Summary

제브라피시 배아에서 사체내 현미경 검사를 통해 진균 감염 시 대식세포 리액세포 사멸 시 시각화

Published: January 09, 2019
doi:

Summary

이 프로토콜은 마이코박테리움 마리눔 감염 동안 배아 제브라피시의 대식세포 행동 및 사망을 시각화하는 기술을 설명합니다. 박테리아의 준비, 배아감염 및 활력 내 현미경 검사법 에 대한 단계가 포함되어 있습니다. 이 기술은 감염 또는 멸균 염증을 관련시키는 유사한 시나리오에 있는 세포 행동 그리고 죽음의 관측에 적용될 수 있습니다.

Abstract

Zebrafish는 초기 개발 중에 선천적 면역 체계에 전적으로 의존하여 투명한 자연과 의존성으로 인해 선천적 면역 세포 행동을 연구하기위한 훌륭한 모델 유기체입니다. 제브라피쉬 마이코박테리움 마리눔(M. marinum)감염 모델은 진균 감염에 대한 숙주 면역 반응을 연구하는 데 잘 확립되어 있다. 다른 대식세포 사멸 유형이 진균 감염의 다양한 결과로 이어질 것이라는 것이 제안되었다. 여기에서 우리는 M. marinum 감염 다음 zebrafish 태아에 있는 대식세포 세포 죽음을 관찰하기 위하여 intravital 현미경 검사를 사용하여 프로토콜을 기술합니다. 특히 대식세포와 호중구에 라벨을 붙이는 Zebrafish 형질전환 선은 중뇌 또는 트렁크에 형광으로 표지된 M. marinum의 근육 내 미세 주입을 통해 감염됩니다. 감염된 제브라피시 배아는 이후에 낮은 용융 아가로오스에 장착되고 X-Y-Z-T 치수에서 공초점 현미경 검사법에 의해 관찰됩니다. 장기 라이브 이미징은 광표백 및 광독성을 피하기 위해 낮은 레이저 파워를 사용해야 하기 때문에 형질전환이 강력히 권장됩니다. 이 프로토콜은 면역 세포 이동, 숙주 병원체 상호 작용 및 세포 사멸을 포함하는 생체 내 동적 프로세스의 시각화를 용이하게 합니다.

Introduction

마이코박테리아 감염은 숙주 면역세포 사멸을 유발하는 것으로 입증되었다1. 예를 들면, 감쇠한 긴장은 대식세포에 있는 세포자멸을 시작하고 감염을 포함할 것입니다. 그러나, 악성 긴장은 세균성보급을일으키는 원인이 되는 lytic 세포 죽음을 시작할 것입니다1,2. 세포 죽음의 이 다른 모형이 호스트 항 진균 반응에 있는 충격을 고려하면, 생체 내에서 진균 감염 도중 대식세포 세포 죽음의 상세한 관측이 필요합니다.

세포 사멸을 측정하는 종래의 방법은 안네신 V, TUNEL, 또는 아크리딘 오렌지/프로피듐 요오드화물 염색3,4,5와같은 죽은 세포 얼룩을 사용하는 것이다. 그러나, 이러한 방법은 생체 내에서 세포 사멸의 동적 과정에 빛을 비출 수 없습니다. 시험관내 세포 사멸의 관찰은 이미 살아있는 화상 진찰6에의해 촉진되었습니다. 그러나, 결과 정확 하 게 생리 조건을 모방 여부 불분명 남아.

Zebrafish는 호스트 항 진균 반응을 연구하기위한 훌륭한 모델이었습니다. 그것은 인간과 유사한 높게 보존된 면역 계통을, 쉽게 조작한 게놈, 및 초기 태아는 살아있는 화상진찰7,8,9를허용하는 투명합니다. M. marinum에 감염 후, 성인 얼룩말 은 전형적인 성숙한 육아종 구조를 형성하고, 배아 제브라피쉬는 구조9,10과같은 초기 육아종을 형성한다. 선천성 면역세포-박테리아 상호작용의 역동적인 과정은 제브라피쉬 M. 마리눔 감염 모델11,12에서이전에 탐구되었다. 그러나, 높은 공간 시간적 해상도 요구 사항으로 인해, 타고난 면역 세포의 죽음을 둘러싼 세부 사항은 크게 정의되지 않은 남아있다.

여기에서 우리는 생체 내에서 진균 감염에 의해 유발된 대식세포 리선세포 사멸의 과정을 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 프로토콜은 또한 발달 및 염증 동안 생체 내에서 세포 행동을 시각화에 적용될 수 있다.

Protocol

제브라피쉬는 동물 복지에 대한 윤리적 검토를 위한 실험실 동물 가이드라인(GB/T 35823-2018)을 준수하여 표준 조건하에서 제기되었습니다. 본 연구에서 모든 제브라피시 실험은 승인(2019-A016-01)을 승인하고 푸단 대학교 상하이 공중 보건 임상 센터에서 실시했습니다. 1. M. 마리넘 단일 세포 접종 준비(그림 1) -80 °C에서 세룰리안 형광 M. 마?…

Representative Results

진균 감염은 감염의 경로에 따라 다른 호스트 반응을 시작할 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 제브라피쉬 배아는 형광으로 표지된 박테리아를 중뇌 또는 트렁크내로 근육 내 미세 주입에 의해 감염되고(도3)공초점 라이브 이미징에 의해 관찰된다. 이 2개의 경로를 통해감염은 선천적인 면역 세포 모집 및 후속 세포 죽음을 일으키는 원인이 되는 감염을 현지로 제한할 것입니?…

Discussion

이 프로토콜은 균균 감염 중 대식세포 죽음의 시각화를 설명합니다. 세포막의 무결성 등의 요인에 기초하여, 감염 구동 세포 사멸은 세포사멸과 사멸세포사멸(24,25)으로나눌 수 있다. 용리세포 사멸은 세포사멸보다 유기체에 더 스트레스가 많으며, 강한 염증 반응을 유발하기 때문에 24,25. 생체 내에서 용액 ?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

지롱 웬 박사님, 스테판 올러스 박사, 데이비드 토빈 박사님이 M. marinum 관련 자원을 공유해 주신 데 대해 감사드립니다. 이 작품은 중국 국립 자연 과학 재단 (81801977) (B.Y.), 상하이 시 보건위원회의 뛰어난 청소년 교육 프로그램 (2018YQ54) (B.Y.), 상하이 항해 프로그램 (18YF1420400) (B.Y.), 그리고 상하이 키 연구소의 오픈 펀드 (B.Y.) (B.Y.) 및 상하이 키 연구소 (B.Y.) (B.Y.) (B.Y.) 및 오픈 펀드 (B.Y.)

Materials

0.05% Tween-80 Sigma P1379
10 mL syringe Solarbio YA0552
10% OADC BD 211886
3-aminobenzoic acid Sigma E10521
5 μm filter Mille X SLSV025LS
50 μl/ml hygromycin Sangon Biotech A600230
7H10 BD 262710
7H9 BD 262310
A glass bottom 35 mm dish In Vitro Scientific D35-10-0-N
Agarose Sangon Biotech A60015
Confocal microscope Leica TCS SP5 II
Enviromental Chamber Pecon temp control 37-2 digital
Eppendorf microloader Eppendorf No.5242956003
Glass microscope slide Bioland Scientific LLC 7105P
Glycerol Sangon Biotech A100854
Incubator Keelrein PH-140(A)
M.marinum ATCC BAA-535
Microinjection needle World Precision Instruments IB100F-4
Microinjector Eppendorf Femtojet
Micromanipulator NARISHIGE MN-151
msp12:cerulean Ref.: PMID 25470057; 27760340
Phenol red Sigma P3532
PTU Sigma P7629
Single concavity glass microscope slide Sail Brand 7103
Sonicator SCICNTZ JY92-IIDN
Spectrophotometer (OD600) Eppendorf AG 22331 Hamburg
Stereo Microscope OLYMPUS SZX10
Tg(mfap4:eGFP) Ref.: PMID 30742890
Tg(coro1a:eGFP;lyzDsRed2) Ref.: PMID 31278008
Tg(mpeg1:LRLG;lyz:eGFP) Ref.: PMID 27424497; 17477879

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Niu, L., Wang, C., Zhang, K., Kang, M., Liang, R., Zhang, X., Yan, B. Visualization of Macrophage Lytic Cell Death During Mycobacterial Infection in Zebrafish Embryos via Intravital Microscopy. J. Vis. Exp. (143), e60698, doi:10.3791/60698 (2019).

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