Summary
La prénylation est une modification importante sur les protéines de liaison de membrane périphérique. Les cellules d'insectes peuvent être manipulées pour produire des KRAS4b farnédées et carboxyméthylées en quantités qui permettent des mesures biophysiques des interactions protéines-protéines et protéines-lipides
Abstract
La prénylation des protéines est une modification clé qui est responsable du ciblage des protéines vers les membranes intracellulaires. KRAS4b, qui est muté dans 22% des cancers humains, est traité par farnesylation et carboxymethylation en raison de la présence d'un motif de boîte 'CAAX' au terminus C. Un système de baculovirus machiné a été employé pour exprimer kraS4b farnésylated et carboxymethylated dans des cellules d'insecte et a été décrit précédemment. Ici, nous décrivons la purification détaillée et pratique et la caractérisation biochimique de la protéine. Plus précisément, l'affinité et la chromatographie d'échange d'ions ont été utilisées pour purifier la protéine à l'homogénéité. La spectrométrie de masse intacte et indigène a été utilisée pour valider la modification correcte de KRAS4b et pour vérifier la liaison nucléotide. Enfin, l'association de membrane de KRAS4b farnesylated et carboxymethylated aux liposomes a été mesurée utilisant la spectroscopie de résonance de plasmon de surface.
Introduction
Les modifications post-traductionnelle jouent un rôle clé dans la définition de l'activité fonctionnelle des protéines. Les modifications telles que la phosphorylation et la glycosylation sont bien établies. Les modifications lipidiques sont moins bien caractérisées, cependant. On estime que jusqu'à 0,5 % de toutes les protéines cellulaires peuvent être prénylées1. La prénylation est le transfert d'un farnesyl de 15 carbone ou d'une chaîne lipidique geranylgeranyl de 20 carbone à une protéine accepteur contenant le motif CAAX2. Les protéines prénylées ont été impliquées dans la progression de plusieurs maladies humaines, y compris le vieillissement prématuré3, Alzheimer4, dysfonction cardiaque5, chorroideremia6, et le cancer7. Les petits GTPases, HRAS, NRAS et KRAS1, les laminins nucléaires, et les kinétochores CENP-E et F sont des protéines farnédylated sous l'état basal. D'autres petits GTPases, à savoir RhoA, RhoC, Rac1, cdc-42, et RRAS sont geranylgeranylated8, tandis que RhoB peut être farnétatif ou geranylgeranylated9.
Le petit GTPase KRAS4b fonctionne comme un interrupteur moléculaire, transmettant essentiellement le facteur de croissance extracellulaire signalant aux voies intracellulaires de transduction de signal qui stimulent la croissance et la prolifération de cellules, par l'intermédiaire des interactions multiples de protéine-protéine. Il y a deux aspects clés de la biochimie KRAS4b qui sont essentiels à son activité. Tout d'abord, les cycles protéiques entre un PIB inactif et un état lié gtP actif par lequel il s'engage activement avec les effecteurs. Deuxièmement, une région de polylysine C-terminal et une cystéine farnédilate et carboxymethylated dirigent la protéine à la membrane de plasma, permettant le recrutement et l'activation des effecteurs en aval. Mutant KRAS4b est un conducteur oncogène dans le cancer du pancréas, colorectal et du poumon10, et en tant que tel, l'intervention thérapeutique aurait un énorme avantage clinique. La production de protéines recombinantes authentiquement modifiées qui sont farnésylated et carboxymethylated permettrait le criblage biochimique utilisant KRAS4b en combination avec des substituts de membrane tels que des liposomes ou des nanodisques lipidiques11,12.
Farnesyl transferase (FNT) catalyse l'ajout de pyrophosphate de farnesyl à la cystéine C-terminale dans le motif CAAX dans KRAS4b. Après la prénylation, la protéine est trafiquée vers le réticulum endoplasmique (ER) où l'enzyme de conversion Ras (RCE1) fend les trois résidus c-terminaux. La dernière étape dans le traitement est la méthylation du nouveau résidu de farnesylcystéine C-terminal par la protéine de membrane d'ER, isoprenylcysteine carboxyl méthyltransferase (ICMT). L'expression du KRAS4b recombinant dans E. coli entraîne la production d'une protéine non modifiée. Les tentatives précédentes de produire du KRAS4b transformé ont été limitées en raison de rendements insuffisants pour des expériences structurelles ou de dépistage de médicaments ou n'ont pas réussi à récapituler la protéine mature pleine longueur indigène13,14. Le protocole présenté ici utilise un système d'expression et de purification d'insectes à base de baculovirus qui génère un KRAS4b hautement purifié et entièrement traité à des rendements de 5 mg/L de culture cellulaire.
Une caractérisation prudente des protéines est essentielle pour valider la qualité des protéines recombinantes avant de se lancer dans des études de biologie structurelle ou de dépistage des médicaments. Deux paramètres clés du KRAS4b entièrement traité sont la validation de la modification correcte de prenyl et la disponibilité du C-terminus (FMe) farnesylated et carboxymethylated pour l'interaction avec des substituts de membrane ou des lipides. La spectrométrie de masse d'ionisation d'électrospray (ESI-MS) du KRAS4b-FMe a été employée pour mesurer le poids moléculaire et confirmer la présence des modifications de farnesyl et de carboxymethyl. La spectrométrie de masse indigène, où les échantillons sont pulvérisés avec des solvants non dénaturants, a été utilisée pour démontrer que KRAS4b-FMe était également lié à son cofactor de PIB. Enfin, la spectroscopie de résonance de plasmon de surface a été employée pour mesurer la liaison directe de KRAS4b-FMe avec des liposomes immobilisés.
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Protocol
1. Purification des protéines
- Préparer les tampons A-H, comme on le voit dans le tableau 1.
| Solution tampon | Agent tampon (tous les 20 mM) | pH | NaCl (mM) | imidazole (mM) | MgCl2 | TCEP |
| Un | Hepes | 7.3 | 300 | - | 5 | 1 |
| B | Hepes | 7.3 | 300 | 35 | 5 | 1 |
| C | Hepes | 7.3 | 300 | 500 | 5 | 1 |
| D | MES (EN) | 6.0 | 200 | - | 5 | 1 |
| E | MES (EN) | 6.0 | - | - | 5 | 1 |
| F | MES (EN) | 6.0 | 100 | - | 5 | 1 |
| G | MES (EN) | 6.0 | 1000 | - | 5 | 1 |
| H (en) | Hepes | 7.3 | 300 | - | 1 | 1 |
- Préparer les matériaux de purification (voir Tableau des matériaux):cocktail inhibiteur de la protéase sans EDTA ou autres chélateurs; colonne de chromatographie d'affinité métallique immobilisée (IMAC) ; colonne de chromatographie d'échange de cation (CEX) ; filtre à seringues de 0,45 m; 2 M d'imidazole (pH 7,5); ultracentrifuge capable de 100 000 x g; centrifugeuse à montables à grande vitesse capable de 4 000 x g; unités de filtre centrifuge (10 KDa NMWL); spectrophotomètre capable de lire à 280 nm; His6-tobacco etch virus (TEV) protéase; et instrumentation de chromatographie capable de mélanger deux solutions tampons, d'appliquer des solutions aux colonnes, de créer des élutions de gradient à partir de colonnes et de collecter des fractions à partir de colonnes.
- Décongeler les cellules à partir de 2 L de culture de cellules d'insectes précédemment stockées à -80 oC ou utiliser des cellules fraîchement récoltées. Voir Gillette et coll. 201915 pour plus de détails sur la lignée et les protocoles d'expression des insectes Tni.FNL. Resuspendre soigneusement les cellules avec 200 ml de tampon A avec un inhibiteur de protéase ajouté de 1:200 v/v sans introduire d'air ou créer de la mousse.
REMARQUE : L'étape 1.3 et les étapes suivantes (sauf indiqué) doivent être effectuées à température ambiante (22 oC). Il est important que l'échantillon soit homogène pour permettre une lyse complète à l'étape suivante. - Lyse pastilles cellulaires dans un microfluidifiant à 7 000 psi pour deux passes ou dans un système de lyse équivalent. D'autres méthodes de lyse n'ont pas été explorées.
- La clarification des lysates des cellules d'insectes est problématique en raison de la présence de composés qui obstruent les filtres. Ainsi, l'ultracentrifugation (100 000 x g pendant 30 min à 4 oC) est très importante. Un résidu de lipide blanc à la surface du supernatant doit être évité et peut être enlevé ou réduit à l'aide d'écouvillons de coton. Filtrer le supernatant décanté dans un filtre PES de 0,45 m. Utilisez immédiatement l'échantillon clarifié ou entreposez-le à -80 oC.
REMARQUE : Les blocs de résidus filtrent rapidement et de nombreux filtres peuvent être nécessaires. Le défaut de réduire la quantité de ce matériau entraînera une pression arrière haute dans les étapes suivantes. - Déterminez le volume du lysate clarifié et ajustez l'échantillon à 35 mM d'imidazole par l'ajout de 2 M de stock d'imidazole. Chargez l'échantillon à 3 ml/min sur une colonne IMAC de 20 mL (colonne HisPrep FF 16/10) pré-équilibrée en tampon B pour trois volumes de colonnes (CV).
- Bien que la protéine cible soit généralement adsorbée quantitativement à la colonne, il est préférable de recueillir le flux de colonne pour l'analyse ultérieure. Laver la colonne jusqu'à ce que l'Abs280 atteigne une ligne de base stable (100 unités de milliabsorbance [mAU]) avec le tampon B à 3 ml/min pour 20 ml (1 CV), puis pour 3 CV à 4 ml/min pour le reste de l'étape de lavage. En règle générale, 60 à 80 ml de tampon B sont nécessaires pour atteindre l'absorption de base.
- Élirez la protéine avec un gradient de 400 ml (20 CV) du tampon B au tampon C tout en recueillant 8 ml de fractions. Typiquement, la protéine cible élute dans la première moitié du gradient(figure 1A; toutes les fractions ultérieures ne sont pas montrées).
- Analyser les fractions de protéines à l'aide de la coloration SDS-PAGE/Coomassie. Poule fractions de pointe et dialyser la piscine pendant la nuit contre 2 L de Tampon D à 4 oC.
REMARQUE : Un faible pH est essentiel pour assurer la liaison des protéines à l'étape suivante. Cependant, le changement de pH pendant cette dialyse se produit lentement, et c'est une étape commode pour l'incubation de nuit. D'autres stratégies d'échange de tampons (p. ex., une concentration plus élevée de tampons pour accélérer le changement de pH) n'ont pas été étudiées. La protéine commencera à se précipiter lentement au fil du temps à un pH plus faible et à des concentrations de sel plus faibles et une petite quantité de précipitations est normale au cours de cette étape. Pour cette raison, nous évitons d'échanger le tampon à la 100 mM NaCl nécessaire pour se lier à la colonne suivante pendant la dialyse. Au contraire, une concentration de NaCl de 200 mM est utilisée pour la dialyse et la protéine est diluée à 100 mM (voir ci-dessous) immédiatement avant l'application à la colonne. Nous n'avons pas étudié si ces précipitations sont spécifiques à KRAS4b, mais la protéine qui ne précipite a été confirmée comme KRAS4b-FMe. Pour cette raison, nous suggérons d'utiliser la concentration plus élevée de NaCl dans le tampon de dialyse pour toute protéine d'intérêt par mesure de précaution jusqu'à ce que la stabilité de la protéine cible dans le tampon de liaison puisse être déterminée. - Retirer l'échantillon de la dialyse et de la centrifugeuse à 4 000 x g pendant 10 min pour enlever tout précipité. L'échantillon final dialysé et clarifié à ce stade est encore souvent flou, mais peut être appliqué sans traitement supplémentaire sur la colonne CEX ultérieure.
- Préparer une colonne d'échange de cation de 20 ml (voir Tableau des matériaux) en lavant avec trois CV de Buffer G, puis avec trois CV de Buffer F.
REMARQUE: Bien que nous n'ayons pas méticuleusement évalué d'autres résines, plusieurs collègues ont trouvé une mauvaise résolution avec des résines autres que la résine SP Sepharose Haute Performance. - Diluer 20 ml de l'échantillon dialysé à une concentration finale de NaCl de 100 mm en ajoutant 20 ml de tampon E et appliquer l'échantillon dilué à la colonne d'échange de cation.
- Continuer à charger la colonne en ajoutant des échantillons fraîchement dilués préparés comme décrit ci-dessus sur le tube de charge que la dilution précédente est proche de la fin de la charge.
REMARQUE : La dilution de l'échantillon entier à la fois à 100 mM De NaCl a entraîné une perte importante de protéines cibles en raison des précipitations. - Laver la colonne à la ligne de base Abs280 avec Buffer F. Cela nécessite généralement 3 CV. La protéine est élue de la colonne au cours d'un gradient de 400 ml (20 CV) de Buffer F à 65% Buffer G, recueilli en fractions de 6 ml (Figure 1B).
- Continuez à laver la colonne pour un CV supplémentaire de 1,5 CV (65 % de tampon G) une fois le gradient terminé. Choisissez des fractions positives basées sur l'analyse des taches bleues SDS-PAGE/Coomassie et l'inspection de la trace UV du chromatogramme.
REMARQUE : La trace UV contient généralement cinq pics. Commençant par des concentrations de sel plus faibles, le pic initial est habituellement une protéine non transformée et/ou protéolysée. Les deuxième et troisième pics sont un mélange de deux formes de protéines transformées : le deuxième pic est principalement un intermédiaire farnédilatif (FARN), tandis que le troisième est principalement la protéine Entièrement traitée FMe d'intérêt. Les pics quatre et cinq représentent les protéines de fusion His6-MBP-KRAS4b (toutes les protéines sont dans ce format à ce stade, car aucune digestion DeEV n'a eu lieu). Ceux-ci ne sont pas N-acetylated au N-terminus et sont farnesylated (pic quatre) et farnesylated et carboxymethylated (pic cinq) au C-terminus. Comme le pic deux et le pic quatre produiront des protéines identiques après l'élimination des étiquettes (c.-à-d. KRAS4b-FARN), celles-ci peuvent être mises en commun à ce stade si désiré. De même, le pic trois et le pic cinq peuvent être combinés pour produire un seul lot de KRAS4b-FMe (Figure 1B, Figure 2). Cependant, il est conseillé que cette mise en commun ne se fasse que lorsque la nature de la protéine dans les pics séparés a été confirmée. - Digdez la protéine mise en commun à l'étape 1,15 avec la protéase His6-TEV (200 g de protéase/mL d'échantillon.
REMARQUE: Nous faisons sa protéase His6-TEV en utilisant le plasmide et les protocoles disponibles à partir d'Addgene (https://www.addgene.org/92414). Dialyser le digest TEV contre le tampon A (10 kDa MWCO dialyse avec un minimum de 40 ml de tampon A par ml d'échantillon) pendant 2 h à température ambiante, puis pendant la nuit à 4 oC. - Après la digestion et la dialyse, chargez la protéine directement sur une colonne IMAC de 20 mL libé avec le tampon A à 3 ml/min.
REMARQUE: Recueillir 7 mL fractions au cours de cette chromatographie entière, parce que la protéine cible a une faible affinité pour la colonne, mais pourrait ne pas être entièrement lié à la résine. Laver la colonne à 3 ml/min avec le tampon A pour un total de 3 CV ou jusqu'à ce qu'une absorption de base soit atteinte. - La protéine cible est élugée avec un gradient de 5 CV de Buffer C de 0%-10%, recueillant 7 ml de fractions. Par mesure de précaution, des protéines liées supplémentaires peuvent être élucées avec 100 % de tampon C. Des fractions positives sont identifiées après analyse par SDS-PAGE (Figure 1C). Typiquement, la protéine cible élude à une faible concentration d'imidazole (c.-à-d., dans le gradient de 0% -10% De tampon C), mais parfois des élutes dans le flux à travers ou le lavage de colonne.
- Dialysez la piscine finale contre le tampon H. Déterminer la concentration en protéines par spectrophotométrie à 280 nm.
REMARQUE : Assurez-vous de tenir compte de la présence du nucléotide lors de la détermination du coefficient d'extinction à utiliser pour ce calcul. - La protéine peut être concentrée à 2 à 5 mg/ml à l'aide d'une unité de filtre centrifuge (10 K NMWL) sans perte significative de protéines. Filtrer à l'utilisation d'un filtre à seringues de 0,22 M. Mesurer l'absorption de la solution à A280 pour calculer la concentration finale de protéines (figure 1D). Congeler les aliquots dans de l'azote liquide et stocker les échantillons congelés à -80 oC.
REMARQUE : La protéine purifiée est liée au PIB. KRAS4b-FMe peut être échangé dans GppNHp en utilisant des protocoles précédemment publiés16.
2. Préparation d'échantillon pour l'analyse de masse intacte et l'analyse de masse indigène
- Préparation d'échantillons pour l'analyse de masse intacte
- Décongeler l'échantillon de protéines sur la glace avant l'analyse. Pour une analyse de masse intacte, diluer la protéine à 0,1 mg/ml en 20 mM de bicarbonate d'ammonium (pH à 8,4). Pour l'analyse de masse indigène, diluer la protéine à une concentration de 0,1 mg/mL dans 50 mM d'acétate d'ammonium (pH à 7,5). Vortex chaque échantillon pour 5-10 s, puis centrifugeuse à 12.500 x g pendant 1 min pour granuler tout matériau solide dans la solution. Retirez 10 à 20 L de chaque supernatant et transférez-le dans un flacon d'ausampler en verre. Capuchonde zona votre flacon hermétiquement pour éviter la contamination ou l'évaporation.
REMARQUE : Pour l'analyse de masse intacte ou l'analyse de masse indigène, l'échantillon peut être dessalé avant l'analyse à l'aide d'un filtre à membrane de cellulose MWCO de 10 kDa pour tamponner l'échange dans le tampon de dilution final.
- Décongeler l'échantillon de protéines sur la glace avant l'analyse. Pour une analyse de masse intacte, diluer la protéine à 0,1 mg/ml en 20 mM de bicarbonate d'ammonium (pH à 8,4). Pour l'analyse de masse indigène, diluer la protéine à une concentration de 0,1 mg/mL dans 50 mM d'acétate d'ammonium (pH à 7,5). Vortex chaque échantillon pour 5-10 s, puis centrifugeuse à 12.500 x g pendant 1 min pour granuler tout matériau solide dans la solution. Retirez 10 à 20 L de chaque supernatant et transférez-le dans un flacon d'ausampler en verre. Capuchonde zona votre flacon hermétiquement pour éviter la contamination ou l'évaporation.
- Préparation de la spectroscopie de masse étendue (EMR) pour l'analyse de masse
REMARQUE : Avant d'effectuer une analyse sur le spectromètre de masse, assurez-vous qu'il a été récemment étalonné. De plus, portez toujours des gants et d'autres équipements de protection individuelle au besoin pour éviter tout produit chimique nocif et pour éviter de contaminer des échantillons et des solvants. Calibration se fait à l'aide d'une solution d'étalonnage obtenue commercialement et d'une solution d'iodure de césium de 2 mg/mL préparée en interne.- Ouvrez le logiciel d'analyse et chargez le fichier de méthode d'instrument approprié. Pour l'analyse de masse intacte des protéines KRAS4b, les paramètres de départ appropriés sont les suivants : mode de détection positif ; trois microscans, résolution 70 000; Objectif AGC 3e6; temps d'intégration maximum de 200 ms; et une plage d'analyse de 70 à 1 800 ratio masse/charge (m/z). Pour l'analyse de masse indigène des protéines KRAS4b, les paramètres de départ appropriés sont les suivants : mode de détection positif ; 10 microscans, résolution 17 500; dissociation induite par les collisions à l'interne (CID) à 20 eV; Objectif AGC 3e6; l'énergie de collision (CE) 20; temps d'intégration maximum de 200 ms; et une plage d'analyse de 500 à 10 000 m/z.
- Préparation de solvants chromatographiques et colonne
- Préparer les solvants nécessaires à l'analyse de masse intacte. Le solvant A est de l'eau avec 0,1% d'acide formique. Le solvant B est à 80 % d'acétonitrile et à 0,1 % d'acide formique dans l'eau.
- Préparer les solvants nécessaires à l'analyse de masse indigène. Le solvant A est de 0,1 M d'acétate d'ammonium dans l'eau et le solvant B est de l'eau.
- Une fois les solvants appropriés préparés, purger le système de façon à ce que le tube soit rempli des solvants appropriés et que toutes les bulles d'air soient retirées des lignes.
- Installer la colonne appropriée (une colonne de phase inversée pour l'analyse de masse intacte et une colonne d'exclusion de taille pour l'analyse de masse native). Pour l'analyse de masse intacte, le débit est de 0,5 ml/min, et la température de la colonne (à l'aide d'un chauffe-colonne) est de 50 oC. Équilibrez la colonne pendant 15 à 20 min. Pour l'analyse de masse native, le débit est de 0,25 ml/min.
REMARQUE : Surveillez toujours la pression arrière de la colonne pour vous assurer qu'elle ne dépasse pas la limite supérieure, ce qui pourrait indiquer une ligne obstruée ou que la matrice de colonne est compromise. Remplacez la colonne si nécessaire.
- Analyse de l'échantillon
- Placez l'échantillon de protéines préparé dans le flacon d'ausampler en verre dans le support de flacon approprié dans l'autosampler des systèmes LC. Créez une liste d'échantillons dans le logiciel avec la méthode d'instrument appropriée pour l'analyse souhaitée. Une fois la liste d'échantillons terminée, cliquez sur le bouton Lecture pour démarrer l'analyse.
- Injecter un échantillon de 1 à 2 l par analyse, avec un blanc d'eau avant et après chaque échantillon, pour s'assurer qu'il n'y a pas de report.
REMARQUE : L'analyse de masse intacte est très différente de l'analyse de masse native et nécessite des paramètres de méthode d'instrument très différents. C'est parce qu'avec l'analyse de masse intacte, la protéine est "relaxée" en présence d'un solvant organique, et est donc capable d'accepter plus de charges. Il est plus facile de décongestionner et de résoudre la distribution isotopique des états de charge. L'analyse de masse indigène fournit une distribution étroite de charge des ions de protéine, et basé sur la protéine, exige différents arrangements d'énergie de tension et de collision.
- Analyse des données et déconvolution de protéines
- Exporter le spectre de l'échantillon vers un logiciel où il peut être transformé en spectre dé-compliqué qui affichera la masse intacte (ou masse indigène) de la protéine. La masse intacte aura une distribution de pointe isotopique en raison de la forte abondance de pics spectraux chargés. La masse indigène aura généralement très peu de pics en raison de la faible abondance des pics spectraux chargés (Figure 3D).
- Élargir la plage de masse-charge (m/z) du pic d pour confirmer que la masse mesurée est compatible avec la masse prévue. De temps en temps, en raison de l'ajout de charges à la protéine, il peut y avoir une légère variation entre le poids moléculaire prévu (MW) et le MW observé. De plus, comme c'est le cas pour de nombreuses analyses de spectrométrie de masse, les adducteurs comme le sodium peuvent contribuer à l'apparition de pics supplémentaires dans les données, même avec des échantillons soigneusement dessalées. On observe parfois des pics abondants plus bas avec un m/z plus bas que prévu. Cela est probablement dû à une perte neutre, qui est la perte d'un groupe fonctionnel en raison du processus d'ionisation.
REMARQUE : Comme prévu, il y aura des différences entre la masse intacte et les pics de masse indigènes. L'affichage de masse intact montrera le MW prévu de la protéine. Il n'aura pas le MW supplémentaire du nucléotide attaché ou d'autres modifications. Cependant, le pic de masse indigène montrera la protéine avec n'importe quel nucléotide ajouté.
3. Validation de la liaison KRAS4b-FMe aux liposomes
- Préparation des liposomes de membrane
- Préparer un tampon composé de 20 mM HEPES (pH 7,3), 150 mM NaCl et 1 mM de TCEP.
- Les matériaux de préparation de Liposome incluent 25 mM 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) et 10 mM 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS) stocks dans le chloroforme; un extrudeur lipidique réglé avec un support et un bloc chauffant; gaz argon et azote liquide; un bain à ultrasons; flacons de fil de vis en verre avec revêtements en mousse PTFE; et un lecteur de plaques capable de la détection dynamique de diffusion de la lumière.
- Décongeler les stocks lipidiques en chloroforme à température ambiante pendant 30 min. Préparer 1 ml de 5 mM 70 m30 POPC : popS liposomes en inscrivant 106 OL de 25 mL de POPC (stock) et 118 oL de 10 mL de POPS (stock) dans un flacon de verre.
REMARQUE: Ne pas aliquot lipides avec une pointe en plastique, parce que le chloroforme pourrait dissoudre certains bouts en plastique. - Graisses sèches sous un flux régulier de gaz argon. Faites pivoter lentement le flacon de verre lors de l'application du gaz argon pour former une fine couche de film sec.
- Mettre les échantillons sous un lyophiliseur sous vide pendant la nuit pour enlever l'excès de chloroforme.
- Reconstituer les lipides en ajoutant 1 ml de tampon au film séché et vortexles les mélanges pendant 5 min. Hydratez les mélanges lipidiques en se balançant pendant 1 h à 25 oC.
REMARQUE: L'échantillon sera très turbide lors de l'ajout du tampon à la couche de film séché de lipides. - Effectuez cinq cycles de gel/dégel en alternant en plaçant le flacon de l'échantillon entre une eau glacée (4 oC ou moins) et un bain d'eau chaude (25 oC ou plus).
- Placez le flacon d'échantillon dans le bain à ultrasons et sonicate l'échantillon pendant environ 0,5 h ou jusqu'à ce que l'échantillon devienne semi-transparent.
- Extruder les échantillons à l'aide de l'ensemble d'extrudeur lipidique. Assembler le kit d'extrusion comme indiqué dans les instructions du fabricant. Extrudez les échantillons à l'aide de papier filtre de 0,1 m. Chargez les échantillons dans une seringue en verre et attachez-les à une extrémité de l'appareil d'extrusion. Ajouter une seringue vide à l'autre extrémité de l'appareil d'extrusion. Poussez d'avant en arrière 10 à 20x jusqu'à ce que vos échantillons deviennent entièrement transparents.
- Faire tourner les échantillons finaux pendant 30 min à 20 000 x g pour enlever les gros agrégats.
- Utiliser la diffusion dynamique de la lumière (DLS) pour déterminer la taille et l'homogénéité des liposomes (facultatif). Placez 30 liposomes dans un lecteur de plaque de puits de 384. Faire tourner la plaque à 1 000 x g pendant 30 min. Placez la plaque dans un lecteur de plaque et recueillez 10 mesures de diffusion de la lumière.
- Caractérisation kraS4b-FMe liant aux liposomes par résonance plasmon de surface (SPR)
- Assembler les matériaux requis : un instrument SPR; puce de capteur L1; tubes flacons de 7 x 14 mm; et CHAPS.
- Préparer un tampon contenant 20 mM HEPES (pH 7,3), 150 mM NaCl, 1 mM TCEP. Préparer une série de dilution 2:1 de KRAS4b-FMe à partir de 60 M-0,06 M dans un volume total de 200 L (10 titrations au total). Transférer les échantillons dilués finaux dans des tubes de flacon (voir Tableau des matériaux),placer les tubes de flacon dans un rack, et insérer les échantillons dans l'instrument SPR.
- Insérez la puce du capteur L1 dans l'instrument SPR. Fixez le tampon et amorcez le système avec un tampon pendant 7 min.
- Configurez une méthode automatisée comme suit :
- Fixer la température de l'instrument à 25 oC.
- Activez la puce du capteur L1 en la rinçant à l'injection de deux injections de 20 mM de 20 mM de CHAPS dissous dans l'eau à un débit de 30 l/min.
- Effectuez des cycles de démarrage de dix injections de 1 min de tampon de fonctionnement pour hydrater la surface de la puce.
- Déposez les liposomes sur la puce du capteur L1 en injectant les liposomes sur la cellule d'écoulement (FC)-2 de la puce L1 avec des injections de 2 min à 5 l/min. Visez un niveau de capture d'au moins 3 000 unités d'intervention (REU).
REMARQUE : Augmentez le temps d'injection jusqu'à ce que vous atteigniez le niveau de capture approprié.
- Déposez les liposomes sur la puce du capteur L1 en injectant les liposomes sur la cellule d'écoulement (FC)-2 de la puce L1 avec des injections de 2 min à 5 l/min. Visez un niveau de capture d'au moins 3 000 unités d'intervention (REU).
- Injecter trois cycles de tampon sur les deux FC-1 et FC-2 avec des injections de 1 min à 30 l/min.
- Injectez les différentes titrations KRAS4b-FMe de la série de concentration la plus basse à la plus élevée. Injecter les protéines à l'aide d'injections de 1 min pour la phase d'association et de 2 min d'injections pour la phase de dissociation à un débit de 30 l/min sur les deux FC.
- Régénére la puce du capteur L1 en la rinçant avec deux injections de 1 min de 20 mM CHAPS à 30 l/min.
- Adapter les données à l'aide du logiciel d'évaluation SPR à l'aide d'un modèle de liaison de site unique pour obtenir des affinités de liaison apparentes (voir la section Discussion pour une explication de l'ajustement des données).
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Representative Results
L'une des variables les plus importantes du protocole est la quantité de protéines cibles exprimées (His6-MBP-tev-KRAS4b). Ce protocole a été développé à l'aide d'un isolat d'une lignée de cellules Trichoplusia ni, Tni-FNL17, adapté pour la croissance de la suspension et scié à partir de sérum. Étant donné la vaste gamme de résultats rapportés à travers les différentes lignées de cellules d'insectes avec le système d'expression du baculovirus, il est conseillé que Tni-FNL soit utilisé, au moins au début, pour produire KRAS4b-FMe.
Une protéine foncée qui migre vers 65 kDa devrait être évidente dans le lysate clarifié ainsi que les fractions d'élution (Figure 1A). La protéine de fusion devrait être l'une des deux bandes tachées les plus importantes du lysate, l'autre étant la FNTA/B co-exprimée qui comigre à 48 kDa.
Dans le cadre de la purification, l'étape CEX est essentielle pour deux raisons : 1) elle sert à réduire l'étendue de la protéolyse car la région hypervariable (HVR) est assez sensible, et 2) elle enrichit pour la protéine entièrement traitée comme indiqué dans les notes pour cette étape du protocole. C'est toutefois la partie la plus compliquée du protocole. C'est parce que la protéine transformée a tendance à se précipiter à des concentrations de sel plus faibles, même fusionné à MBP. Heureusement, ce n'est pas un phénomène tout ou non, et il a également lieu un peu lentement au fil du temps. Le protocole en profite en dialysant à 200 mM NaCl avant l'étape CEX. À cette concentration, les précipitations n'étaient pas aussi importantes qu'à 100 mM. Par conséquent, le protocole est conçu pour limiter la durée de la protéine est dans un tampon de cette concentration de sel. Le mélange de petits aliquots de la charge de colonne CEX avec des volumes égaux de tampon zéro-sel immédiatement avant le chargement de la colonne limite l'exposition (en termes de temps) à de faibles conditions de sel et limite ainsi les précipitations. La figure 2A représente le résultat le plus typique de l'étape CEX, le plus important étant le pic 3, qui contient principalement KRAS4b-FMe. La figure 2B montre les profils d'élution qui ont été observés pour donner une idée de la variabilité des résultats de la procédure. Étant donné qu'elles peuvent parfois être trompeuses, il est prudent de créer des piscines de tous les pics et de les stocker à -80 oC jusqu'à ce que le pic d'intérêt ait été entièrement purifié et réussi des tests de qualité.
Comme il est indiqué dans le protocole, l'utilisation des colonnes HiPrep SP Sepharose High Performance semble essentielle pour atteindre la séparation observée à la figure 2A. Bien qu'il ne soit pas encore clair pourquoi le pic trois ports fréquemment farnesylated seulement KRAS4b en plus de la désirée farnesylated et carboxymethylated KRAS4b, la mauvaise résolution d'autres ont rapporté avec des résines CEX alternatives (communication personnelle) suggère que ce phénomène n'est pas seulement le résultat d'interactions ioniques.
Les rendements typiques variaient de 1 à 6 mg/L, avec 3 à 5 mg/L atteints fréquemment (90 %, n., 50). L'analyse de masse intacte à l'aide d'ESI-MS a confirmé la masse moléculaire précise des protéines et donc la proportion relative de farnésylation et/ou de carboxyméthylation (Figure 3). Bien que les lots finaux typiques contenaient certains KRAS4b-FARN détectables, cette proportion était inférieure à 15 % en termes de hauteur maximale de cette analyse. La figure 3A montre des données représentatives pour KRAS4b qui ne sont pas prélinées exprimées dans E. coli, la figure 3B montre KRAS4b-FMe eluted dans les pics 3 et 5 de CEX, et la figure 3C montre KRAS4b-Farn eluted dans le pic 2 de CEX.
La masse du KRAS4b liée au PIB a également été déterminée pour ces échantillons à l'aide d'analyses de masse indigènes (figure 3D). L'échange des échantillons en acétate d'ammonium a assuré une ionisation « plus douce » et le complexe indigène est resté intact, fournissant la confirmation de la nature du nucléotide lié à KRAS4b.
Pour valider que la farnésylation et la carboxyméthylation sont nécessaires pour que KRAS4b-FMe se lie aux membranes, nous avons mesuré l'interaction de KRAS4b-FMe aux liposomes via SPR. Comme le montre la figure 4, KRAS4b-FMe lié aux liposomes alors que kraS4b non transformé ne l'a pas fait, démontrant ainsi que le KRAS4b-FMe traité est nécessaire pour l'interaction avec les membranes.
Figure 1 : Gels SDS-PAGE du processus de purification. (A) Capture IMAC du lysate. FNTA/B sont les bandes sombres qui migrent à 48 kDa et le His6-MBP-tev-KRAS4b est la bande sombre qui migre à 67 kDa. Échelle de poids moléculaire de M et de protéine ; T - protéines totales; Charge de lysate/colonne clarifiée l'a l.; F - flux de colonne à travers. Les fractions sont élucées avec un gradient croissant de concentration d'imidazole. (B) Les fractions CEX étiquetées 1 à 5 correspondent aux fractions maximales des pics d'élution indiqués dans le chromatogramme de la figure 2. (C) digestion TEV et deuxième IMAC. C - piscine du clivage CEX étape pré-TEV; Clivage l'échantillon de charge post-TEV. Les espèces d'intérêt sont étiquetées. (D) Un et cinq microgrammes de protéine KRAS4b-FMe finale. Les gels représentés sont des résultats représentatifs de plusieurs productions. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 2 : Profil d'élution de chromatographie CEX. (A) Le profil d'élution CEX typique a quatre à cinq pics majeurs. Mis à part le pic 1, qui est généralement une forme protéolysée de KRAS4b non transformés dépourvus des quatre acides aminés C-terminal, les quatre pics numérotés 2 à 5 dans le résultat du panneau de la variabilité dans le traitement de la N- et C-termini de la protéine, avec progressivement plus positivement chargé molécules éluter plus tard dans le gradient (voir l'étape 1.15). (B) Exemples supplémentaires de profils d'élution CEX. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 3 : Analyse de spectrométrie de masse intacte et indigène des protéines KRAS4b purifiées. Spectre de masse intact et résultats d'analyse de pointe déconvolés pour (A) KRAS4b 2-185 non transformés, MW prévu 21 064; (B) KRAS4b 2-185-FMe, pics 3 et 5 de CEX, MW prévu 21 281; (C) KRAS4b 2-185-Farn, pic 2 de CEX, a prédit MW 21 267. (D) Analyse de pointe décongestionnelle de masse autochtone pour E. coli exprimée KRAS4b 2-185 (i), KRAS-FMe 2-185 (ii), et KRAS-Farn 2-185 (iii), tous dans l'état lié au PIB-nucléotide. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
Figure 4 : Liaison KRAS4b-FMe aux liposomes via SPR. Distribution de taille de 70:30 POPC:POPS liposomes obtenus par DLS. (A) Les données DLS montrent un diamètre moyen de 200 nm pour les liposomes avec une polydispersité de 18%. (B) Capteurs de liaison SPR de 60 à 0,6 M KRAS4b-FMe à 70:30 liposomes capturés sur une puce L1 capteur. (C) Ajustement des isothermes contraignants d'état réguliers dérivés des données de SPR a fourni un KD apparent de 1 M de KRAS4b-FMe liant aux liposomes. La réponse de liaison est normalisée en divisant par le niveau de capture de surface des liposomes. (D) Cinétique de liaison SPR de 60 à 0,6 M KRAS4b-2-185 à 70:30 liposomes capturés sur une puce L1 capteur. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
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Discussion
Comme indiqué dans la section Résultats représentatifs, l'étape la plus critique pendant la purification est la manipulation de l'échantillon pendant le temps qu'il est dans le sel inférieur. Limiter le temps d'exposition de l'échantillon à moins de 200 mM NaCl contribuera à réduire les précipitations et à augmenter le rendement de l'échantillon. L'interprétation des résultats du CEX peut être difficile si le profil ne correspond pas aux attentes (voir la figure 2). Jusqu'à ce que le protocole soit devenu courant, il est conseillé que les fractions d'élution CEX qui ne sont pas prises en avant soient stockées à -80 oC jusqu'à ce que l'analyse de masse intacte ait été effectuée pour s'assurer que le matériel approprié a été avancé. En dehors des paramètres mentionnés ci-dessus pour l'étape CEX, le protocole est relativement facile à modifier aux étapes de la lyse et de l'IMAC. Il est également intéressant de noter qu'il n'y a pas de chromatographie d'exclusion de taille (SEX) étape de séparation dans le protocole. Ceci est omis en raison des pertes que nous avons observées au cours de l'élaboration précoce de la méthode (résultats non publiés). Il est à noter que ces pertes ne sont pas observées lorsque la protéine est en complexe avec des nanodisques, ce qui suggère que la perte en l'absence de lipides est due à l'interaction hydrophobe entre la protéine et la résine.
Cette méthode représente une grande augmentation à la fois de la quantité (-10x plus élevé) et de la qualité (par rapport à la bonne foi traitées KRAS4b exprimé dans les cellules humaines) qui a été rapporté dans la littérature14,18,19. Le rendement de 3 à 5 mg/L a permis des efforts de biologie structurelle qui nécessitent des besoins élevés en protéines16,20. D'autres modifications post-traduction napas pour d'autres membres de la famille RAS ainsi que d'autres modifications post-traductionnelles en général sont actuellement à l'étude.
Pour l'analyse de masse intacte de KRAS4b, une concentration de 0,1 mg/mL fonctionne bien. Des concentrations plus faibles peuvent être utilisées en raison de la capacité de la configuration de protéines détendue à accepter des charges. Cependant, dans l'analyse de masse indigène, où la protéine est dans sa conformation pliée indigène, il y a des rapports de masse-charge plus bas et des concentrations plus élevées sont exigées. Ainsi, l'utilisation de concentrations plus faibles de protéines entraîne une diminution du signal et produit des résultats moins fiables. L'avantage de la spectrométrie de masse indigène est que le tampon est compatible avec la conservation du complexe de nucléotide lié à KRAS4b. Par conséquent, il est possible de confirmer les formes liées aux nucléotides des protéines (figure 3D). Comme pour toute analyse de spectrométrie de masse, des pertes neutres (comme un groupe méthyle) sont observées (voir espèces mineures avec une perte de 18 dans l'analyse de masse intacte, Figure 3A-C). Dans l'analyse de spectrométrie de masse indigène, les adducteurs de protéine avec Naou K,présents après l'échange étendu de tampon, peuvent être observés. C'est ce qui ressort des pics mineurs de 23 à la figure 3D, panneaux i-iii).
Nos données SPR (Figure 4) montrent que la forme entièrement traitée de KRAS4b est nécessaire pour récapituler l'interaction KRAS4b-membrane in vitro. Un avantage majeur de l'utilisation de la puce L1 pour capturer les liposomes dans nos expériences SPR est que la surface de puce L1 est dextran enduit et modifié avec des groupes lipophiles21, permettant ainsi la capture directe des liposomes sans aucune autre modification. SPR est une technique puissante pour étudier les interactions ligand-ligand fournissant des informations sur la stoichiométrie et l'affinité contraignante. Les capteurs qui fonctionnent correctement devraient avoir une phase d'association qui atteint un état stable. Cette réponse de liaison maximale (Rmax) fournit une estimation de la stoichiométrie pour l'interaction. Le taux de dissociation devrait suivre une seule désintégration exponentielle, en supposant une interaction de liaison 1:122. Cependant, les protéines se liant à une surface de membrane se produisent habituellement avec des stoichiométries plus complexes23 et des affinités multiples qui ont comme conséquence des sensorgrammes avec la cinétique plus complexe. Nous n'avons pas réussi à adapter la cinétique à un modèle de liaison multisite. Cependant, les isothermes de liaison d'équilibre peuvent être adaptés à l'aide d'un logiciel d'évaluation commerciale pour fournir une affinité de liaison d'équilibre apparente (KD). Quoi qu'il en soit, nos données SPR font clairement la distinction entre la façon dont KRAS4b non transformé et KRAS4b-FMe se lient aux liposomes. Ainsi, SPR fournit toujours un outil utile dans le déchiffrement des interactions protéines-lipides.
Collectivement, en utilisant SPR nous démontrons que KRAS4b-FMe entièrement traité est nécessaire pour la liaison de membrane. La production de la forme entièrement farnédylated et carboxymethylated de KRAS4b utilisant cette approche fournit la quantité et la qualité du matériel nécessaire pour la biologie structurale20,la caractérisation biophysique des interactions de membrane23,et les études de criblage contre le complexe KRAS4b-FMe:RAF en présence des bicouches de lipide.
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Disclosures
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Acknowledgments
Nous reconnaissons le soutien au clonage et à l'expression de Carissa Grose, Jen Melhalko et Matt Drew du Protein Expression Laboratory, Frederick National Laboratory for Cancer Research. Ce projet a été financé en totalité ou en partie par des fonds fédéraux de l'Institut national du cancer, National Institutes of Health, dans le cadre du contrat no. HHSN261200800001E. Le contenu de cette publication ne reflète pas nécessairement les points de vue ou les politiques du ministère de la Santé et des Services sociaux, et la mention des noms commerciaux, des produits commerciaux ou des organisations n'implique pas nécessairement l'approbation par le gouvernement des États-Unis.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.8 mL Safe-Lock Tubes, Natural | Eppendorf | 22363204 | |
| 11 mm Cl SS Interlocked Insert Autosampler Vials | Thermo Scientific | 30211SS-1232 | |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phosphocholine (POPC) | AVANTI POLAR LIPIDS | 850457 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 1-palmitoyl-2-oleoyl-glycero-3-phospho-L-serine (POPS) | AVANTI POLAR LIPIDS | 840034 | purchase as liquid stocks in chloroform |
| 5427R Centrifuge | Eppendorf | ||
| Acetonitrile, HPLC Grade | Fisher Chemical | A998-1 1L | |
| Ammonium Acetate | Sigma-Aldrich | 09689-250g | |
| Argon gas | Airgas | ARUP | |
| Assay Plate 384 | CORNING | 3544 | |
| Biacore T200 Instrument | GE Healthcare | ||
| Blue Snap-It Seals, T/S | Thermo Scientific | C4011-54B | |
| Branson Ultrasonic Bath | Thermo Fisher | 15-336-1000 | |
| Cation Exchange Chromatography (CEX) column | GE Healthcare Life Sciences | 29018183 | HiPrep SP Sepharose High Performance |
| CHAPS | Sigma | C3023 | |
| Dyna Pro Plate Reader | Wyatt Technologies | ||
| Exactive Plus EMR Mass Spectrometer | Thermo Scientific | ||
| Formic Acid | Sigma-Aldrich | F0507-500Ml | Use Reagent Grade or better |
| Gilson vials 7x14 mm Tubes | GE Healthcare | BR-1002-12 | |
| Glass screw thread vials with PTFE foam liners | Scientific Specialities | B69302 | |
| High speed/benchtop centrifuge | Thermo Fischer Scientific | 05-112-114D | capable of up to 4,000 xg |
| His6-Tobacco Etch Virus (TEV) protease | Addgene | 92414 | Purified as per Raran-Kurussi et al. (2017) Removal of Affinity Tags with TEV Protease. In: Burgess-Brown N. (eds) Heterologous Gene Expression in E.coli. Methods in Molecular Biology, vol 1586. Humana Press, New York, NY |
| Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) column | GE Healthcare Life Sciences | 28-9365-51 | HisPrep FF 16/10 |
| In-House Water Supply, Arium Advance | Sartorius Stedim | Resistivity of 18 MΩ0-cm | |
| Lipid extruder set with holder | AVANTI POLAR LIPIDS | 610023 | |
| Liquid nitrogen | Airgas | NI-DEWAR | |
| M110-EH microfluidizer | Microfluidics | ||
| MabPac RP UHPLC Column, 4 um, 3.0 x 50 mm | Thermo Scientific | 088645 | |
| MabPac SEC-1 Column, 5 um, 300 Å, 2.1 x 150 mm | Thermo Scientific | 088790 | |
| MagTran software | Thermo Scientific | ||
| Methanol, HPLC Grade | VWR Chemicals | BDH20864.400 | |
| NGC Chromatography System | BioRad | 78880002 | NGC QuestTM 100 Chromatography system |
| Protease Inhibitor Cocktail without EDTA or other chelators | Millipore Sigma | P8849 | |
| Rubber Caps type 3 | GE Healthcare | BR-1005-02 | |
| Series S Sensor Chip L1 | GE Healthcare | 29104993 | |
| Spectrophotometer | Thermo Fischer Scientific | 13-400-519 | Absorbace at 280nm |
| Ultra-15 Centrifugal Filter Units, 10K NMWL | Millipore Sigma | UFC901008 | PES membrane |
| Ultracel 10K MWCO Ultra 0.5 mL Centrifuge Filters | Amicon | UFC501024 | |
| Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima - L80K | capable of 100,000 xg |
| Vanquish UHPLC (Pump, Column Hearter, and LC System) | Thermo Scientific | ||
| Vortex Genie 2 | Fisher | 12-812 | |
| Water, HPLC Grade | Sigma-Aldrich | 270733-1L | May use in-house water source (see below) |
| Whatman GD/XP PES 0.45 mm syringe filter | GE Healthcare - Whatman | 6994-2504 | |
| Xcalibur QualBrowser | Thermo Scientific | proteomics software |
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