Summary
이 프로토콜은 마이코박테리움 마리눔 감염 동안 배아 제브라피시의 대식세포 행동 및 사망을 시각화하는 기술을 설명합니다. 박테리아의 준비, 배아감염 및 활력 내 현미경 검사법 에 대한 단계가 포함되어 있습니다. 이 기술은 감염 또는 멸균 염증을 관련시키는 유사한 시나리오에 있는 세포 행동 그리고 죽음의 관측에 적용될 수 있습니다.
Abstract
Zebrafish는 초기 개발 중에 선천적 면역 체계에 전적으로 의존하여 투명한 자연과 의존성으로 인해 선천적 면역 세포 행동을 연구하기위한 훌륭한 모델 유기체입니다. 제브라피쉬 마이코박테리움 마리눔(M. marinum)감염 모델은 진균 감염에 대한 숙주 면역 반응을 연구하는 데 잘 확립되어 있다. 다른 대식세포 사멸 유형이 진균 감염의 다양한 결과로 이어질 것이라는 것이 제안되었다. 여기에서 우리는 M. marinum 감염 다음 zebrafish 태아에 있는 대식세포 세포 죽음을 관찰하기 위하여 intravital 현미경 검사를 사용하여 프로토콜을 기술합니다. 특히 대식세포와 호중구에 라벨을 붙이는 Zebrafish 형질전환 선은 중뇌 또는 트렁크에 형광으로 표지된 M. marinum의 근육 내 미세 주입을 통해 감염됩니다. 감염된 제브라피시 배아는 이후에 낮은 용융 아가로오스에 장착되고 X-Y-Z-T 치수에서 공초점 현미경 검사법에 의해 관찰됩니다. 장기 라이브 이미징은 광표백 및 광독성을 피하기 위해 낮은 레이저 파워를 사용해야 하기 때문에 형질전환이 강력히 권장됩니다. 이 프로토콜은 면역 세포 이동, 숙주 병원체 상호 작용 및 세포 사멸을 포함하는 생체 내 동적 프로세스의 시각화를 용이하게 합니다.
Introduction
마이코박테리아 감염은 숙주 면역세포 사멸을 유발하는 것으로 입증되었다1. 예를 들면, 감쇠한 긴장은 대식세포에 있는 세포자멸을 시작하고 감염을 포함할 것입니다. 그러나, 악성 긴장은 세균성보급을일으키는 원인이 되는 lytic 세포 죽음을 시작할 것입니다1,2. 세포 죽음의 이 다른 모형이 호스트 항 진균 반응에 있는 충격을 고려하면, 생체 내에서 진균 감염 도중 대식세포 세포 죽음의 상세한 관측이 필요합니다.
세포 사멸을 측정하는 종래의 방법은 안네신 V, TUNEL, 또는 아크리딘 오렌지/프로피듐 요오드화물 염색3,4,5와같은 죽은 세포 얼룩을 사용하는 것이다. 그러나, 이러한 방법은 생체 내에서 세포 사멸의 동적 과정에 빛을 비출 수 없습니다. 시험관내 세포 사멸의 관찰은 이미 살아있는 화상 진찰6에의해 촉진되었습니다. 그러나, 결과 정확 하 게 생리 조건을 모방 여부 불분명 남아.
Zebrafish는 호스트 항 진균 반응을 연구하기위한 훌륭한 모델이었습니다. 그것은 인간과 유사한 높게 보존된 면역 계통을, 쉽게 조작한 게놈, 및 초기 태아는 살아있는 화상진찰7,8,9를허용하는 투명합니다. M. marinum에 감염 후, 성인 얼룩말 은 전형적인 성숙한 육아종 구조를 형성하고, 배아 제브라피쉬는 구조9,10과같은 초기 육아종을 형성한다. 선천성 면역세포-박테리아 상호작용의 역동적인 과정은 제브라피쉬 M. 마리눔 감염 모델11,12에서이전에 탐구되었다. 그러나, 높은 공간 시간적 해상도 요구 사항으로 인해, 타고난 면역 세포의 죽음을 둘러싼 세부 사항은 크게 정의되지 않은 남아있다.
여기에서 우리는 생체 내에서 진균 감염에 의해 유발된 대식세포 리선세포 사멸의 과정을 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 또한 발달 및 염증 동안 생체 내에서 세포 행동을 시각화에 적용될 수 있다.
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Protocol
제브라피쉬는 동물 복지에 대한 윤리적 검토를 위한 실험실 동물 가이드라인(GB/T 35823-2018)을 준수하여 표준 조건하에서 제기되었습니다. 본 연구에서 모든 제브라피시 실험은 승인(2019-A016-01)을 승인하고 푸단 대학교 상하이 공중 보건 임상 센터에서 실시했습니다.
1. M. 마리넘 단일 세포 접종 준비(그림 1)
- -80 °C에서 세룰리안 형광 M. 마리넘 글리세롤 주식을 해동하고 10 % (v / v) OADC, 0.25 % 글리세롤 및 50 μg / mL 히그로 마이신으로 7H10 한천 플레이트를 접종합니다. 약 10 일 동안 32 °C에서 플레이트를 배양합니다.
- 양성 형광을 발현하는 콜로니를 선택하고 10% OADC, 0.5% 글리세롤 및 50 μg/mL 의 히그로마이신을 가진 7H9 배지의 3 mL을 접종한다.
- 배양이 로그 단계 (OD600 = 0.6-1.0)에 도달 할 때까지 4-6 일 동안 32 °C 및 분당 100 회전수 (rpm)에서 접종을 배양합니다.
- 30 mL의 신선한 7H9 배지의 하위 배양 (1:100)은 10 % OADC, 0.5 % 글리세롤, 0.05 % 트웬-80, 및 OD600이 ~1.0에 도달 할 때까지 50 μg / mL.
참고: 최고의 배양 품질을 위해 이 시점에서 하위 문화 권 단계는 권장됩니다. 우리의 경험에서, 매체의 큰 양에 직접 클론을 추가하는 것은 세균성 덩어리의 대형으로 이끌어 낼 것입니다.
- 아래에 설명된 바와 같이 M. 마리넘 세포를 수집한다.
- 3,000 x g에서 10 분 동안 M. 마리넘을 펠릿으로 수집합니다. 상급제의 300 μL을 제외한 모든 것을 버리고 펠릿을 다시 일시 중단하는 데 사용하십시오.
- 펠릿을 더 재중단하기 위해 10% 글리세롤과 함께 7H9 배지 3mL를 추가한 다음, 15s ON에서 100W, 15초 OFF에서 15초의 수조에서 서스펜션을 총 2분 동안 초음파 처리합니다.
참고 : 초음파 처리의 목적은 미세 주사 바늘의 막힘을 방지 할 수있는 접종을위한 단일 세포 균질화를 달성하는 것입니다.
- 세균 현탁액을 10 mL 주사기로 옮은 다음 5 μm 필터를 통과하여 박테리아 덩어리를 제거합니다.
- 분광광도계를 사용하여 현탁액의 광학 밀도(OD)를 측정하고 10% 글리세롤을 함유하는 7H9 매체로 OD600 = 1.0으로 희석한다. 현탁액을 10 μL aliquots로 나누고 나중에 사용할 수 위해 -80°C 냉동고에 보관하십시오.
- OADC의 10% (v/v) , 글리세롤 0.5%, 그리고 50 μg/mL의 히그로마이신을 함유한 7H10 한천 플레이트상에서 세균 스톡의 직렬 희석 및 도금에 의한 접종(cfu/mL)의 세균 농도를 확인합니다.
2. 얼룩말 물고기 배아 준비
- 산란 하루 전, 사육 실에 제브라피시 사육 쌍을 설치합니다.
참고 : 각 번식 챔버에 한 쌍만 추가합니다. - 다음날 아침 1시간 후 수정(hpf) 이내에 배아를 수집합니다. 조심스럽게 증류수로 배아를 세척하고 E3 배지 30 mL을 포함하는 100mm 페트리 접시에 최대 100 개의 배아를 옮김을 옮김. 28.5 °C에서 배양합니다.
- 12 시간 후, 현미경으로 관찰하고 비 수정되거나 손상된 계란을 버립니다.
- 24 hpf에서, 안료의 발달을 방지하기 위해 N-페닐티우레아(PTU, 0.2 nM 최종 농도)로 배지를 신선한 E3 배지로 변화시다. 배아가 미세 주입을 위해 준비될 때까지 28.5 °C에서 배아를 배양하십시오.
3. 세균성 미세 주입을 통한 감염
- 참조13에기재된 바와 같이 보로실리케이트 유리 미세 모세혈관 주사 바늘을 준비한다.
- 감염을 위한 제브라피쉬 배아 장착
- 전자레인지 100 mL 1% (w/v) 및 0.5% (w/v) 낮은 용융 아가로즈는 아가로즈가 완전히 녹을 때까지 오토클레이브 E3 배지에 100 mL. 1 mL aliquot 튜브로 나누고 나중에 사용할 수 위해 4 °C에서 보관하십시오.
- 사용하기 전에 아가로즈를 완전히 녹일 때까지 95°C 가열 블록에서 가열합니다. 45°C 가열 블록에 배치하여 액체 형태로 아가로스를 유지합니다(그림2).
- 트렁크 부위의 근육 내 감염에 대한 장착
- 유리 슬라이드에 아가로즈를 1%(w/v)의 0.5 mL(w/v)를 골고루 부어 바닥 아가로즈 층을 만듭니다. 얼음 상자 나 차가운 표면에 3 분 동안 놓고 굳어지도록하십시오.
- 제브라피시 배아(48-72 hpf)를 트리카인(200 μg/mL)과 PTU로 달걀 물에 5분 간 마취시다. 최대 60개의 제브라피쉬 배아를 아가로즈 층 바닥에 놓고 두 줄로 조심스럽게 배치합니다(그림2B).
- 0.3 mL의 0.5% (w/v) 아가로즈를 추가하기 전에 티슈 페이퍼로 바닥 아가로즈 층에 남은 물을 제거하여 상층을 만듭니다. 배아가 아가로오스에 완전히 박혀 있는지 확인하십시오. 유리 슬라이드를 다시 얼음 상자에 돌려 서 아가로스를 굳게 하고 탈수증을 방지합니다.
- 여분의 E3 달걀 물로 표면을 덮어 아가로즈의 상단 층을 촉촉하게 유지하십시오.
- 중뇌 감염용 장착
- 1 % (w / v) 아가로즈로 단일 오공 유리 현미경 슬라이드의 홈을 덮은 다음 4-6 트리카인 마취 된 배아를 아가로로 옮김을 옮니다.
- 각 배아의 머리를 10G 바늘로 조심스럽게 위쪽으로 위치시다(그림2C).
- 모든 배아의 위치가 고정되면 유리 슬라이드를 얼음 상자 또는 차가운 표면으로 옮겨 아가로즈가 굳어지게합니다.
참고 : 배아와 계란 물 전달의 양을 최소화하여 낮은 용융 아가로오스의 희석을 피하십시오.
- 감염을 위한 박테리아 준비
- 멸균 여과 페놀 레드(10x)의 1 μL을 세균 육수 10 μL aliquot에 넣고(1단계에서 제조) 간략하게 휘두를 수 있습니다.
참고: 멸균 PBS를 사용하여 최종 농도를 조정할 수 있습니다. - 10s ON에서 100W를 사용하여 준비를 초음파 처리하고, 10s OFF를14를형성했을 수 있는 덩어리를 분해한다.
- 멸균 여과 페놀 레드(10x)의 1 μL을 세균 육수 10 μL aliquot에 넣고(1단계에서 제조) 간략하게 휘두를 수 있습니다.
- 미세 주입을 통한 감염
- 마이크로인젝터 및 마이크로조작기를 미세주입을 위한 적절한 위치 및 설정으로 조정하여13.
- 마이크로 로더를 사용하여 세균 제제의 3 μL을 제조된 바늘내로 이송한다(3.1단계 참조). 기포가 형성되지 않도록 천천히 조심스럽게 파이펫을 피펫.
- 트렁크 부위 감염의 경우, 트렁크 부위에 100 cfu를 주입합니다(그림3A). 노토코드에 박테리아를 주입하지 마십시오.
참고: 주입을 위한 cfu는 수식 cfu = 세균 재고 농도 x 희석 인자 x 주입 액적 부피에 의해 추정된다. 실제 cfu는 OADC의 10% (v/v), 글리세롤의 0.5%, 및 50 μg/mL의 히그로마이신을 함유한 7H10 한천 플레이트에 세균 접종 한 방울을 도금하여 확인됩니다. - 중뇌 감염의 경우 중뇌 부위에 약 500 cfu를 주입합니다(그림 3B).
- 미세 주입 후, 조심스럽게 플라스틱 파이펫과 신선한 계란 물에 얼룩말 배아를 플러시.
참고 : 매우 초기 선천적 인 면역 세포 반응의 관찰을 커버하기 위해 가능한 한 빨리 유리 바닥 접시에 배아를 마운트합니다.
4. 감염의 살아있는 화상 진찰
- 라이브 이미징을 위한 물고기 장착
- 최대 10개의 트리카인 마취 배아를 유리 바닥 35mm 접시의 중간으로 옮김. 여분의 E3 매체를 버리십시오.
- 1% 낮은 융점으로 접시를 덮고 10G 바늘을 사용하여 제브라피시 배아를 조심스럽게 배아의 방향을 정경합니다. 아가로즈를 고체화하기 위해 얼음에 유리 바닥 접시를 10 s배양합니다.
참고 : 중뇌 주사의 경우, 배아는 머리를 위쪽으로 향하도록 아가로즈에 장착해야합니다(그림 4A). 트렁크 영역 의 근육 감염의 경우, 배아는 아가로즈에 측면으로 장착되어야한다(그림 4B). - 완전히 굳어지면 아가로오스를 달걀 물 층(트리카인 과 PTU 1)으로 덮습니다.
- 3색 고해상도 타임랩스 공초점 현미경
참고: 다음 단계는 63.0x 1.40 오일 UV 대물 렌즈가 장착된 공초점 현미경 검사법에서 작동합니다.- 환경 챔버의 온도를 28.5°C로 설정합니다. 습도를 제공하고 계란 물의 증발을 방지하기 위해 챔버 내부에 약간의 젖은 티슈 페이퍼를 놓습니다(보충 그림 1).
- 환경 챔버에 제브라피시와 함께 35mm 유리 바닥 접시를 놓습니다.
- 공초점 소프트웨어를 열고 스테이지를 초기화합니다. 63.0 x 1.40 오일 UV 목표로 전환하고 차동 간섭 콘트라스트(DIC) 필터가 있는 밝은 필드 채널을 사용하여 얼룩말물고기를 찾습니다.
- 405 다이오드, 아르곤(20% 전력), DPSS 561 nm 레이저를 엽니다. 적절한 레이저 전력 및 스펙트럼 설정을 설정합니다.
참고: 다음은 Cerulean에 대한 스펙트럼 설정(여기 = 405 nm; 방출 = ~ 456-499 nm), eGFP (여기 = 488 nm; 방출 = ~ 500-550 nm), DsRed2 (여기 = 561 nm; 방출 = ~ 575-645 nm) - "XYZ" "순차 스캔" 수집 모드를 선택하고 이미지 형식을 "512 x 512 픽셀"(추가 그림2A)로설정합니다.
- "라이브데이터 모드"로전환합니다. 첫 번째 얼룩말의 위치를 대상으로 하고 "Begin" 및"End" Z 위치를표시합니다. 나머지 배아 각각에 대해 이 과정을 반복합니다. "일시중지"프로그램은 끝날 때 추가할 수 있습니다(추가그림 2C).
- 프로그램의 루프 와 주기를 정의합니다.
- 파일을 저장합니다.
5. 세포 세포 UV 조사는 세포 자멸과 살아있는 화상 진찰을 유도하기 위하여
- 4.1단계에서 설명한 대로 물고기를 산다.
- 3일 후 수정 후 중뇌 영역을 이미징(dpf) 대식세포 특이적 형질전환 Tg(mfap4-eGFP) 배아15
- 형광으로 표지된 단일 대식세포의 관심 영역을 선택하고 400Hz 속도와 50초 동안 6%의 UV 레이저 전력으로 스캔합니다.
참고: 스캐닝 속도와 시간은 개별 현미경에 따라 최적화되어야 합니다. 주사 시간은 표적 세포 세포 세포 사멸을 일으키는 원인이 되는 광대한 DNA 손상을 일으키는 원인이 되기 위하여, 그러나 전체 세포를 광표백하지 않기 위하여 최적화되어야 합니다. - 위의 단계를 반복하여 더 많은 표적 세포를 조사합니다.
- 섹션 4에 설명된 바와 같이 중뇌 영역의 시간 경과 영상을 수행합니다.
6. 이미지 처리
- 획득한 이미지에 대해"최대 투영"을 수행합니다.
- "최대투영"보기에서 대상 셀의 XY 위치와 시간을 찾아 표시합니다.
- 표준 뷰로 돌아가 대상 셀의 Z 위치를 찾아 표시합니다.
- 대상 셀의 단일 레이어 이미지를 자작합니다.
- 오버레이 채널과 밝은 필드를 AVI 형식으로 비디오로 내보냅니다.
- ImageJ에서 오버레이 채널과 밝은 필드의 관심 영역을 자켓합니다.
- 마지막 단계에서 두 비디오를 수직으로 결합하고 ImageJ에서 하나의 AVI 포맷 비디오로 저장합니다.
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Representative Results
진균 감염은 감염의 경로에 따라 다른 호스트 반응을 시작할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 제브라피쉬 배아는 형광으로 표지된 박테리아를 중뇌 또는 트렁크내로 근육 내 미세 주입에 의해 감염되고(도3)공초점 라이브 이미징에 의해 관찰된다. 이 2개의 경로를 통해감염은 선천적인 면역 세포 모집 및 후속 세포 죽음을 일으키는 원인이 되는 감염을 현지로 제한할 것입니다.
타고난 면역 세포 죽음의 세부 사항을 시각화하는 것은 도전적입니다. Lytic 세포 죽음은 아주 짧은 시간 창에 생깁니다 관찰하기 위하여 고해상도 현미경 검사법을 요구합니다. 또한, 선천적인 면역 세포의 높은 운동성은 관찰 영역 밖으로 마이그레이션할 수 있습니다. 이 프로토콜에서는 여러 배아를 병렬로 관찰하여 이 문제를 해결합니다. 제브라피시 배아의 배열은 감염을 위한 단 하나 유리 현미경 슬라이드에 설치될 수 있고, 최대 10개의 배아는 살아있는 화상 진찰을 위한 동일 35 mm 유리 바닥 접시에 설치될 수 있습니다(그림 4). 공초점 현미경검사법의 라이브 데이터 모델을 활용함으로써 하나 이상의 배아를 동시에 관찰할 수 있습니다. 이것은 살아있는 화상 진찰의 효율성을 향상시키고 전체 lytic 세포 죽음 프로세스를 붙잡기의 확률을 크게 증가시킵니다.
타고난 면역 계통은 진균 감염에 대하여 방어의 첫번째 선이고, 2개의 중요한 분대는 대식세포와 호중구입니다. 여기서 우리는 이전에 보고된 Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) 및 Tg(mpeg1:loxP-DsRedx-loxP-eGFP;lyz:eGFP)를 활용하여 생체 내 대식세포와 호중구를 생체 내16,17,18. 박테리아로 무겁게 박힌 대식세포는 둥근 되고 결국 세포질 팽윤, 세포막의 파열 및 세포질 내용의 빠른 보급과 함께 감소된 운동성을 표시했습니다. 이들 사건은 이전에 보고된 바와 같이 lytic 세포 사멸의 전형적인 형태학적변화(도 5A)16. UV 조사는 제브라피시20,21에서세포 사멸을 겪는 세포를 유발하는 데 사용되어 왔다. 이러한 개념에 부합하여, UV 조사된 대식세포는 세포 수축, 핵 단편화 및 크로마틴 응축과 같은 전형적인 세포 표현형을보였다(도 5B)22,23. 세룰리안 형광 M. 마리넘19의사용과 결합하여, 대식세포, 호중구 및 M. 마리눔 간의 상호작용의 3가지 컬러 라이브 이미징이 생체 내에서 달성되었다. 우리는 또한 대식세포가 활발하게 식세포를 식세포로 및 M. 마리눔(보충도 3A)으로보급할 수 있음을 관찰하였다. 그러나, 호중구는 식세포 능력이 제한되어 있었고 명백한 세균 성 세포 제거 없이 신속하게 용액 세포사멸을 겪었다(보충도 3B). 호중구는 세룰리안 형광을 표현하지 않는 몇 개의 죽은 M. 마리눔의 식세포증에 의해, 또는 제한된 죽은 세포 파편의 식세포증에 의해 유발될 수 있습니다.
그림 1: 단일 세포 박테리아 제제의 개략적 도면. 단세포 세룰리안 형광 M. 마리눔 주식은 기재된 공정에 따라 생성되었다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 미세 주입을 위한 제브라피시 배아 장착의 다이어그램. (A)장착 공정의 회로도. (B)얼룩말피시 배아는 트렁크 부위의 감염을 위해 횡측으로 장착하였다. (C)제브라피시 배아는 중뇌의 감염을 위해 머리를 위쪽으로 향하도록 장착하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: 미세 주입을 위한 위치 지정. (A)빨간색 화살표는 트렁크 부위의 감염에 대한 주사 부위를 나타낸다. (B)빨간색 화살표는 중뇌 감염에 대한 주사 부위를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 라이브 이미징을 위한 제브라피시 배아 장착. (A)중뇌 감염의 경우, 제브라피쉬 배아는 머리를 아래쪽으로 향하도록 장착하였다. (B)트렁크 부위 감염의 경우, 제브라피쉬 배아는 유리 바닥 접시의 바닥에 가까운 주사 부위와 함께 측면으로 장착하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5: M. 마리눔 감염에서 전형적인 형태학적 변화는 대식세포 수축 세포 사멸 및 UV 유도 대식세포 세포 사멸을 유도하였다. (A)맥(Mac)의 시간 경과 영상영상은 일단 맥세포사멸을 겪고 나면 M. marinum으로무겁게 함유되어 있다. 3 dpf Tg (coro1a:eGFP;lyzDsRed2) 제브라피쉬 배아의 중뇌는 미세 주입을 통해 세룰리안 형광 M. 마리넘 (~500 cfu)에 의해 감염됩니다. 오버레이 채널(위쪽 패널)과 DIC 채널(아래쪽 패널)에 대한 이미지가 제공됩니다. T 00:00은 5 시간 20 분 후 감염입니다. 백색 파선 = 세포막의 윤곽; 검은 색 파선 = 붓기 세포질; 검은 화살표 = 파열 세포막; 빨간색 파선 = 신속하게 세포질 함량을 잃었다. (B)UV 조사 대식세포의 시간 경과 이미징. 3 dpf Tg (mfap4:eGFP)의 중뇌 영역에서 하나의 GFP+ 세포는 UV에 의해 조사되고 시간 경과 이미징이 뒤따릅니다. 백색 파선 = 세포막의 윤곽; 검은 화살표 = 핵 분열 및 크로마틴 응축. 배율 막대 = 15 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보조 그림 1: 라이브 이미징을 위해 설정된 환경 챔버. (A)온도를 28.5°C로 유지하도록 디지털 컨트롤러를 설정합니다. (B)습도를 제공하고 계란 물의 증발을 방지하기 위해 챔버 내부에 젖은 물티슈를 설정합니다. (C)챔버의 덮개를 닫고 라이브 이미징을 시작하기 전에 온도 안정화를 위해 적어도 30 분 동안 기다립니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
추가 그림 2: 라이브 이미징을 위한 공초점 패널 설정. (A)획득 패널 설정 표현입니다. (B)레이저 전력 및 스펙트럼 설정을 표현합니다. (C)라이브 데이터 모드에서 여러 작업 및 루프 설정을 표현합니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
보충 도 3: 대식세포는 감염을 전파하고 호중구는 M. marinum 감염 후에 lytic 세포 죽음을 겪습니다. (A)2 dpf Tg (coro1a:eGFP;lyz:DsRed2) 세룰리안 형광 M. 마리넘 (~100 cfu)에 의해 감염된 얼룩말 어피 배아의 트렁크에 M. 마리넘을 보급하는 대식세포. (B)Neutrophil (Neu) 3 dpf Tg (mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) 제브라피쉬 배아의 트렁크 부위에 명백한 M. 마리눔 없이 용이성 세포 사멸을 겪고 미세 주입을 통해 세룰리안 형광 M. 마리넘(~100 cfu)에 감염되었다. 녹색은 LRLG에 할당되고 적색은 lytic 세포 죽음 과정의 더 나은 시각화를 위해 eGFP에 할당됩니다. 청색의 화살표는 대상 셀을 나타냅니다. 빨간색 화살표는 다음 프레임에서 세포질 내용을 방출하려고 하는 세포를 가리킵니다. 녹색의 화살표는 세포질 함량을 방금 잃어버린 죽은 세포를 가리킵니다. 배율 막대 = 25 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
비디오 1: M. marinum으로 무겁게 적재된 대식세포는 그림 5A와관련있는 lytic 세포 죽음을 겪습니다. 3 dpf Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) 제브라피쉬 배아의 중뇌 영역의 중뇌 영역의 9분 및 18초동안 의 시간 경과 영상(63x objective)을 세룰리안 형광 M. 마리넘에감염하였다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 버튼을 클릭하십시오).
비디오 2: 대식세포는 도 5B와관련된 UV 조사 후 세포사멸을 겪습니다. 3 dpf Tg(mfap4:eGFP) 제브라피시 배아의 중뇌 영역의 6fps에서 74분의 시간 경과 영상(63x objective). 배아의 중뇌 부위에 있는 1개의 GFP+ 세포는 UV에 의해 조사되고 시간 경과 화상 진찰에 선행됩니다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 버튼을 클릭하십시오).
비디오 3: 대식세포는보충 도면 3A와 관련된 M. marinum을보급한다. 2 dpf Tg의 트렁크 영역의 3 fps에서 24 분의 시간 경과 이미징 (63x 목표)(coro1a:eGFP;lyz:DsRed2) 세룰리안 형광 M. 마리넘에감염된 제브라피쉬 배아. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 버튼을 클릭하십시오).
비디오 4: 호중구는 명백한 M. marinum engorgement 없이 lytic 세포 죽음을 겪습니다, 보충 그림 3B와 관련있는. 3 dpf Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP)의 트렁크 영역의 3fps에서 7분 30초의 시간 경과 영상(63x objective)은 세룰리안 형광 M. 마리눔에감염된 제브라피쉬 배아이다. 이 비디오를 보려면 여기를 클릭하십시오 (다운로드 오른쪽 버튼을 클릭하십시오).
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Discussion
이 프로토콜은 균균 감염 중 대식세포 죽음의 시각화를 설명합니다. 세포막의 무결성 등의 요인에 기초하여, 감염 구동 세포 사멸은 세포사멸과 사멸세포사멸(24,25)으로나눌 수 있다. 용리세포 사멸은 세포사멸보다 유기체에 더 스트레스가 많으며, 강한 염증 반응을 유발하기 때문에 24,25. 생체 내에서 용액 세포 사멸을 관찰하는 것은 높은 공간 시간적 해상도, 적절한 공초점 현미경 설정 및 강력한 형질전환 발현의 요구 사항으로 인해 어렵습니다.
적절한 미세 주입에는 몇 가지 중요한 단계가 필요합니다. 세균성 스톡은 주입 전에 모든 덩어리를 제거하기 위해 철저히 초음파 처리되어야합니다. 우리는 낮은 용융 아가로즈의 두 층 사이의 유리 슬라이드에 포함시켜 미세 주입을위한 제브라피시 장착을 개선했습니다. 아가로즈의 제 2 층을 적용 한 후, 슬라이드는 고응을 가속화하고 아가로오스의 탈수를 방지하기 위해 얼음 상자 또는 차가운 표면으로 옮겨질 수 있습니다. 배아를 다른 슬라이드에 장착해야하는 경우, 여분의 계란 물을 추가하여 아가로스의 상단 층을 촉촉하게 유지해야합니다.
라이브 이미징을 위해 세포 사멸의 세부 사항을 관찰하기 위해 고해상도 대물 렌즈가 필요합니다. 이 요구 사항은 항상 짧은 작업 거리를 동반하므로 감염 부위를 커버 슬라이드 가까이에 배치해야합니다. 장거리 물 렌즈는 더 깊은 조직을 이미징하는 데 이상적이고 적절한 배아 장착을위한 더 많은 공간을 허용합니다. 고강도레이저를 이용한 확장된 라이브 이미징은 조직 손상이나 배아의 사망을 유발한다. 따라서, 광표백 및 독성을 피하기 위해 가능한 한 낮은 레이저의 강도를 유지하는 것이 매우 중요하다. 강하게 발현형형질은 낮은 강도의 레이저를 사용하여 관찰을 용이하게 할 수 있다. GFP 발현은 Tg (coro1a:eGFP)보다 Tg (coro1a:eGFP)에서더 강하기 때문에, 우리는 이 연구에서 Tg (mpeg1:eGFP; lyz:DsRed2) 대신 Tg (coro1a:eGFP;lyz:DsRed2)를 사용했습니다. 공초점 기계 에 가까운 미세 주입을 위한 이동식 워크스테이션을 설정하는 것은 빠른 응답을 관찰하는 데 가장 적합합니다. 얼음에 낮은 용융 아가로즈를 냉각하여 응고 시간을 가속화하면 주입과 라이브 이미징 사이의 시간을 줄일 수 있습니다.
이 프로토콜에서는 대식세포 동작을 관찰하는 데 중점을 둡니다. 그러나, 마이코박테리아 감염 도중 호중구 행동의 상세한 연구 결과는 또한 유익할 수 있습니다. 예를 들면, 어떻게 호중구 세포 외 트랩 (NETs) 세포 외 진균을 죽이는에 관여하는 지는 크게 정의되지 않은 남아 있습니다. 이 프로토콜에 기술된 이미징 기술을 트랜스제닉 라벨링된 히스톤 단백질과 결합하면 생체 내 NET의 시각화를 크게 용이하게 할 것이다.
현재, 제브라피쉬는 타고난 면역 세포 행동을 연구하기 위한 매우 강력한 시스템으로 인식되고 있습니다. 식세포증과 세포 사멸의 통계 데이터는 이 프로토콜을 사용하여 달성될 수 있었다. 오늘날 사용할 수 있는 강력한 유전자 편집 도구와 결합된 이 프로토콜은 생체 내 호스트 병원체 상호 작용에 대한 다양한 요인의 영향을 더 잘 이해하기 위한 효과적인 플랫폼을 제공할 수 있습니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없다.
Acknowledgments
지롱 웬 박사님, 스테판 올러스 박사, 데이비드 토빈 박사님이 M. marinum 관련 자원을 공유해 주신 데 대해 감사드립니다. 이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (81801977) (B.Y.), 상하이 시 보건위원회의 뛰어난 청소년 교육 프로그램 (2018YQ54) (B.Y.), 상하이 항해 프로그램 (18YF1420400) (B.Y.), 그리고 상하이 키 연구소의 오픈 펀드 (B.Y.) (B.Y.) 및 상하이 키 연구소 (B.Y.) (B.Y.) (B.Y.) 및 오픈 펀드 (B.Y.)
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.05% Tween-80 | Sigma | P1379 | |
| 10 mL syringe | Solarbio | YA0552 | |
| 10% OADC | BD | 211886 | |
| 3-aminobenzoic acid | Sigma | E10521 | |
| 5 μm filter | Mille X | SLSV025LS | |
| 50 μl/ml hygromycin | Sangon Biotech | A600230 | |
| 7H10 | BD | 262710 | |
| 7H9 | BD | 262310 | |
| A glass bottom 35 mm dish | In Vitro Scientific | D35-10-0-N | |
| Agarose | Sangon Biotech | A60015 | |
| Confocal microscope | Leica | TCS SP5 II | |
| Enviromental Chamber | Pecon | temp control 37-2 digital | |
| Eppendorf microloader | Eppendorf | No.5242956003 | |
| Glass microscope slide | Bioland Scientific LLC | 7105P | |
| Glycerol | Sangon Biotech | A100854 | |
| Incubator | Keelrein | PH-140(A) | |
| M.marinum | ATCC BAA-535 | ||
| Microinjection needle | World Precision Instruments | IB100F-4 | |
| Microinjector | Eppendorf | Femtojet | |
| Micromanipulator | NARISHIGE | MN-151 | |
| msp12:cerulean | Ref.: PMID 25470057; 27760340 | ||
| Phenol red | Sigma | P3532 | |
| PTU | Sigma | P7629 | |
| Single concavity glass microscope slide | Sail Brand | 7103 | |
| Sonicator | SCICNTZ | JY92-IIDN | |
| Spectrophotometer (OD600) | Eppendorf AG | 22331 Hamburg | |
| Stereo Microscope | OLYMPUS | SZX10 | |
| Tg(mfap4:eGFP) | Ref.: PMID 30742890 | ||
| Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) | Ref.: PMID 31278008 | ||
| Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) | Ref.: PMID 27424497; 17477879 |
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