Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine gängige und praktikable Methode zur Induktion akuter Leberverletzungen (ALI) über cCl4 Exposition durch eine orogastrische Röhre. CCl4 Exposition induziert ALI durch die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies während seiner Biotransformation in der Leber. Diese Methode wird verwendet, um die Pathophysiologie von ALI zu analysieren und verschiedene hepatoprotektive Strategien zu untersuchen.
Abstract
Akute Leberverletzung (ALI) spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von Leberversagen, die durch schwere Leberfunktionsstörungen einschließlich Komplikationen wie Leberenzephalopathie und beeinträchtigte Proteinsynthese gekennzeichnet ist. Geeignete Tiermodelle sind entscheidend, um den Mechanismus und die Pathophysiologie von ALI zu testen und verschiedene hepatoprotektive Strategien zu untersuchen. Aufgrund seiner Fähigkeit, chemische Transformationen durchzuführen, ist Tetrachlorkohlenstoff (CCl4) weit verbreitet in der Leber verwendet, um ALI durch die Bildung von reaktiven Sauerstoffspezies zu induzieren. CCl4 Exposition kann intraperitoneal, durch Inhalation oder durch eine nasogastrische oder orogastrische Röhre durchgeführt werden. Hier beschreiben wir ein Nagetiermodell, bei dem ALI durch CCl4-Exposition durch eine orogastrische Röhre induziert wird. Diese Methode ist kostengünstig, leicht durchzuführen und weist ein minimales Gefahrenrisiko auf. Das Modell ist sehr reproduzierbar und kann weit verbreitet verwendet werden, um die Wirksamkeit potenzieller hepatoprotektive Strategien zu bestimmen und Marker von Leberschäden zu bewerten.
Introduction
Die Häufigkeit toxischer Beleidigungen der Leber, insbesondere aufgrund von Alkohol- und Drogenmissbrauch, nimmt zu. Akute Leberschäden (ALI) sind mit hohen Sterblichkeitsraten verbunden und haben klinische Bedenken verursacht1,2. Toxische Verletzungen führen zu Todessignalbahnen in der Leber, was zu Hepatozytenapoptose, Nekrose oder Pyroptose führt. ALI spielt eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von Leberversagen, die durch schwere Leberfunktionsstörungen einschließlich Komplikationen wie Leberenzephalopathie und beeinträchtigte Proteinsynthese gekennzeichnet ist3,4. Obwohl die jüngsten Forschungen unser Wissen über die physiologischen und pathologischen Veränderungen, die leberversagen begleiten, erweitert haben, hat sie die pathomolekularen Merkmale, die die Mechanismen des Zelltodes beeinflussen, nicht vollständig erklärt. Darüber hinaus sind derzeit keine Medikamente verfügbar, um die fortschreitende Verschlechterung bei ALI-Patienten umzukehren. Derzeit ist die einzige signifikant wirksame Behandlung Lebertransplantation5,6.
Um den Mechanismus und die Pathophysiologie von ALI zu untersuchen und verschiedene hepatoprotektive Strategien zu testen, werden verschiedene Tiermodelle verwendet, um ALI zu induzieren. Ein bevorzugtes Tiermodell von ALI sollte den pathologischen Prozess der Krankheit über eine zuverlässige, validierte, kostengünstige und einfach anzuwendende Methode nachahmen. Beispiele für experimentelle Modelle sind hepatotoxische Wirkstoffe, chirurgische Eingriffe wie die vollständige oder partielle Hepatektomie, eine vollständige oder vorübergehende Dekonvaskularisation und infektiöse Verfahren7,8,9. Bekannte hepatotoxische Substanzen sind Galactosamin, Acetaminophen, Thioacetamimid, Azoxymethan und CCl4. Davon ist CCl4 weit verbreitet, obwohl es noch nicht gut charakterisiert ist10,11,12,13.
CCl4 ist eine organische farblose flüssige Verbindung mit einem süßen Geruch und fast keine Entflammbarkeit bei niedrigeren Temperaturen. Die Exposition gegenüber hohen Konzentrationen von CCl4 kann Schäden am zentralen Nervensystem verursachen, einschließlich einer Verschlechterung der Leber und der Nieren. CCl4 induziert ALI durch seine Biotransformation in der Leber, die reaktive Sauerstoffspezies bildet. Dies geschieht über das P450-Zytochrom-Enzym 2E1, das einen aktiven Metaboliten bildet und zu einer Zellschädigung durch Makromolekülbindung, Verbesserung der Lipidperoxidation und Störung der intrazellulären Calciumhomöostase14führt. Darüber hinaus kann das CCl4-Modell verwendet werden, um die Astrozyten auf der Ebene der RNA-Synthese15zu stimulieren. Dieses Hepatotoxin wurde von den intraperitonealen, intraportalen, oralen und intragastrischen Routen16verabreicht.
In diesem Protokoll beschreiben wir detailliert CCl4-induziertes ALI bei Ratten über eine orogastrische Röhre. Diese Methode induziert robusteund reproduzierbare ALI, die verwendet werden kann, um die Pathogenese von ALI zu untersuchen. Die Bestimmung der Schwere der Lebererkrankung wird durch Messung von Serumglutamat-Pyruvat-Transaminase (GPT), Glutamic Oxaloestik-Transaminase (GOT)-Enzymen und Bilirubin (TB) sowie der definitiven histologischen Diagnose durch Hämatoxylin und Eosin (H&E) gefärbten Lebergeweben überwacht. Die Exposition gegenüber CCl4 durch einen intragastrischen Zugang ermöglicht eine praktische, kostengünstige, minimalinvasive Methode mit minimalem Risikorisiko.
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Protocol
Die Versuche wurden gemäß den Empfehlungen der Erklärungen von Helsinki und Tokio und den Leitlinien für die Verwendung von Versuchstieren der Europäischen Gemeinschaft durchgeführt. Die Experimente wurden vom Animal Care Committee der Ben-Gurion University of the Negev genehmigt.
HINWEIS: Das CCl4-Modell wurde in einer früheren Studie17generiert und verwendet. Die Protokollzeitachse ist in Tabelle 1dargestellt.
1. Vorbereitung von Ratten auf das Experimentelle Verfahren
HINWEIS: Wählen Sie erwachsene männliche Sprague Dawley Ratten mit einem Gewicht von 300 bis 350 g.
- Zulassung für Experimente vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC).
- Halten Sie Ratten bei Raumtemperatur (22 °C bei 1 °C), mit 12 h Licht und 12 h dunklen Zyklen. Geben Sie Ratte Chow und Wasser ad libitum.
- Führen Sie alle Experimente zwischen 6:00 Uhr und 12:00 Uhr durch.
- Rasieren Sie die Ratte und desinfizieren Sie die Haut mit Alkohol.
2. Bestimmung der Serum-GOT-, GPT- und TB-Basiswerte
- Anästhesie
- Bereiten Sie ein kontinuierliches Isofluran-Verabreichungssystem vor, um Anästhesie zu induzieren. Stellen Sie sicher, dass das Verdampfersystem mit Isofluran gefüllt ist.
- Anästhesisieren Sie die Ratte mit 2% Isofluran. Bestätigen Sie, dass die Ratte vollständig betäuisiert wird, indem Sie die Bewegung und den Pedalreflex als Reaktion auf äußere Reize beobachten.
HINWEIS: Verwenden Sie 1-5% Isofluran zur Anästhesieinduktion und Wartung.
- Die Schwanzvene mit einem 22 G Katheter ankündigen.
- Sammeln Sie eine 0,5 ml Blutprobe zu Beginn. Stellen Sie sicher, dass das entnommene Blutvolumen die IACUC-Richtlinien nicht überschreitet.
- Führen Sie eine biochemische Analyse im Blut durch, einschließlich der Messungen von Serum GOT, GPT und TB, wie zuvor beschrieben18.
HINWEIS: Untersuchungen von Leberenzymen und TB-Spiegel wurden im biochemischen Labor des Soroka Medical Center durchgeführt. Blutproben wurden mit hilfe einer Fluoreszenzmethode an einem Chemieanalysator (Tabelle der Materialien) analysiert.
3. Induktion akuter Leberschäden bei Ratten
VORSICHT: Die Exposition gegenüber hohen Konzentrationen von CCl4, einschließlich Absorption durch Dampf oder Haut, kann negative Auswirkungen auf das zentrale Nervensystem haben und zu einer Degeneration der Leber und der Nieren führen. Längere Exposition kann Koma oder Tod verursachen.
- Bereiten Sie eine 50%-Lösung von CCl4 (Materialtabelle) vor, indem Sie CCl4 mit Olivenöl als Fahrzeug im Verhältnis 1:1 mischen.
HINWEIS: Die Lösung sollte gemäß den IACUC-Richtlinien für nichtpharmazeutische Verbindungen hergestellt werden. - Induzieren Hepatotoxizität in vivo durch CCl4 Verabreichung über eine orogastrische Röhre.
- Legen Sie ein 16 G orogastrisches Rohr (3 Zoll tief) durch die Mundhöhle der Ratte.
- Setzen Sie die Ratte verschiedenen Dosen von CCl4 aus, indem Sie eine Spritze mit einer der folgenden verdünnten Lösungen in den Magen der Ratte injizieren: 1 ml/kg (mildes ALI), 2,5 ml/kg (moderates ALI) oder 5 ml/kg (schweres ALI) der 50%-Lösung. Für die scheinbetriebene Kontrollgruppe setzen Sie die Ratte nur 5 ml/kg Olivenöl aus.
4. Bestimmung der Serum-GOT-, GPT- und TB-Spiegel nach 24 h
- Anästhesie
- Bereiten Sie ein kontinuierliches Isofluran-Verabreichungssystem vor, um Anästhesie zu induzieren. Stellen Sie sicher, dass das Verdampfersystem mit Isofluran gefüllt ist.
- Anästhesisieren Sie die Ratten mit 2% Isofluran. Bestätigen Sie, dass die Ratte vollständig betäuisiert wird, indem Sie die Bewegung und den Pedalreflex als Reaktion auf äußere Reize beobachten.
- Sammeln Sie Blutproben bei 24 h von CCl4 Exposition.
- Führen Sie biochemische Analysen im Blut durch, einschließlich Messungen von Serum GOT, GPT und TB.
5. Lebersammlung zur histologischen Untersuchung
- Euthanisieren Sie die Ratte, indem Sie das inspirierte Gasgemisch durch 20% O2/80% CO2ersetzen. Stellen Sie sicher, dass CO2 gemäß den IACUC-Richtlinien zu einem vorgegebenen Preis geliefert wird.
- Sicherstellen des Todes durch Überprüfung auf Mangel an Herzschlag und Bestätigung durch eine sekundäre Methode in Übereinstimmung mit den IACUC-Richtlinien.
- Legen Sie die Ratte auf ein Sezierenbrett mit seiner dorsalen Oberfläche nach unten und Bauch nach oben. Rasieren Sie den Bauch der Ratte.
- Mit einem Skalpell die gesamte Länge der Ventrumhaut vom Anus bis zum Kinn zu prädienen. Trennen Sie die Haut. Incise die Bauchwand mit einem Skalpell aus dem Anus zum xyphoiden Knorpel, die Bauchviszera aussetzen.
- Mit Schere und Zange, isolieren Sie die Leber, indem Sie sie von seinen Bändern und Anhaftungen sezieren. Beginnend am Leber-Hilum, sorgfältig eine Hepatectomie durchführen, indem Sie alle Leberlappen aus Anhängen. Sezieren und schneiden Sie alle Bänder und Blutgefäße.
- Übertragen Sie die Leber in eine Petrischale. Fixieren Sie die Leber in einer 4% gepufferten Formaldehyd-Lösung (Materialtabelle) für mindestens 24 h.
6. Histologische Untersuchung
- Probenvorbereitung
- Nach der Fixierung die Probe durch Mikrotome-Schnitt in eine 5'm dicke Scheibenserie schneiden.
- Legen Sie die Scheiben vorsichtig auf Glasgweise mit einem weichen Pinsel, 1 Scheibe pro Folie.
- Führen Sie H&E-Färbung wie zuvor beschrieben19durch.
- Untersuchen Sie die Scheiben unter dem Mikroskop mit einer 200-fachen Vergrößerung mit einer 20 mm Objektivlinse (Materialtabelle).
HINWEIS: Die Leberabschnitte sollten von einem spezialisierten Pathologen abgestuft werden, der für das Behandlungsprotokoll geblendet ist. Ein Wert von 0 zeigt keine Leberanomalien an, 1–2 zeigt eine leichte Leberverletzung an, 3–4 für eine mittelschwere Leberverletzung und 5–6 für schwere Leberverletzungen20,,21,22.
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Representative Results
Der TB-, GOT- und GPT-Spiegel erhöhte sich signifikant um 24 h, nachdem ALI induziert wurde (mehr bei höheren CCl4 Dosen) im Vergleich zu scheinbetriebenen Kontrollen (p < 0,001) (Abbildung 1). Die Konzentrationen von TB, GOT und GPT zu Beginn waren normal und unterschieden sich nicht signifikant von Scheinkontrollen. Um 24 Uhr, alle drei interventionsförmigen Gruppen, 1 ml/kg CCl4 (1, 1x2), 2,5 ml/kg CCl4 (3, 3x4) und 5 ml/kg CCl4 (4,4-5,75), hatten einen deutlich höheren histologischen Einstufungswert als die scheinbetriebene Kontrollgruppe (0, 0-0) (p < 0,05, Als median dargestellte Daten, 25 bis 75 % Bereich). Die H&E-Bilder einer scheinbetriebenen Steuerung (Abbildung 2A) und Gruppen, die unterschiedlichen CCl4-Dosen ausgesetzt sind (Abbildung 2B-D) zeigen histopathologische Veränderungen 24 h nach CCl4 Exposition. Die Störung der hepatozellulären Architektur durch CCl4 wurde durch eine hohe Grad der Gewebeverletzung mit großer faseriger Septa-Verformung, Erweiterung der Fasern, Kollagenakkumulation und Pseudolappentrennung in Leberabschnitten nachgewiesen (Abbildung 2).
Abbildung 1: Serum-TB-(A), GOT (B) und GPT (C)-Spiegel in Blutproben 24 h nach Exposition gegenüber verschiedenen CCl4-Dosen im Vergleich zu scheinbetriebenen Kontrollen. Blaue Leiste: Steuerung; roter Balken: 24 h nach CCl4 Exposition. Die Bedeutung von Vergleichen4zwischen CCl 4-exponierten Ratten und nicht exponierten Ratten wird mit dem Mann-Whitney-Test bestimmt. Ein p-Wert von <0,05 wurde als signifikant angesehen. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
Abbildung 2: Histopathologische Veränderungen im Lebergewebe, die nach 24 h4 CCl 4-Intoxikation in verschiedenen Dosen mit H&E gefärbt sind. (A) Scheinsteuerung, (B) 1 mL/kg CCl4, (C) 2,5 ml/kg CCl4und (D) 5 mL/kg CCl4. Skalenbalken = 50 m. Die Verteilung der histologischen Ergebnisse wurde durch lineare Regression vorhergesagt. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.
| Gruppen | 0 Stunden | 24 Stunden |
| Schein (15 Ratten) | GOT, GPT, TB-Basiswert | GOT-, GPT-, TB-Niveau |
| Milde ALI (15 Ratten) | ||
| Moderate ALI (15 Ratten) | CCl4 Exposition für ALI-Gruppen und Olivenöl für Scheingruppe | Histologische Untersuchung |
| Schwere ALI (18 Ratten) |
Tabelle 1: Demonstration der Protokollzeitachse. Zu den verschiedenen Rattengruppen zu unterschiedlichen Zeiten gehören eine scheinbetriebene Kontrollgruppe, mildes ALI (Exposition bei 1 ml/kg CCl4), moderates ALI (Exposition bei 2,5 ml/kg CCl4) und schweres ALI (Exposition bei 5 ml/kg CCl4). Zur Zeit wurden 24 h, Serum GOT, GPT und TB Ebenen gemessen, und histologische Untersuchung wurde für alle vier Gruppen durchgeführt.
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Discussion
In diesem Protokoll, CCl4 wird als Lebergift verwendet, um ALI bei Ratten zu induzieren. ALI ist gekennzeichnet durch den Verlust von Leberparenchym und anschließende Dysregulation der metabolischen und synthetischen Funktionen der Leber. Medikamente, Viren, Toxine, Autoimmunerkrankungen, Stoffwechselerkrankungen und Gefäßerkrankungen induzieren den Lebertod, und die anschließende Entzündungsreaktion trägt zur Pathogenese von ALI bei.
Die anfängliche Beleidigung der Leber führt zur Zytokinproduktion, Chemokinfreisetzung und anschließender Infiltration von Entzündungszellen in die Leber. Drei der häufig getesteten Biomarker für die ALI-Bewertung sind GPT-, GOT- und TB-Spiegel. GPT und GOT sind Enzyme, die nach Aktivitätsniveau gemessen werden, während der TB-Spiegel die Leberfunktion nach Serumkonzentration misst. Wenn erhöhte, Serum-Enzym-Aktivitätsniveaus bezeichnen Verletzung von Hepatozyten oder Cholangiocyten23. Die schnelle spektrophotometrische Methode wurde erstmals 1955 in der Arbeit von Arthur Karmen berichtet24, was die weit verbreitete klinische Anwendung der Serumenzymmessung ermöglichte. Seitdem wurden auch GOT- und GPT-Messungen durchgeführt, um Hepatozytenverletzungen zu erkennen. GPT wird häufiger verwendet, und gleichzeitige GPT-Tests zeigen in der Regel redundante Ergebnisse. Der Anstieg der Aktivitätsniveaus von GOT und GPT zwischen den Freisetzungsraten und den Clearance-Raten von verletzten Zellen kann verwendet werden, um ungefähr die Verletzungsrate der Zellen zu messen. Wenn die verletzten Leberzellen dazu führen, dass die Leber in ihren normalen Aktivitäten versagt, wie die Verarbeitung und Entfernung von Bilirubin als Galle, deutet dies darauf hin, dass die ALI schwerer ist.
Es gibt mehrere Schritte im Protokoll, die kritisch sind und sorgfältig geprüft werden müssen. Die meisten Protokolle erfordern Serum-Biomarker-Tests vor und nach der Exposition gegenüber dem Untersuchungsstoff, da Erhöhungen der Serumenzymkonzentration üblich sind. Aufgrund von Schwankungen im Timing erhöhter ALT sollten jedoch in regelmäßigen Abständen mehrere Tests durchgeführt werden, um eine Erhöhung zu erkennen. In diesem Protokoll haben wir uns entschieden, got, GPT und TB-Spiegel an der Basislinie und 24 h nach der Exposition gegenüber dem Toxin zu testen. Jüngsten Studien zufolge korrelierten die Werte dieser Biomarker gut mit der Schwere von ALI während dieses Zeitintervalls17. Wie in Abbildung 1dargestellt, waren die Blutwerte GOT, GPT und TB in allen Proben um 24 h nach der Induktion von ALI erhöht. Dies deutet darauf hin, dass das Modell die Ergebnisse in einem sehr kurzen Zeitintervall seit der Exposition gegenüber CCl4quantifiziert hat. Man sollte berücksichtigen, dass bei schweren ALI die Leber verliert seine Fähigkeit, GOT und GPT zu synthetisieren. Daher können diese Enzyme in diesen Fällen ihren Vorhersagewert vermissen, wie in der Literatur gezeigt.
Histologische Befunde von Ratten, die CCl4 ausgesetzt sind, sind durch Ballonfahren von Zellen, zentribuläre Nekrose und das Vorhandensein von Ratsgremiengekennzeichnet 25. In diesem Modell gab es weit verbreitete Schäden, die nachweislich proportional zur verabreichten Dosis von CCl4 waren.
Diese Methode der Induktion von ALI über orogastrische CCl4 Exposition hat zahlreiche Vorteile. Es ist einfach, kostengünstig und mit minimalem Gefahrenrisiko. Das Protokoll liefert signifikante Ergebnisse in einem sehr kurzen Zeitintervall. Das Modell ist sehr reproduzierbar und kann häufig verwendet werden, um die Wirksamkeit potenzieller hepatoprotektive Strategien zu bestimmen und Marker von Leberschäden zu bewerten.
Es ist wichtig zu beachten, dass CCl4 hauptsächlich die zentrale Zone der Leber betrifft, die nicht mit der massiven Nekrose übereinstimmt, die typischerweise bei menschlichem Leberversagen auftritt. Darüber hinaus ist CCl4 nicht vollständig in der Leber metabolisiert, und einige der nichtmetabolisierten CCl4 können andere Organe schädigen, einschließlich Lunge und Nieren16. Darüber hinaus gibt es aufgrund der unterschiedlichen Konzentrationen von Cytochrom P450 Entwicklung und Wirksamkeit, gibt es eine große Variation in der Empfindlichkeit je nach Art und Alter26. Trotz dieser Einschränkungen dient die Methode des orogastrischen CCl4-induzierten ALI immer noch als wertvolles Nagetiermodell.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts zu verraten.
Acknowledgments
Die Autoren danken Bertha Delgado, Abteilung für Pathologie, Soroka Medical Center, Fakultät für Gesundheitswissenschaften, Ben-Gurion Universität des Negev, für ihre Hilfe im Labor sowie in der Histologie-Analyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 22 G catheter BD Neoflon TM | Becton Dickinson Infusion Therapy AB | ||
| 4% buffered formaldehyde solution | Sigma - Aldrich lab materials technologies | ||
| BD Microtainer SST TM Tubes | Becton Dickinson and Company | ||
| Carbone tetrachloride | Sigma - Aldrich lab materials technologies | CAS 56-23-5 | |
| Isofluran, USP 100% | Piramamal Critical Care, Inc | ||
| Olympus AU2700 Chemistry-Immuno Analyzer | Olympus (MN, USA) | Analysis of blood samples was done by the fluorescence method | |
| Olympus BX 40 microscope | Olympus | ||
| RAT Feeding Needles | ORCHID SCIENTIFICS | ||
| SYRINGE SET 1 and 2 ml MEDI -PLUS | Shandong Zibo Shanchuan Medical Instruments Co., Ltd |
References
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