтик на слайд.
- Выполните Н И E окрашивания, как ранее описано19.
- Изучите ломтики под микроскопом при 200-x увеличении с помощью объектива 20 мм объективного объектива(Таблица материалов).
ПРИМЕЧАНИЕ: Секции печени должны быть оценены специализированным патологоанатомом, ослепленным протоколом лечения. Оценка 0 указывает на отсутствие аномалий печени, 1-2 указывает на легкую травму печени, 3-4 указывает на умеренную травму печени, и 5-6 указывает на серьезную травму печени20,21,22.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Уровень ТБ, GOT и GPT значительно увеличился на 24 ч после индуцирования ALI (больше при более высоких дозах CCl4) по сравнению с фиктивными элементами управления (p qlt; 0.001)(рисунок 1). Уровни ТБ, ГОТ и ГПТ на базовом уровне были нормальными и не сильно отличались от фиктивных мер контроля. В 24 ч, все три интервенционные группы, 1 мл/кг CCl4 (1, 1,2), 2,5 мл/кг CCl4 (3, 3,4) и 5 мл/кг CCl4 (4, 4-5,75), имели значительно более высокий гистологический балл классификации, чем фиктивная контрольная группа (0, 0-0) (p qlt; 0.05, представленные в диапазоне 25). Н И Е изображения фиктивных управления(Рисунок 2A) и групп, подверженных различным cCl4 дозы (Рисунок 2БЗд) показывают гистопатологические изменения 24 ч после воздействия CCl4. Нарушение гепатоцеллетионного архитектуры CCl4 было продемонстрировано высоким классом повреждения тканей с большой волокнистой деформацией септы, расширением волокон, накоплением коллагена и псевдоразделением доли в секциях печени(рисунок 2).
Рисунок 1: Сыворотка ТБ (A), GOT (B) и GPT (C) уровни в образцах крови 24 ч после воздействия различных доз CCl4 по сравнению с фиктивным контролем. Синий бар: контроль; красный бар: 24 ч после воздействия CCl4. Значение сравнений между CCl 4-экспонированных крыс и неэкспонированных крыс определяются с помощью теста Манн-Уитни.4 Значительное значение р-значение составило 0,05 чел. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
Рисунок 2: Гистопатологические изменения в ткани печени, окрашенные Н И Е после 24 ч CCl4 интоксикации в различных дозах. (A)шам-управляемый контроль, (B) 1 мл/кг CCl4, (C) 2.5 mL/kg CCl4,и(D) 5 мл/кг CCl4. Шкала бар 50 мкм. Распределение гистологических исходов было предсказано линейной регрессией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.
| Группы | 0 часов | 24 часа |
| Шам (15 крыс) | GOT, GPT, базовый уровень ТБ | GOT, GPT, уровень Туберкулеза |
| Мягкий АЛИ (15 крыс) | ||
| Умеренный АЛИ (15 крыс) | Выдержка CCl4 для групп ALI и оливкового масла для фиктивной группы | Гистологическая экспертиза |
| Тяжелые АЛИ (18 крыс) |
Таблица 1: Демонстрация временной шкалы протокола. Различные группы крыс в разное время включают в себя фиктивные контрольной группы, мягкий ALI (воздействие на 1 мл/кг CCl4),умеренный ALI (воздействие на 2,5 мл/кг CCl4),и тяжелые ALI (воздействие на 5 мл/кг CCl4). В то время были измерены уровни сыворотки, ГТ, ГПТ и ТБ, а для всех четырех групп было проведено гистологическое обследование.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе, CCl4 используется в качестве токсина печени, чтобы вызвать АЛИ у крыс. АЛИ характеризуется потерей печеночной паранхимы и последующей дисрегуляцией метаболических и синтетических функций печени. Наркотики, вирусы, токсины, аутоиммунные заболевания, метаболические заболевания и сосудистые расстройства вызывают смерть гепатоцитов, а последующая воспалительная реакция способствует патогенеза АЛИ.
Первоначальное оскорбление печени приводит к выработке цитокинов, высвобождению хемокина и последующему проникновению воспалительных клеток в печень. Три из часто тестируемых биомаркеров для оценки ALI являются уровнями GPT, GOT и ТБ. GPT и GOT являются ферментами, измеренными уровнем активности, в то время как уровень туберкулеза измеряет функцию печени по концентрации сыворотки. При повышенном уровне активности ферментов сыворотки обозначают травму гепатоцитов или холангиоцитов23. Быстрый спектрофотометрический метод был впервые зарегистрирован в работе Артура Кармена в 195524, что позволило широкое клиническое применение измерения фермента сыворотки. С тех пор для выявления повреждений гепатоцитов также применяются измерения GOT и GPT. GPT используется чаще, и одновременное тестирование GPT обычно показывает избыточные результаты. Увеличение уровня активности GOT и GPT между коэффициентами высвобождения и расчисткой от поврежденных клеток может быть использовано для измерения примерно скорости повреждения клеток. Когда поврежденные клетки печени вызывают печень на провал в своей нормальной деятельности, такие как обработка и удаление билирубина, как желчь, это указывает на то, что АЛИ является более серьезным.
В протоколе есть несколько шагов, которые имеют решающее значение и заслуживают тщательного рассмотрения. Большинство протоколов требуют тестирования биомаркеров сыворотки до и после контакта с следственным агентом, так как уровни концентрации ферментов сыворотки являются обычным явлением. Однако из-за колебаний сроков повышенной АЛТ периодически проводится несколько испытаний для обнаружения любой высоты. В этом протоколе мы решили проверить уровни GOT, GPT и ТБ на базовом уровне и 24 ч после контакта с токсином. Согласно последним исследованиям, уровни этих биомаркеров хорошо коррелировали с тяжестью АЛИ в течение этого интервалавремени 17. Как показано на рисунке 1, уровни крови GOT, GPT и ТБ были повышены во всех образцах 24 ч после индуцирования АЛИ. Это указывает на то, что модель количественно результаты в очень короткий промежуток времени с момента воздействия CCl4. Следует учитывать, что в тяжелых АЛИ печень теряет способность синтезировать GOT и GPT. Поэтому в этих случаях эти ферменты могут не иметь прогностического значения, как показано в литературе.
Гистологические находки крыс, подвергшихся воздействию CCl4, характеризуются раздуванием клеток, центролюбоулярным некрозом и наличием органов советника25. В этой модели был широко евразийный ущерб, который, как было показано, пропорциональен дозе CCl4, вводимой.
Этот метод индуцирования ALI с помощью орогастрического воздействия CCl4 имеет многочисленные преимущества. Это просто, недорого, и с минимальным риском опасности. Протокол дает значительные результаты в очень короткий промежуток времени. Модель высоко воспроизводима и может быть широко использована для определения эффективности потенциальных стратегий гепатопротекторирования и оценки маркеров повреждения печени.
Важно отметить, что CCl4 в основном влияет на центральную зону печени, которая не соответствует массивного некроза обычно видели в человеческой печеночной недостаточности. Кроме того, CCl4 не полностью метаболизируется в печени, и некоторые из неметаболизированных CCl4 может повредить другие органы, в том числе легких и почек16. Кроме того, из-за различных уровней развития цитохрома P450 и эффективности, существует большое изменение чувствительности в зависимости от вида и возраста26. Несмотря на эти ограничения, метод орогастрического CCl 4-индуцированного ALI по-прежнему служит ценной моделью грызунов.4
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы с благодарностью признают Берта Дельгадо, кафедру патологии, медицинский центр Сорока, факультет медицинских наук, Университет Бен-Гуриона в Негеве, за ее помощь в лаборатории, а также в гистологическом анализе.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 G catheter BD Neoflon TM | Becton Dickinson Infusion Therapy AB | ||
| 4% buffered formaldehyde solution | Sigma - Aldrich lab materials technologies | ||
| BD Microtainer SST TM Tubes | Becton Dickinson and Company | ||
| Carbone tetrachloride | Sigma - Aldrich lab materials technologies | CAS 56-23-5 | |
| Isofluran, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | ||
| Olympus AU2700 Chemistry-Immuno Analyzer | Olympus (MN, USA) | Analysis of blood samples was done by the fluorescence method | |
| Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
| RAT Feeding Needles | ORCHID SCIENTIFICS | ||
| SYRINGE SET 1 and 2 ml MEDI -PLUS | Shandong Zibo Shanchuan Medical Instruments Co., Ltd |
References
- Hoofnagle, J. H., Carithers, R. L., Shapiro, C., Ascher, N. Fulminant hepatic failure: Summary of a workshop. Hepatology. 21 (1), 240-252 (1995).
- Rakela, J., Lange, S. M., Ludwig, J., Baldus, W. P. Fulminant hepatitis: Mayo clinic experience with 34 cases. Mayo Clinic Proceedings. 60 (5), 289-292 (1985).
- Riordan, S. M., Williams, R. Treatment of hepatic encephalopathy. New England Journal of Medicine. 337, 473-479 (1997).
- Bernuau, J., Rueff, B., Benhamou, J. Fulminant and subfulminant liver failure: Definitions and causes. Seminars in Liver Disease. 6 (2), 97-106 (1986).
- Lidofsky, S. D. Liver transplantation for fulminant hepatic failure. Gastroenterology Clinics of North America. 22 (2), 257-269 (1993).
- Auzinger, G., Wendon, J. Intensive care management of acute liver failure. Current opinion in critical care. 14 (2), 179-188 (2008).
- Wu, Q., et al. Protection of regenerating liver after partial hepatectomy from carbon tetrachloride hepatotoxicity in rats: Roles of mitochondrial uncoupling protein 2 and ATP stores. Digestive Diseases and Sciences. 54 (9), 1918-1925 (2009).
- Tuñón, M. J., Alvarez, M., Culebras, J. M., González-Gallego, J. An overview of animal models for investigating the pathogenesis and therapeutic strategies in acute hepatic failure. World Journal of Gastroenterologyl. 15 (25), 3086-3098 (2009).
- van de Kerkhove, M. P., Hoekstra, R., van Gulik, T. M., Chamuleau, R. A. Large animal models of fulminant hepatic failure in artificial and bioartificial liver support research. Biomaterials. 25 (9), 1613-1625 (2004).
- Butterworth, R. F., et al. Experimental models of hepatic encephalopathy: ISHEN guidelines. Liver International. 29 (6), 783-788 (2009).
- Zhang, B., Gong, D., Mei, M. Protection of regenerating liver after partial hepatectomy from carbon tetrachloride hepatotoxicity in rats: Role of hepatic stimulator substance. Journal of Gastroenterology and Hepatology. 14 (10), 1010-1017 (1999).
- Ugazio, G., Danni, O., Milillo, P., Burdino, E., Congiu, A. M. Mechanism of protection against carbon tetrachloride toxicity. I. prevention of lethal effects by partial surgical hepatectomy. Drug and Chemical Toxicology. 5 (2), 115-124 (1982).
- Taniguchi, M., Takeuchi, T., Nakatsuka, R., Watanabe, T., Sato, K. Molecular process in acute liver injury and regeneration induced by carbon tetrachloride. Life Science. 75 (13), 1539-1549 (2004).
- Gordis, E. Lipid metabolites of carbon tetrachloride. Journal of Clinical Investigation. 48 (1), 203-209 (1969).
- Albrecht, J. Cerebral RNA synthesis in experimental hepatogenic encephalopathy. Journal of Neuroscience Research. 6 (4), 553-558 (1981).
- Terblanche, J., Hickman, R. Animal models of fulminant hepatic failure. Digestive Diseases and Sciences. 36 (6), 770-774 (1991).
- Gruenbaum, B. F., et al. Cell-free DNA as a potential marker to predict carbon tetrachloride-induced acute liver injury in rats. Hepatology International. 7 (2), 721-727 (2013).
- Juricek, J., et al. Analytical evaluation of the clinical chemistry analyzer Olympus AU2700 plus. Biochemia Medica. 20 (3), 334-340 (2010).
- Feldman, A. T., Wolfe, D. Tissue processing and hematoxylin and eosin staining. Methods in Molecular Biology. 1180, 31-43 (2014).
- Wang, T., et al. Protective effects of dehydrocavidine on carbon tetrachloride-induced acute hepatotoxicity in rats. Journal of Ethnopharmacology. 117 (2), 300-308 (2008).
- Ye, X., et al. Hepatoprotective effects of coptidis rhizoma aqueous extract on carbon tetrachloride-induced acute liver hepatotoxicity in rats. Journal of Ethnopharmacology. 124 (1), 130-136 (2009).
- Wills, P. J., Asha, V. V. Protective effect of lygodium flexuosum (L.) sw. extract against carbon tetrachloride-induced acute liver injury in rats. Journal of Ethnopharmacology. 108 (3), 320-326 (2006).
- Senior, J. R. Monitoring for hepatotoxicity: What is the predictive value of liver "function" tests. Clinical Pharmacology & Therapeutics. 85 (3), 331-334 (2009).
- Karmen, A. A note on the spectrometric assay of glutamic-oxalacetic transaminase in human blood serum. Journal of Clinical Investigation. 34 (1), 131-133 (1955).
- Hubner, G. Ultrastructural liver damage caused by direct action of carbon tetrachloride in vivo and in vitro. Virchows Archiv fur Pathologische Anatomie und Physiologie und fur Klinische Medizin. 339 (3), 187-197 (1965).
- Newsome, P. N., Plevris, J. N., Nelson, L. J., Hayes, P. C. Animal models of fulminant hepatic failure: A critical evaluation. Liver Transplantation. 6 (1), 21-31 (2000).
