Summary

ויזואליזציה של מקרופאג Lytic תא המוות במהלך זיהום פטרת העוברים באמצעות מיקרוסקופ אינטרטל

Published: January 09, 2019
doi:

Summary

פרוטוקול זה מתאר טכניקה להמחיש התנהגות מקרופאג ומוות העובריים מתחלקים במהלך הזיהום של מריחיידק של פטרת . צעדים להכנת חיידקים, זיהום העוברים, ומיקרוסקופ ה, כלולים. טכניקה זו עשויה להיות מיושמת על התבוננות של התנהגות תאית ומוות בתרחישים דומים הכרוכים זיהום או דלקת סטרילית.

Abstract

Zebrafish הוא אורגניזם מודל מעולה לחקר התנהגות התא החיסונית מולדת בשל טבעו שקוף הסתמכות אך ורק על מערכת החיסון שלה מולדת במהלך ההתפתחות המוקדמת. Zebrafish מריחיידק מארנום (מ. מרנום) מודל זיהום כבר הוקמה היטב ללמוד תגובה חיסונית מארחים נגד זיהום פטרת. יש כבר הציע כי שונים סוגי מוות מקרופאג cell יוביל לתוצאות מגוונות של זיהום בקטריאלי. כאן אנו מתארים פרוטוקול באמצעות מיקרוסקופ המקרופאג להתבונן במוות התאים בתוך עוברי דגים בעקבות זיהום מ. מרנום . Zebrafish הקווים הטרנסגניים במיוחד בתוויות מקרופאגים ו נויטרופילים נגועים באמצעות מיקרוהזרקה שרירית של fluorescently אופן שכותרתו M. marinum באמצע המוח או המטען. עוברים מזוהמים העוברי דגים הם רכוב לאחר מכן על התכה נמוכה ההיתוך ונצפתה על ידי המיקרוסקופיה בממדים X-Y-Z-T. מכיוון שהדמיה לטווח ארוך מחייבת שימוש בכוח לייזר נמוך כדי למנוע הלבנת ופוטורעילות, מומלץ לבטא מאוד את הביטוי. פרוטוקול זה מאפשר ויזואליזציה של התהליכים הדינאמיים ב vivo, כולל העברת תאים חיסוניים, אינטראקציה עם הפתוגן מארח, ומוות תאים.

Introduction

זיהום פטרת הוכח לגרום למוות תא החיסון מארח1. למשל, זן מחליש יהיה להפעיל אפופטוזיס במקרופאגים ולהכיל את הזיהום. עם זאת, זן המוני יהיה להפעיל את המוות התא lytic, גרימת הפצת חיידקים1,2. בהתחשב ההשפעה האלה סוגים שונים של מוות תאים יש על מארח התגובה נגד פטרת, התבוננות מפורטת של מקרופאג cell מוות במהלך זיהום פטרת ב vivo הוא צורך.

השיטות הקונבנציונליות למדידת מוות תאי הן להשתמש בכתמי תאים מתים, כגון V, tunel, או אקרידיין אורנג ‘/propidium יודידה כתמים3,4,5. עם זאת, שיטות אלה אינן מסוגלים לשפוך אור על התהליך הדינמי של מוות התאים בvivo. האבחנה של מוות תאים בתוך מבחנה כבר הונחה על ידי הדמיה חיה6. עם זאת, האם התוצאות מחקות במדויק את התנאים הפיסיולוגיים נותרים ברורים.

Zebrafish כבר מודל מצוין עבור לימוד מארח נגד פטרת תגובות. יש מערכת חיסונית שימור מאוד דומה לזה של בני אדם, הגנום מניפולציות בקלות, והעוברים המוקדמים הם שקופים, אשר מאפשר הדמיה חיה7,8,9. לאחר ההדבקה עם מ. מרנום, בוגרים מסוג זברפיש מבנים טיפוסיים של גרגירומת מבוגרים, ויוצריםבצורת מבנה שכגרגירומה מוקדםמבנים 9,10. התהליך הדינמי של האינטראקציה הטבועה תא החיסונית בקטריה כבר נחקרו בעבר במודל דג זברה M. מרנום מודל11,12. עם זאת, בשל הדרישה גבוהה מרחבית ברזולוציה הזמנית, הפרטים המקיפים את מותם של תאים חיסוניים מולדים להישאר במידה מוגדרת ברובו.

כאן אנו מתארים כיצד להמחיש את התהליך של מוות תא מקרופאג lytic המופעל על ידי זיהום פטרת בvivo. פרוטוקול זה עשוי להיות גם להחיל על התנהגות תאית הvivo במהלך פיתוח ודלקת.

Protocol

Zebrafish גדלו תחת תנאים סטנדרטיים בהתאם הנחיות בעלי חיים מעבדה לסקירה אתית של בעלי חיים רווחה (GB/T 35823-2018). כל ניסוי דג זברה במחקר זה אושרו (2019-A016-01) וניהל ב שנגחאי הציבור בריאות קלינית המרכז, אוניברסיטת fudan. 1. M. מרנום תא יחיד הכנה לרשת (איור 1) הפשרת Cerulean-פל?…

Representative Results

זיהום פטרת יכול להפעיל תגובות מארח שונים מבוסס על נתיבי זיהום. בפרוטוקול זה, עוברי דג דג זברה נגועים על ידי הזרקת מיקרותוך שרירית של חיידקים המסומנים fluorescently לתוך המוח האמצע או המטען (איור 3) ונצפתה על ידי הדמיה מוקד חי. זיהום באמצעות שני המסלולים הללו יהיה באופן מקומי להגבי?…

Discussion

פרוטוקול זה מתאר את ההדמיה של מוות מקרופאג במהלך זיהום פטרת. מבוסס על גורמים כגון שלמות קרום התא, זיהום מונחה תאים מוות יכול להיות מחולק אפופטוזיס ו-lytic מוות התא24,25. המוות התאי lytic הוא מלחיץ יותר עבור האורגניזם מאשר אפופטוזיס, כי זה מפעיל תגובה דלקתית חזקה <sup c…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

אנו מודים לד ר זילונג ון על שיתוף זנים הדגים, ד ר. סטפן Oehlers וד ר. דוד טובין על שיתוף M. marinum משאבים קשורים הקשורות, Yuepeng הוא לסיוע בהכנת הדמות. עבודה זו נתמכת על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (81801977) (B.Y.), תוכנית ההדרכה לנוער מצטיינים של הנציבות העירונית של שנגחאי (2018yq54) (B.Y.), תוכנית השייט של שנגחאי (18yf1420400) (B.Y.), והקרן הפתוחה של המעבדה מפתח שנגחאי של שחפת (2018

Materials

0.05% Tween-80 Sigma P1379
10 mL syringe Solarbio YA0552
10% OADC BD 211886
3-aminobenzoic acid Sigma E10521
5 μm filter Mille X SLSV025LS
50 μl/ml hygromycin Sangon Biotech A600230
7H10 BD 262710
7H9 BD 262310
A glass bottom 35 mm dish In Vitro Scientific D35-10-0-N
Agarose Sangon Biotech A60015
Confocal microscope Leica TCS SP5 II
Enviromental Chamber Pecon temp control 37-2 digital
Eppendorf microloader Eppendorf No.5242956003
Glass microscope slide Bioland Scientific LLC 7105P
Glycerol Sangon Biotech A100854
Incubator Keelrein PH-140(A)
M.marinum ATCC BAA-535
Microinjection needle World Precision Instruments IB100F-4
Microinjector Eppendorf Femtojet
Micromanipulator NARISHIGE MN-151
msp12:cerulean Ref.: PMID 25470057; 27760340
Phenol red Sigma P3532
PTU Sigma P7629
Single concavity glass microscope slide Sail Brand 7103
Sonicator SCICNTZ JY92-IIDN
Spectrophotometer (OD600) Eppendorf AG 22331 Hamburg
Stereo Microscope OLYMPUS SZX10
Tg(mfap4:eGFP) Ref.: PMID 30742890
Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) Ref.: PMID 31278008
Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) Ref.: PMID 27424497; 17477879

References

  1. Behar, S. M., Divangahi, M., Remold, H. G. Evasion of innate immunity by Mycobacterium tuberculosis: is death an exit strategy. Nature Reviews Microbiology. 8 (9), 668-674 (2010).
  2. Lamkanfi, M., Dixit, V. M. Manipulation of host cell death pathways during microbial infections. Cell Host Microbe. 8 (1), 44-54 (2010).
  3. Crowley, L. C., Marfell, B. J., Scott, A. P., Waterhouse, N. J. Quantitation of Apoptosis and Necrosis by Annexin V Binding, Propidium Iodide Uptake, and Flow Cytometry. Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (11), (2016).
  4. Crowley, L. C., Marfell, B. J., Waterhouse, N. J. Detection of DNA Fragmentation in Apoptotic Cells by TUNEL. Cold Spring Harbor Protocol. 2016 (10), (2016).
  5. Chan, L. L., McCulley, K. J., Kessel, S. L. Assessment of Cell Viability with Single-, Dual-, and Multi-Staining Methods Using Image Cytometry. Methods in Molecular Biology. 1601, 27-41 (2017).
  6. Rathkey, J. K., et al. Live-cell visualization of gasdermin D-driven pyroptotic cell death. Journal of Biological Chemistry. 292 (35), 14649-14658 (2017).
  7. Henry, K. M., Loynes, C. A., Whyte, M. K., Renshaw, S. A. Zebrafish as a model for the study of neutrophil biology. Journal of Leukocyte Biology. 94 (4), 633-642 (2013).
  8. Harvie, E. A., Huttenlocher, A. Neutrophils in host defense: new insights from zebrafish. Journal of Leukocyte Biology. 98 (4), 523-537 (2015).
  9. Lesley, R., Ramakrishnan, L. Insights into early mycobacterial pathogenesis from the zebrafish. Current Opinion Microbiology. 11 (3), 277-283 (2008).
  10. Tobin, D. M., Ramakrishnan, L. Comparative pathogenesis of Mycobacterium marinum and Mycobacterium tuberculosis. Cellular Microbiology. 10 (5), 1027-1039 (2008).
  11. Clay, H., et al. Dichotomous role of the macrophage in early Mycobacterium marinum infection of the zebrafish. Cell Host Microbe. 2 (1), 29-39 (2007).
  12. Davis, J. M., et al. Real-time visualization of mycobacterium-macrophage interactions leading to initiation of granuloma formation in zebrafish embryos. Immunity. 17 (6), 693-702 (2002).
  13. Benard, E. L., et al. Infection of zebrafish embryos with intracellular bacterial pathogens. Journal of Visualized Experiments. (61), e3781 (2012).
  14. Maglione, P. J., Xu, J., Chan, J. B. cells moderate inflammatory progression and enhance bacterial containment upon pulmonary challenge with Mycobacterium tuberculosis. Journal of Immunology. 178 (11), 7222-7234 (2007).
  15. Wang, Z., et al. Neutrophil plays critical role during Edwardsiella piscicida immersion infection in zebrafish larvae. Fish Shellfish Immunology. 87, 565-572 (2019).
  16. Wang, T., et al. Nlrc3-like is required for microglia maintenance in zebrafish. Journal of Genetics and Genomics. 46 (6), 291-299 (2019).
  17. Hall, C., Flores, M. V., Storm, T., Crosier, K., Crosier, P. The zebrafish lysozyme C promoter drives myeloid-specific expression in transgenic fish. BMC Developmental Biology. 7, 42 (2007).
  18. Xu, J., Wang, T., Wu, Y., Jin, W., Wen, Z. Microglia Colonization of Developing Zebrafish Midbrain Is Promoted by Apoptotic Neuron and Lysophosphatidylcholine. Developmental Cell. 38 (2), 214-222 (2016).
  19. Oehlers, S. H., et al. Interception of host angiogenic signalling limits mycobacterial growth. Nature. 517 (7536), 612-615 (2015).
  20. Kulms, D., Schwarz, T. Molecular mechanisms of UV-induced apoptosis. Photodermatology, Photoimmunology and Photomedicine. 16 (5), 195-201 (2000).
  21. van Ham, T. J., Mapes, J., Kokel, D., Peterson, R. T. Live imaging of apoptotic cells in zebrafish. FASEB Journal. 24 (11), 4336-4342 (2010).
  22. Zhang, Y., Chen, X., Gueydan, C., Han, J. Plasma membrane changes during programmed cell deaths. Cell Research. 28 (1), 9-21 (2018).
  23. Lu, Z., Zhang, C., Zhai, Z. Nucleoplasmin regulates chromatin condensation during apoptosis. Proceedings of the National Academy of Science U. S. A. 102 (8), 2778-2783 (2005).
  24. Ashida, H., et al. Cell death and infection: a double-edged sword for host and pathogen survival. Journal of Cell Biology. 195 (6), 931-942 (2011).
  25. Traven, A., Naderer, T. Microbial egress: a hitchhiker’s guide to freedom. PLoS Pathogens. 10 (7), 1004201 (2014).

Play Video

Cite This Article
Niu, L., Wang, C., Zhang, K., Kang, M., Liang, R., Zhang, X., Yan, B. Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (143), e60698, doi:10.3791/60698 (2019).

View Video