Summary
نحن نقوم بوصف طريقه للتتبع العكسي للخلايا العصبية للمحركات الجنينية باستخدام اصباغ فلورية للدهون.
Abstract
نحن وصف تقنيه لوضع العلامات إلى الوراء من الخلايا العصبية الحركية في دروفيبيلا. نستخدم صبغه زيتية ذائبه بالزيت ونقدم قطره صغيره إلى اعداد الشرائح الجنينية بواسطة الحاقن المجهري. يمكن بعد ذلك تسميه كل الخلايا العصبية الحركية التي يتم الاتصال بها بواسطة القطيرات بسرعة. يتم تسميه الخلايا العصبية الحركية الفردية بشكل مستمر ، مما يتيح التفاصيل الهيكلية الدقيقة ليتم تصورها بوضوح. النظر إلى ان الاصباغ محبه للدهون تاتي في ألوان مختلفه ، وتقنيه يوفر أيضا وسيله للحصول علي الخلايا العصبية المجاورة المسمية في متعدد ألوان. التالي فان تقنيه التتبع هذه مفيده لدراسة نشاه الخلايا العصبية والاتصال المتشابك في نظام الخلايا العصبية الحركية من دروفويلا.
Introduction
يوفر نظام الخلايا العصبية الجنينية للمحركات نموذجا تجريبيا قويا لتحليل أليات الكامنة وراء تطور الجهاز العصبي المركزي (CNS)1،2،3. نظام الخلايا العصبية الحركية قابل للتقنيات البيوكيميائية والجينية والتصويرية والكهربية. باستخدام التقنيات ، يمكن اجراء التلاعب الجيني والتحليلات الوظيفية علي مستوي الخلايا العصبية أحاديه المحرك2،4،5،6.
خلال التطور المبكر للجهاز العصبي ، والانفجارات العصبية الانقسام وتوليد عدد كبير من الخلايا العصبية والعصبية. وقد تم التحقيق سابقا في العلاقة المكانية بين الفصل والتعريف الجيني للتعبيرات العصبية في التفاصيل7،8،9. في حاله نظام الخلايا العصبية الحركية ، تمت دراسة تشكيل الوصلة العصبية العضلية الجنينية (nmj) علي نطاق واسع باستخدام aCC (خليه الزاوية الاماميه) ، RP2 (الجمبري الخام 2) ، والخلايا العصبية RP5 موتور2،10. علي سبيل المثال ، عندما تشكل الخلايا العصبية الحركية RP5 تقاطع متشابك الوليدة ، يتم مزج filدستور قبل متشابك وبعد متشابك11،12،13. مثل هذه الاتصالات الخلوية المباشرة أمر حيوي للبدء في تشكيل NMJ. علي عكس ما نعرفه عن فروع العصب المحيطيه ، معرفتنا كيف المحرك تشعبات بدء الاتصال متشابك داخل الاجهزه العصبية الخاصة لا تزال بدائية.
في هذا التقرير ، نقدم تقنيه تسمح بوضع العلامات الارتجاعية للخلايا العصبية الحركية في الاجنه عن طريق تقديم الاصباغ المضادة للدهون بواسطة الماصات المجهرية. هذه التقنية تمكننا من تتبع الخلايا العصبية الحركية 38 العصب كل من عضلات جدار الجسم 30 في الجزء هيمي في 15 ح بعد وضع البيض (AEL)14. باستخدام هذه التقنية ، وقد حققت مجموعتنا بدقه العديد من المكاسب من وظيفة/فقدان الوظيفة الاليلات15،16،17. وقد كشفنا مؤخرا أليات الجزيئية التي تدفع بدء الاتصال تغصن المحرك وأظهرت ان التفاعل Dscam1-قفص-باك يعرف موقع النمو تغصن في الخلايا العصبية الحركية aCC17. بشكل عام ، هذه التقنية قابله للتكيف مع التحليل الظاهري لأي من الخلايا العصبية الحركية الجنينية في السلالات البرية أو المتحولة ، مما يعزز قدرتنا علي توفير رؤى جديده في التصميم الوظيفي للجهاز العصبي دروفويلا .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1-المعدات واللوازم
- مواد لجمع الاجنه وتدريب البالغين علي وضع البيض
- اعداد جهاز الترشيح عن طريق قطع أنبوب 50 mL وفتح فتحه ثقب في الغطاء لتعيين فلتر شبكه مع المسام من 100 μm (جدول المواد) في ما بين الأنبوب والغطاء.
ملاحظه: بدلا من ذلك ، يمكن استخدام مصافي الخلية مع المسام من 100 μm (جدول المواد) لخطوه الترشيح لجمع الاجنه. - جعل لوحات أجار مع العنب أجار بريميكس (جدول المواد) وفقا للتعليمات المذكورة. لفتره وجيزة ، ويحرك برفق 1 حزمه من مسحوق مزيج في 500 مل من درجه حرارة الغرفة (RT ، 23 درجه مئوية) dH2س والميكروويف المخلوط المذاب ليغلي قويه. بعد يبرد إلى 70 − 75 [ك], يصب الخليط داخل [بتري] اطباق (60 [م]). بعد ان وطدت أجار ، وتخزين لوحات في 4 درجه مئوية.
- اعداد عجينه الخميرة عن طريق خلط الخميرة الجافة النشطة (جدول المواد) والماء إلى الاتساق عجينه ، والحفاظ علي 4 درجه مئوية.
- استخدام أقفاص جمع البيض (ل 60 mm طبق بيتري ، جدول المواد) التي توفر ما يكفي من تدفق الهواء.
- اعداد جهاز الترشيح عن طريق قطع أنبوب 50 mL وفتح فتحه ثقب في الغطاء لتعيين فلتر شبكه مع المسام من 100 μm (جدول المواد) في ما بين الأنبوب والغطاء.
- اعداد ابر التشريح وحقن الصباغ ميكروبيفتس
- اعداد حقن الصباغ ميكروماص وابره تشريح من نفس الأنابيب الشعرية مع القطر الداخلي من 0.6 مم والقطر الخارجي من 1.2 مم (جدول المواد). سحب الأنابيب الشعرية بواسطة ساحبه ميكروماص في 7 ٪ من 170 V الإنتاج الأقصى (جدول المواد) لإنشاء ابره حاده مع تفتق من ~ 0.4 سم في الطول.
- لحقن الصبغة ، اضبط الماصة المجهرية باستخدام الماص المجهري (جدول المواد) بواسطة تقنيه الشطف بالفقاعات الموصوفة في دليل الاداه.
- باختصار ، نقع في طاحونة مع وكيل ترطيب (جدول المواد) لمنع المياه من ' سحب ' غيض ابره. ضع الابره علي مشبك الماصات المجهرية في الساعة 25 − 30 درجه واخفض الطرف إلى ثلثي نصف القطر من وسط سطح الشطف. طحن الابره في حين حقنه مع أنابيب يدفع الهواء إلى الابره ، لضمان ان الماصات الدقيقة سوف تكون واضحة من نجاره الزجاج.
- ضع علامة علي الماصة الصغيرة مع علامة دائمة بطرف رفيع للاشاره إلى موضع الفتحة عند الطرف بعد الشطف حيث انه من الصعب تحديد مكان الفتحة الضيقة للماصة المجهرية التي تتشكل بزاوية.
2. التحضير لجمع الاجنه
- التاكد من ان الذباب الكبار (20 − 40 البرية من نوع كانتون-S أو الذباب الأبيض ) ، الذكور والإناث ، والحفاظ علي الشباب (< 7 أيام) والظروف الصحية لجمع البيض المثالي.
ملاحظه: لتحفيز زرع البيض ، يتم تدريب الذباب في قفص جمع البيض قبل بضعة أيام من جمع البيض علي لوحات أجار سترمل مع معجون الخميرة علي الأقل مره واحده كل يوم.
3. الجنين التدريج
- السماح لذباب لوضع البيض بين عشيه وضحيها (أو علي الأقل 15 ح) في RT لجمع الاجنه في 15 ح AEL ، اي المرحلة 1618، لعرض dendritogenesis من لجنه التنسيق الاداريه و RP3 الخلايا العصبية الحركية. في الصباح ، وجمع لوحه مع البيض.
ملاحظه: الاجنه في 15 ح AEL سيكون لها منفصلة 4-غرفه الأمعاء18. للتصوير مراحل مختلفه تتبع المعايير المورفولوجية المحددة وظروف الشيخوخة. - لجمع الاجنه ، ديتشوريوناتي البيض وضعت علي لوحه مع التبييض 50 ٪ لمده 5 دقائق.
- مره واحده وقد مسح المشيمة ، صب محتويات لوحه من خلال جهاز الترشيح أو مصفاه الخلية لعزل الاجنه. باستخدام زجاجه الضغط من الماء ، تمييع التبييض اليسار علي لوحه وجمع أكبر عدد ممكن من الاجنه عن طريق الخلط بين الخليط في فلتر.
- اغسل الاجنه علي الفلتر 3 − 4x مع المزيد من الماء أو حتى تبدد رائحة المبيض. أزاله فلتر من الجهاز وغسل الاجنه علي لوحه نظيفه أخرى مع الماء. Decant الماء من لوحه جديده ان الاجنه علي.
- اعداد شريحة زجاجيه من خلال تغطيتها مع طبقتين من الشريط الفينيل في المركز ، وتشكيل مستطيل. قطع حوض مستطيل من الشريط باستخدام شفره الحلاقة. ضع شريطا رفيعا علي الوجهين باتجاه الطرف العلوي للمسبح ، وهذا هو المكان الذي ستوضع فيه الاجنه كما هو مبين في الشكل 1.
- باستخدام ملقط دقيق ، حدد بشكل فردي 5 − 10 أجنه في 15 h AEL ووضعها علي الشريط علي الوجهين مع الجانب الظهري الذي يواجه. أضافه المالحة الحشرات الرنين19 إلى تجمع تشريح لحماية الاجنه من التجفيف (الشكل 1).
4. تشريح وتلطيخ
- باستخدام ابره الزجاج تحت المجهر تشريح (جدول المواد) ، وقطع من خلال خط الوسط من جنين واحد علي سطحه من الخلفي إلى نهايته الاماميه. ثم اسحب الجنين من الغشاء المحيه من الشريط علي الزجاج (محاصر في الشكل 1). يجب الحرص علي عدم اتلاف الانسجه الداخلية للجنين.
- قلب الانسجه الظهاريه من المركز ونعلق حافه البشرة علي سطح الشريحة الزجاجية (الشكل 1، أقحم).
- باستخدام ابره متصلة أنبوب مع فتح غيض من ~ 300 μm (التي أعدتها كسر غيض رقيقه من ابره تشريح) ، يستنشق أو ضربه الهواء لفصل وأزاله جذوع الرغامي طوليه الظهرية ، فضلا عن اي الشجاعة المتبقية.
- استخدم 4% بارافورمالدهيد (PFA) في محلول ملحي الفوسفات المخزن لإصلاح الاجنه لمده 5 دقائق في RT. غسل الاجنه 3x مع تلفزيوني.
- وصمه عار الاجنه مع 1 μL من مكافحه الفجل البيروكسيديز الأجسام المضادة مترافق مع سيانين 3 صبغ (المضادة لCy3) (جدول المواد) في 200 μl من تلفزيوني ل 1 ح. غسل الاجنه مع تلفزيوني 3x بعد تلطيخ.
ملاحظه: يمكن تغيير صبغ المضادة لل-الأس علي أساس الاصباغ محبه للدهون من اختيار للحقن.
5. ملء الحقن مايكرو الماصة
- الاصباغ الحرارية محبه للدهون (5 ملغ/مل من ديو أو فعل ، جدول المواد) إلى 60 درجه مئوية في 1:10 خليط من الايثانول: الزيوت النباتية قبل الاستخدام.
- قم بتحضير شريحة صبغ ذائبه بالزيت لماصه الحقن المجهرية. ضع الماصة المجهرية في حامل الشعيرات الشعرية (الشكل 2، #1). باستخدام المعالجة الدقيقة (جدول المواد) ، اضبط الماصة الصغيرة لتكون فوق شريحة الصبغة. ثم اضبط المرحلة لوضع الماصة علي الصبغة (الشكل 2، #2).
- لتعبئة الماصات الدقيقة ، استخدم الحاقن المجهري (جدول المواد) (الشكل 2، #3). جمع الصبغة في ميكروماص عن طريق وضع Pi (ضغط الحقن) بين 200 − 500 hPa (هكتوباسكال) ، Ti (وقت الحقن) بين 0.1 − 0.5 s و Pc (ضغط التعويض) إلى 0 hPa لمده 5 دقائق (الشكل 2، #4).
- مره واحده وقد تم جمع الصبغة ، وأزاله الشريحة صبغ ووضع العينة علي مرحله المجهر. المقبل ، وزيادة Pc إلى مجموعه من 20 − 60 hPa قبل خفض الماصة في العينة لمنع تلوث برنامج تلفزيوني عن طريق العمل الشعرية.
6. صبغ حقن في الخلايا العصبية
- حدد موقع الجنين في المركز باستخدام المجهر مع عدسه موضوعيه 10x (جدول المواد) ومحاذاة الماصات الدقيقة مع الجنين.
ملاحظه: يمكن تعديل حجم قطره الصبغة عن طريق تغيير Pi أو حجم فتحه طرف الماصة المجهرية. يجب ان تكون القطرات من 10 − 20 ميكرومتر ، وهو ما يقرب من عرض 1 العضلات. - تغيير عدسه الهدف إلى الغمر المياه 40x عدسه (جدول المواد) وتحت دمج العدسة في الاذاعه التلفزيونية لرؤية الجنين.
- استخدام المجهر الفلوري للتحقق من التشكل الخلايا العصبية التي تميزت المضادة لCy3 وتحديد موقع الحقن.
- اثناء الحقن ، استخدم المجهر الميداني لرؤية الصبغة التجميعية. عندما يكون الجنين في التركيز ، تغيير موقف الماصة لاجراء اتصال لطيف مع غيض من محور الاهتمام (علي سبيل المثال ، aCC ، RP3).
- إسقاط الصبغة في البطن اليمني (A2 − A6) هيمي-الجزء في التقاطع العصبي العضلي للجنة التنسيق الاداريه أو RP3 (الشكل 3) مع اما فعل أو ديو ، باستخدام الخلايا العصبية التي تميزت مكافحه الCy3. باستخدام السيطرة علي اليد (الماوس; الشكل 2، 5) الإفراج عن صبغه وأزاله ميكروماص بعد إسقاط الصبغة مع الجزئي والانتقال إلى موقع الحقن المقبل.
ملاحظه: خلافا لغيرها من الاصباغ (علي سبيل المثال ، إبليس الأصفر ، calcein) التي انتشرت في الخلايا المجاورة من خلال تقاطعات الفجوة ، الاصباغ محبه للدهون المنتسبين مع اغشيه الخلايا ولا نقل إلى الجيران. نظرا للحجم الكبير نسبيا من الصبغة الحبريه ، ومع ذلك ، هذه التقنية أيضا نتائج في وضع العلامات علي العضلات الشريكة (الشكل 3ا).
- احتضان العينة في RT لمده 1 ساعة بعد صبغ قطره قبل التصوير.
ملاحظه: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا قبل التركيب ، ويمكن الاحتفاظ بالعينة عند 4 درجات مئوية بين عشيه وضحيها. يمكن أيضا ان يتم تسليم الاصباغ lipophilic باستخدام الإدرار الأيوني ، إذا مكبر للصوت داخل الخلايا (DC) هو متاح بسهوله20.
7. التصوير مع المجهر البؤري
- أزاله الشريط علي الوجهين والشريط الفينيل من الشريحة الزجاجية مع مساعده من ملقط.
- اعداد زلة الغطاء (22 × 22 مم2 no. 1 غطاء الزجاج) مع كميه صغيره من الشحوم فراغ (جدول المواد) في الزوايا الأربع ومكان بعناية علي العينة ، وتجنب فقاعات الهواء. أزاله اي الزائدة التلفزيونية باستخدام مساحات المهام.
- اضغط باستمرار علي زلة الغطاء لضبط مسافة العمل بين العدسة الموضوعية والعينة. ختم تماما حواف زلة الغطاء مع طلاء الأظافر.
- صوره في التكبير 10x و 100x باستخدام المجهر البؤري.
- استخدام برنامج ImageJ لمعالجه الصور الخام من المجهر (جدول المواد).
ملاحظه: يجب ان تبدا المراقبة في غضون 10 دقيقه بعد التركيب للحصول علي أفضل الصور. خلاف ذلك ، في RT ، سوف تنتشر صبغه إلى المواقع المجاورة لموقع الحقن خلق خلفيه غير مرغوب فيها للتصوير. لإبطاء انتشار صبغ ، يمكن تخزين العينة في 4 درجه مئوية لبضع ساعات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ويظهر صوره تمثيليه لل aCC و RP3 الخلايا العصبية الحركية في الشكل 3ج لإظهار وسم متعدد ألوان من الخلايا العصبية الحركية في 15 ح AEL. المتحولات الخاصة بهم هي ثابته إلى حد كبير بين الاجنه. ويظهر نمط تلطيخ التي تم الحصول عليها مع الأجسام المضادة لمكافحه التناسل باللون الرمادي. تم إيداع قطره صغيره من ديو أو لم علي NMJ من العضلات 1 أو 6/7 ، علي التوالي. ويبين الشكل 4 القدرة علي قياس النمط الظاهري للفائدة كميا. أحصينا العدد الإجمالي لنصائح تغصن في نوع البرية ، مقارنه مع متحولة (علي سبيل المثال ، dscam1-/-).
الشكل 1: اعداد تجمع التشريح. يتم إنشاء غرفه زرقاء ينظر علي الشريحة الزجاجية مع شريط الفينيل حفظ المخازن المؤقتة في الداخل. الشريط علي الوجهين يحمل علي الاجنه التي يتم محاذاتها بشكل صحيح. كما يظهر في الركن الأيسر السفلي مثال علي الجنين الذي تم تشريحه في المحلول الملحي. النهاية الاماميه هي في الأعلى في هذا وجميع الأرقام اللاحقة. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: معدات حقن الصبغ. وتبين الملصقات الزجاجية الماصة في الشكل موقع تركيب الماصة الزجاجية (1). وقد تم تجهيز المجهر الفلوري-الفلورسنت مع مصدر ضوء LED وسلسله من مجموعات تصفيه. يتم تسميه الجزئي (2) والاجهزه الحقن المجهري (3) إلى اليمين من المجهر. الملحق هو عن قرب من عرض جهاز الحقن المجهري (4) مع القيم المناسبة من Pi، Ti، و pc). يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: الاستعدادات صبغ Lipophilic من الخلايا العصبية الحركية المسمية رجعي. (ا) الخلايا العصبية الحركية المسمية إلى الوراء وعضلاتها المستهدفة. العصبية الحركية aCC العضلات العصبي 1 (ديو: الاثاره/الانبعاثات ، 484 nm/501 nm) ؛ RP3 العصبية الحركية العضلات العصبية 6/7 (لم: الاثاره/الانبعاثات ، 644 nm/665 nm). لاحظ ان العضلات 6/7 أيضا تلقي تعصيب من آخر الخلايا العصبية الحركية (mnisnb/d-Is) في مراحل يرقات; ومع ذلك ، MNISNb/d-ليس لديه نظير الجنينية3. تشير الدوائر إلى مواقع تطبيقات الصبغة. (ب) رسم تخطيطي لعضلات جدار الجسم وفروع العصب المحيطي في 15 h AEL. ويتكون الحبل العصبي البطني (VNC) من التكرار القطعي والنيوروميري المتناظر ثنائيا فيما يتعلق بخط الوسط البطني (الخط المنقط). عضلات الجسم الجدار من كل الجزء هيمي هي inعصبيه بواسطة 38 الخلايا العصبية الحركية. الخلايا العصبية الحركية المشروع محاور بهم عبر سته فروع العصب الرئيسية (العصب الفاصل بين الأعصاب] ، SNa [العصب القطعي a] ، البنك القومي الصربي ، السلطة التشريعية ، SNd ، و TN [العصب العرضي]). (ج) الفروع الجذعية من الخلايا العصبية الحركية ACC و RP3 تظهر تداخل واسعه. كل من الخلايا العصبية هي الخلايا العصبية ثنائيه القطب ، وهذا يعني ان الخلايا العصبية إنشاء اثنين من السكان مختلفه من dendrites. كل مشاريع الخلايا العصبية شجره واحده في نيوروبيل المماثل واخر في نيوروبيل المعاكس. نصال الاشاره إلى التلميحات الجذعية. تم الحصول علي الصور الفلورية مع هدف 10x أو 100x النفط الغمر الهدف. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: لجنه التنسيق الاداريه التي كشفت مع وضع العلامات إلى الوراء في الاجنه ساعة-15. (ا) في النوع البري ، تمدد لجنه التنسيق الاداريه المنكرات إلى كل من نيوروبيلس الأضلاع والمعاكس. للبساطة ، ونحن فقط عرض التشعبات الأضلاع من لجنه التنسيق الاداريه في هذا الرقم. يتم تسميه aCC مع ديو ، كما هو موضح باللون الأخضر. (ب) في dscam1 المسوخ (dscam121/21 من الدكتور tzumin لي ، janelia البحوث الحرم الجامعي) ، ولجنه التنسيق الاداريه لديها عدد قليل من تشعبات التي لاحظت في معظم الحالات17. نصال عرض النصائح الجذعية. يرجى النقر هنا لعرض نسخه أكبر من هذا الرقم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
استخدام الوسم صبغ لدراسة المورفولوجية العصبية لديها العديد من المزايا علي تقنيات الخلايا الوراثية وسم. يمكن لتقنية وضع العلامات صبغ تقليل مقدار الوقت اللازم لوضع العلامات والتصوير من مورفولوجيس من الخلايا العصبية الحركية. عمليه وضع العلامات صبغ سريع جدا لأنه ياخذ اقل من 2 ح وتمكننا من تحديد الخطوط العريضة للإسقاطات العصبية. كبديل ، يمكن للمرء ان تصور الخلايا العصبية الحركية aCC عن طريق اختيار خط GAL4 الذي يعبر عن عامل النسخ الخميرة GAL4 في لجنه التنسيق الاداريه ، وعبوره مع البروتين الفلوري الأخضر (GFP) مراسل التي تسيطر عليها تسلسل التنشيط المنبع (UAS)21. تقنيه الوسم GFP علي هذا النحو يتطلب الصليب الوراثية ، التالي ، يستغرق بضعة أيام اضافيه.
ميزه أخرى من وضع العلامات صبغ هو السماح وسم غشاء البلازما في كثافة عاليه للغاية. وهناك كثافة كافيه من الاصباغ محبه للدهون يمكن ان تكون موجودة علي كل جزء من الغشاء ، مما يسمح لنا لحل التفاصيل الدقيقة للهيكل المسمي. وعلي النقيض من ذلك ، غالبا ما تعتمد كثافة جزيئات GFP علي فتره الانتظار بعد ركلات نظام GAL4. علي سبيل المثال ، يبدا aCC للتعبير عن GFP من 10 h AEL. بواسطة 15 ح AEL عندما نلاحظ, كثافة جزيئات GFP غير كافيه لتغطيه الغشاء بأكمله. فانه يؤدي إلى وضع علامات غير كافيه لإسقاطات الخلايا العصبية الدقيقة (دي ، بيانات غير منشوره).
علي الرغم من ان هذا الأسلوب يوفر العديد من المزايا ، فانه اقل فائده عندما الإسقاط خاطئه من محاور السيارات هو واضح. في غياب الجانبية، علي سبيل المثال ، تعرض الخلايا العصبية الحركية عيوبا شديده الاكسنال مثل المماطلة السابقة لأوانها ، وعبور الحدود القطعية ، والتشعب المفرط22. ونتيجة لذلك ، يصبح الوصول إلى محطه محور عصبي معينه مرهقه. كفاءه الوسم هو أيضا تعتمد علي العمر ، ويجري فعاله في الاجنه الأصغر من 20 ح AEL. كما البروتينات مصفوفة خارج الخلية زيادة مع التنمية ، والوسم من الخلايا العصبية الحركية يبدو معقدا للغاية.
التقنية الموصوفة هنا تسمح لنا بقياس العديد من المعلمات المورفولوجية مثل الطول الكلي العصبي والعدد ، ونمط فرع نيوريت وشكل15،16،17،23،24. لان الاصباغ كارسيانيني محبه للدهون تاتي في العديد من ألوان (مثل ديو ، ضياء ، دي ، لم ، ودير) ، ووضع العلامات متعدد ألوان من الخلايا العصبية الحركية المجاورة يمكن تحقيقها أيضا. كما هو مبين في الشكل 4، تشعبات من لجنه التنسيق الاداريه و RP3 الخلايا العصبية الحركية تتداخل علي نطاق واسع. لتعزيز فهمنا في تطوير حلبه السيارات ، سيتم التحقيق في أليات التفاعل dendrite-dendrite.
هنا ، ونحن بالتفصيل تقنيه تنوعا التي توفر وسيله لدراسة الاتصال العصبية في حلبه السيارات. علي الرغم من ان المظاهرة تقتصر علي لجنه التنسيق الاداريه و RP3 الخلايا العصبية الحركية في 15 ح AEL, ويمكن تطبيق هذه التقنية علي الخلايا العصبية الحركية الأخرى في مراحل مختلفه من النمو الجنيني. إذا كان يمكن الوصول إلى محطه محور عصبي مع ماص الحقن المجهري ، يمكن أيضا تطبيق هذه التقنية علي وضع العلامات علي اي الخلايا العصبية في مراحل اليرقات والكبار من الذباب أو حتى في الكائنات الحية الأخرى.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
وليس لدي المؤلفين ما يفصحون عنه.
Acknowledgments
نشكر أعضاء مختبر كامياما علي التعليقات علي المخطوطة. وقد تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد القومية للصحة R01 NS107558 (إلى M.I. ، K.B. ، و دي).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x objective lens | Nikon | Plan | |
| 40x water-immersion lens | Nikon | NIR Apo | |
| Capillary tubing | Frederick Haer&Co | 27-31-1 | |
| Confocal microscope | Andor | N/A | Dragonfly Spinning disk confocal unit |
| Cover glass | Corning | 22x22 mm Square #1 | |
| DiD | ThermoFisher | V22886 | |
| DiI | ThermoFisher | V22888 | |
| DiO | ThermoFisher | V22887 | |
| Dissecting microscope | Nikon | N/A | SMZ-U |
| Double Sided Tape | Scotch | 665 | |
| Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Sci. | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Egg collection cage | FlyStuff | 59-100 | |
| FemtoJet 5247 | Eppendorf | discontinued | FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021) |
| ImageJ | NIH | Image processing software | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-225 | |
| Micropipette beveler | Sutter | BV-10-B | |
| Needle puller | Narishige | PC-100 | |
| Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets | FlyStuff | 47-102 | |
| Nylon Net Filter | Millipore | ||
| Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Any EM grades |
| PBS | Roche | 11666789001 | Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 146 4510 | Wetting agent |
| Upright fluorescence microscope | Nikon | N/A | Eclipse Ci with a LED light source |
| Vinyl Electrical Tape | Scotch | 6143 | |
| VWR Cell Strainers | VWR | 10199-659 | |
| Yeast | FlyStuff | 62-103 | Active dry yeast (RED STAR) |
References
- Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. Motor axon guidance in Drosophila. Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).
- Nose, A. Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies. Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62 (2012).
- Kim, M. D., Wen, Y., Jan, Y. N. Patterning and organization of motor neuron dendrites in the Drosophila larva. Developmental Biology. 336 (2), 213-221 (2009).
- Manning, L., et al. A resource for manipulating gene expression and analyzing cis-regulatory modules in the Drosophila CNS. Cell Reports. 2 (4), 1002-1013 (2012).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. Journal of Visualized Experiments. (27), e1347 (2009).
- Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. Electrophysiological recording in the Drosophila embryo. Journal of Visualized Experiments. (27), e1348 (2009).
- Doe, C. Q. Temporal Patterning in the Drosophila CNS. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 219-240 (2017).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Urbach, R., Technau, G. M. Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila. Bioessays. 26 (7), 739-751 (2004).
- Carrero-Martínez, F. A., Chiba, A. Cell Adhesion Molecules at the Drosophila Neuromuscular Junction. The Sticky Synapse: Cell Adhesion Molecules and Their Role in Synapse Formation and Maintenance. Umemori, H., Hortsch, M. , Springer. New York. 11-37 (2009).
- Ritzenthaler, S., Suzuki, E., Chiba, A. Postsynaptic filopodia in muscle cells interact with innervating motoneuron axons. Nature Neuroscience. 3 (10), 1012-1017 (2000).
- Kohsaka, H., Takasu, E., Nose, A. In vivo induction of postsynaptic molecular assembly by the cell adhesion molecule Fasciclin2. Journal of Cell Biology. 179 (6), 1289-1300 (2007).
- Kohsaka, H., Nose, A. Target recognition at the tips of postsynaptic filopodia: accumulation and function of Capricious. Development. 136 (7), 1127-1135 (2009).
- Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila. Journal of Neuroscience. 17 (24), 9642-9655 (1997).
- Kamiyama, D., Chiba, A. Endogenous activation patterns of Cdc42 GTPase within Drosophila embryos. Science. 324 (5932), 1338-1340 (2009).
- Furrer, M. P., Vasenkova, I., Kamiyama, D., Rosado, Y., Chiba, A. Slit and Robo control the development of dendrites in Drosophila CNS. Development. 134 (21), 3795-3804 (2007).
- Kamiyama, D., et al. Specification of Dendritogenesis Site in Drosophila aCC Motoneuron by Membrane Enrichment of Pak1 through Dscam1. Developmental Cell. 35 (1), 93-106 (2015).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. The embryonic development of Drosophila melanogaster. , Springer-Verlag. Berlin, Germany. (1985).
- Drosophila Ringer's solution. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (4), (2007).
- Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -L., Whitington, P., Technau, G. Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (73), e50150 (2013).
- Fujioka, M., et al. Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila. Development. 130 (22), 5385-5400 (2003).
- Sink, H., Rehm, E. J., Richstone, L., Bulls, Y. M., Goodman, C. S. sidestep encodes a target-derived attractant essential for motor axon guidance in Drosophila. Cell. 105 (1), 57-67 (2001).
- Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline. Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).
- Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila. PLoS Biology. 1 (2), 41 (2003).
