Summary

Retrograd tracing av Drosophila embryonale motor neurons bruke lipofile fluorescerende fargestoffer

Published: January 12, 2020
doi:

Summary

Vi beskriver en metode for retrograd sporing av Drosophila embryonale motor neurons bruker lipofile fluorescerende fargestoffer.

Abstract

Vi beskriver en teknikk for retrograd merking av motor neurons i Drosophila. Vi bruker en olje-oppløst lipofile fargestoff og levere en liten dråpe til en embryonale filet forberedelse av en microinjector. Hver motor Nevron som membranen er kontaktet av dråpe kan da være raskt merket. Individuelle motor neurons er kontinuerlig merket, slik at fine strukturelle detaljer å være tydelig visualisere. Gitt at lipofile fargestoffer kommer i ulike farger, gir teknikken også et middel for å få tilstøtende neurons merket i flerfarget. Denne tracing teknikken er derfor nyttig for å studere neuronal morphogenesis og Synaptic tilkobling i motorisk Nevron system av Drosophila.

Introduction

Den embryonale motor Nevron system av Drosophila tilbyr en kraftig eksperimentell modell for å analysere mekanismene underliggende utviklingen av sentralnervesystemet (CNS)1,2,3. Den motoriske Nevron systemet er mottagelig for biokjemiske, genetisk, Imaging, og elektrofysiologisk teknikker. Ved hjelp av teknikker, kan genetiske manipulasjoner og funksjonelle analyser utføres på nivå med én motor neurons2,4,5,6.

I løpet av tidlig utvikling av nervesystemet, neuroblasts dividere og generere et stort antall glia og neurons. Spatiotemporal forholdet mellom delaminering og gen uttrykks profilen til neuroblasts har tidligere blitt undersøkt i detalj7,8,9. I tilfelle av motor Nevron systemet, dannelsen av embryonale nevromuskulær Junction (nmj) har blitt grundig studert ved hjelp av aCC (fremre hjørne celle), RP2 (RAW reke 2), og RP5 motor neurons2,10. For eksempel, når RP5 motor Nevron danner en begynnende Synaptic Junction, pre-Synaptic og post-Synaptic filopodia er blandet11,12,13. Slik direkte cellulær kommunikasjon er avgjørende for å starte NMJ formasjon. I motsetning til hva vi vet om perifere nerve grener, vår kunnskap om hvordan motor dendrites initiere Synaptic tilkobling innenfor CNS er fortsatt primitive.

I denne rapporten presenterer vi en teknikk som gjør at retrograd merking av motor neurons i embryo ved hjelp av micropipette-mediert levering av lipofile fargestoffer. Denne teknikken gjør det mulig for oss å spore 38 motor neurons innervating hver av de 30 kroppen veggen musklene i en hemi-segmentet på 15 h etter egglegging (AEL)14. Ved å bruke denne teknikken, har vår gruppe grundig undersøkt mange gevinst-av-funksjon/tap-of-funksjon alleler15,16,17. Vi har nylig unraveled den molekylære mekanismer som driver initiering av motor dendrit tilkobling og viste at en Dscam1-Dock-Pak interaksjon definerer stedet for dendrit utvekst i aCC motor Nevron17. Generelt, denne teknikken er tilpasningsdyktig for fenotypiske analyse av eventuelle embryonale motoriske neurons i vill type eller mutant stammer, styrke vår evne til å gi ny innsikt i funksjonell design av Drosophila nervesystemet.

Protocol

1. utstyr og forsyninger Materialer for innsamling av embryo og trening voksne å legge egg Klargjør filtrerings apparatet ved å severing et 50 mL rør og skjære opp et hull i hetten for å sette et maske filter med porene i 100 μm (tabell over materialer) mellom slangen og hetten.Merk: Alternativt kan celle siler med porer 100 μm (tabell med materialer) brukes til Filtreringstrinnet i embryo-kolleksjonen. Lag agar plater med drue agar Premix (<stron…

Representative Results

En representativ bilde av aCC og RP3 motor neurons er vist i Figur 3C for å demonstrere flerfarget merking av motor NEURONS ved 15 h AEL. Deres dendrittiske morfologier er i stor grad invariant mellom embryo. Fargemønsteret som oppnås med anti-HRP antistoff, vises i grått. En liten dråpe av DiO eller DiD ble avsatt på NMJ av muskel 1 eller 6/7, henholdsvis. Figur 4 demonstrerer evnen til å kvantitativt måle fenotype av interesse. Vi telt…

Discussion

Bruken av fargestoff merkingsteknikker for å studere neuronal morfologi har flere fordeler fremfor genetisk celle-merking teknikk. Fargestoffet merkingsteknikker kan minimere mengden tid som trengs for merking og Imaging morfologier av motor neurons. Fargestoffet merkingsprosessen er ganske rask som det tar mindre enn 2 h og gjør oss i å definere omrisset av neuronal anslag. Som et alternativ, kan man visualisere aCC motoriske Nevron ved å velge en GAL4 linje som uttrykker gjær GAL4 transkripsjon faktor i aCC, og kr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker medlemmer av Kamiyama Lab for kommentarer på manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av en NIH R01 NS107558 (til M.I., K.B., og dk).

Materials

10x objective lens Nikon Plan
40x water-immersion lens Nikon NIR Apo
Capillary tubing Frederick Haer&Co 27-31-1
Confocal microscope Andor N/A Dragonfly Spinning disk confocal unit
Cover glass Corning 22×22 mm Square #1
DiD ThermoFisher V22886
DiI ThermoFisher V22888
DiO ThermoFisher V22887
Dissecting microscope Nikon N/A SMZ-U
Double Sided Tape Scotch 665
Dow Corning High-Vacuum Grease Fisher Sci. 14-635-5D
Dumont #5 Forceps Fine Science Tools 11252-20
Egg collection cage FlyStuff 59-100
FemtoJet 5247 Eppendorf discontinued FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021)
ImageJ NIH Image processing software
Micromanipulator Sutter MP-225
Micropipette beveler Sutter BV-10-B
Needle puller Narishige PC-100
Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets FlyStuff 47-102
Nylon Net Filter Millipore
Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade Electron Microscopy Sciences 15710 Any EM grades
PBS Roche 11666789001 Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution
Photo-Flo 200 Kodak 146 4510 Wetting agent
Upright fluorescence microscope Nikon N/A Eclipse Ci with a LED light source
Vinyl Electrical Tape Scotch 6143
VWR Cell Strainers VWR 10199-659
Yeast FlyStuff 62-103 Active dry yeast (RED STAR)

References

  1. Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. Motor axon guidance in Drosophila. Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).
  2. Nose, A. Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies. Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62 (2012).
  3. Kim, M. D., Wen, Y., Jan, Y. N. Patterning and organization of motor neuron dendrites in the Drosophila larva. Developmental Biology. 336 (2), 213-221 (2009).
  4. Manning, L., et al. A resource for manipulating gene expression and analyzing cis-regulatory modules in the Drosophila CNS. Cell Reports. 2 (4), 1002-1013 (2012).
  5. Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. Journal of Visualized Experiments. (27), e1347 (2009).
  6. Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. Electrophysiological recording in the Drosophila embryo. Journal of Visualized Experiments. (27), e1348 (2009).
  7. Doe, C. Q. Temporal Patterning in the Drosophila CNS. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 219-240 (2017).
  8. Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
  9. Urbach, R., Technau, G. M. Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila. Bioessays. 26 (7), 739-751 (2004).
  10. Carrero-Martínez, F. A., Chiba, A., Umemori, H., Hortsch, M. Cell Adhesion Molecules at the Drosophila Neuromuscular Junction. The Sticky Synapse: Cell Adhesion Molecules and Their Role in Synapse Formation and Maintenance. , 11-37 (2009).
  11. Ritzenthaler, S., Suzuki, E., Chiba, A. Postsynaptic filopodia in muscle cells interact with innervating motoneuron axons. Nature Neuroscience. 3 (10), 1012-1017 (2000).
  12. Kohsaka, H., Takasu, E., Nose, A. In vivo induction of postsynaptic molecular assembly by the cell adhesion molecule Fasciclin2. Journal of Cell Biology. 179 (6), 1289-1300 (2007).
  13. Kohsaka, H., Nose, A. Target recognition at the tips of postsynaptic filopodia: accumulation and function of Capricious. Development. 136 (7), 1127-1135 (2009).
  14. Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila. Journal of Neuroscience. 17 (24), 9642-9655 (1997).
  15. Kamiyama, D., Chiba, A. Endogenous activation patterns of Cdc42 GTPase within Drosophila embryos. Science. 324 (5932), 1338-1340 (2009).
  16. Furrer, M. P., Vasenkova, I., Kamiyama, D., Rosado, Y., Chiba, A. Slit and Robo control the development of dendrites in Drosophila CNS. Development. 134 (21), 3795-3804 (2007).
  17. Kamiyama, D., et al. Specification of Dendritogenesis Site in Drosophila aCC Motoneuron by Membrane Enrichment of Pak1 through Dscam1. Developmental Cell. 35 (1), 93-106 (2015).
  18. Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. . The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).
  19. . Drosophila Ringer’s solution. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (4), (2007).
  20. Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -. L., Whitington, P., Technau, G. Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (73), e50150 (2013).
  21. Fujioka, M., et al. Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila. Development. 130 (22), 5385-5400 (2003).
  22. Sink, H., Rehm, E. J., Richstone, L., Bulls, Y. M., Goodman, C. S. sidestep encodes a target-derived attractant essential for motor axon guidance in Drosophila. Cell. 105 (1), 57-67 (2001).
  23. Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline. Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).
  24. Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila. PLoS Biology. 1 (2), 41 (2003).

Play Video

Cite This Article
Inal, M. A., Banzai, K., Kamiyama, D. Retrograde Tracing of Drosophila Embryonic Motor Neurons Using Lipophilic Fluorescent Dyes. J. Vis. Exp. (155), e60716, doi:10.3791/60716 (2020).

View Video