Retrograd tracing av Drosophila embryonale motor neurons bruke lipofile fluorescerende fargestoffer
Summary
Vi beskriver en metode for retrograd sporing av Drosophila embryonale motor neurons bruker lipofile fluorescerende fargestoffer.
Abstract
Vi beskriver en teknikk for retrograd merking av motor neurons i Drosophila. Vi bruker en olje-oppløst lipofile fargestoff og levere en liten dråpe til en embryonale filet forberedelse av en microinjector. Hver motor Nevron som membranen er kontaktet av dråpe kan da være raskt merket. Individuelle motor neurons er kontinuerlig merket, slik at fine strukturelle detaljer å være tydelig visualisere. Gitt at lipofile fargestoffer kommer i ulike farger, gir teknikken også et middel for å få tilstøtende neurons merket i flerfarget. Denne tracing teknikken er derfor nyttig for å studere neuronal morphogenesis og Synaptic tilkobling i motorisk Nevron system av Drosophila.
Introduction
Den embryonale motor Nevron system av Drosophila tilbyr en kraftig eksperimentell modell for å analysere mekanismene underliggende utviklingen av sentralnervesystemet (CNS)1,2,3. Den motoriske Nevron systemet er mottagelig for biokjemiske, genetisk, Imaging, og elektrofysiologisk teknikker. Ved hjelp av teknikker, kan genetiske manipulasjoner og funksjonelle analyser utføres på nivå med én motor neurons2,4,5,6.
I løpet av tidlig utvikling av nervesystemet, neuroblasts dividere og generere et stort antall glia og neurons. Spatiotemporal forholdet mellom delaminering og gen uttrykks profilen til neuroblasts har tidligere blitt undersøkt i detalj7,8,9. I tilfelle av motor Nevron systemet, dannelsen av embryonale nevromuskulær Junction (nmj) har blitt grundig studert ved hjelp av aCC (fremre hjørne celle), RP2 (RAW reke 2), og RP5 motor neurons2,10. For eksempel, når RP5 motor Nevron danner en begynnende Synaptic Junction, pre-Synaptic og post-Synaptic filopodia er blandet11,12,13. Slik direkte cellulær kommunikasjon er avgjørende for å starte NMJ formasjon. I motsetning til hva vi vet om perifere nerve grener, vår kunnskap om hvordan motor dendrites initiere Synaptic tilkobling innenfor CNS er fortsatt primitive.
I denne rapporten presenterer vi en teknikk som gjør at retrograd merking av motor neurons i embryo ved hjelp av micropipette-mediert levering av lipofile fargestoffer. Denne teknikken gjør det mulig for oss å spore 38 motor neurons innervating hver av de 30 kroppen veggen musklene i en hemi-segmentet på 15 h etter egglegging (AEL)14. Ved å bruke denne teknikken, har vår gruppe grundig undersøkt mange gevinst-av-funksjon/tap-of-funksjon alleler15,16,17. Vi har nylig unraveled den molekylære mekanismer som driver initiering av motor dendrit tilkobling og viste at en Dscam1-Dock-Pak interaksjon definerer stedet for dendrit utvekst i aCC motor Nevron17. Generelt, denne teknikken er tilpasningsdyktig for fenotypiske analyse av eventuelle embryonale motoriske neurons i vill type eller mutant stammer, styrke vår evne til å gi ny innsikt i funksjonell design av Drosophila nervesystemet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bruken av fargestoff merkingsteknikker for å studere neuronal morfologi har flere fordeler fremfor genetisk celle-merking teknikk. Fargestoffet merkingsteknikker kan minimere mengden tid som trengs for merking og Imaging morfologier av motor neurons. Fargestoffet merkingsprosessen er ganske rask som det tar mindre enn 2 h og gjør oss i å definere omrisset av neuronal anslag. Som et alternativ, kan man visualisere aCC motoriske Nevron ved å velge en GAL4 linje som uttrykker gjær GAL4 transkripsjon faktor i aCC, og kr…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker medlemmer av Kamiyama Lab for kommentarer på manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av en NIH R01 NS107558 (til M.I., K.B., og dk).
Materials
| 10x objective lens | Nikon | Plan | |
| 40x water-immersion lens | Nikon | NIR Apo | |
| Capillary tubing | Frederick Haer&Co | 27-31-1 | |
| Confocal microscope | Andor | N/A | Dragonfly Spinning disk confocal unit |
| Cover glass | Corning | 22×22 mm Square #1 | |
| DiD | ThermoFisher | V22886 | |
| DiI | ThermoFisher | V22888 | |
| DiO | ThermoFisher | V22887 | |
| Dissecting microscope | Nikon | N/A | SMZ-U |
| Double Sided Tape | Scotch | 665 | |
| Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Sci. | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Egg collection cage | FlyStuff | 59-100 | |
| FemtoJet 5247 | Eppendorf | discontinued | FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021) |
| ImageJ | NIH | Image processing software | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-225 | |
| Micropipette beveler | Sutter | BV-10-B | |
| Needle puller | Narishige | PC-100 | |
| Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets | FlyStuff | 47-102 | |
| Nylon Net Filter | Millipore | ||
| Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Any EM grades |
| PBS | Roche | 11666789001 | Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 146 4510 | Wetting agent |
| Upright fluorescence microscope | Nikon | N/A | Eclipse Ci with a LED light source |
| Vinyl Electrical Tape | Scotch | 6143 | |
| VWR Cell Strainers | VWR | 10199-659 | |
| Yeast | FlyStuff | 62-103 | Active dry yeast (RED STAR) |
References
- Arzan Zarin, A., Labrador, J. P. Motor axon guidance in Drosophila. Seminars in Cell and Developmental Biology. 85, 36-47 (2019).
- Nose, A. Generation of neuromuscular specificity in Drosophila: novel mechanisms revealed by new technologies. Frontiers in Molecular Neuroscience. 5, 62 (2012).
- Kim, M. D., Wen, Y., Jan, Y. N. Patterning and organization of motor neuron dendrites in the Drosophila larva. Developmental Biology. 336 (2), 213-221 (2009).
- Manning, L., et al. A resource for manipulating gene expression and analyzing cis-regulatory modules in the Drosophila CNS. Cell Reports. 2 (4), 1002-1013 (2012).
- Featherstone, D. E., Chen, K., Broadie, K. Harvesting and preparing Drosophila embryos for electrophysiological recording and other procedures. Journal of Visualized Experiments. (27), e1347 (2009).
- Chen, K., Featherstone, D. E., Broadie, K. Electrophysiological recording in the Drosophila embryo. Journal of Visualized Experiments. (27), e1348 (2009).
- Doe, C. Q. Temporal Patterning in the Drosophila CNS. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 219-240 (2017).
- Homem, C. C., Knoblich, J. A. Drosophila neuroblasts: a model for stem cell biology. Development. 139 (23), 4297-4310 (2012).
- Urbach, R., Technau, G. M. Neuroblast formation and patterning during early brain development in Drosophila. Bioessays. 26 (7), 739-751 (2004).
- Carrero-Martínez, F. A., Chiba, A., Umemori, H., Hortsch, M. Cell Adhesion Molecules at the Drosophila Neuromuscular Junction. The Sticky Synapse: Cell Adhesion Molecules and Their Role in Synapse Formation and Maintenance. , 11-37 (2009).
- Ritzenthaler, S., Suzuki, E., Chiba, A. Postsynaptic filopodia in muscle cells interact with innervating motoneuron axons. Nature Neuroscience. 3 (10), 1012-1017 (2000).
- Kohsaka, H., Takasu, E., Nose, A. In vivo induction of postsynaptic molecular assembly by the cell adhesion molecule Fasciclin2. Journal of Cell Biology. 179 (6), 1289-1300 (2007).
- Kohsaka, H., Nose, A. Target recognition at the tips of postsynaptic filopodia: accumulation and function of Capricious. Development. 136 (7), 1127-1135 (2009).
- Landgraf, M., Bossing, T., Technau, G. M., Bate, M. The origin, location, and projections of the embryonic abdominal motorneurons of Drosophila. Journal of Neuroscience. 17 (24), 9642-9655 (1997).
- Kamiyama, D., Chiba, A. Endogenous activation patterns of Cdc42 GTPase within Drosophila embryos. Science. 324 (5932), 1338-1340 (2009).
- Furrer, M. P., Vasenkova, I., Kamiyama, D., Rosado, Y., Chiba, A. Slit and Robo control the development of dendrites in Drosophila CNS. Development. 134 (21), 3795-3804 (2007).
- Kamiyama, D., et al. Specification of Dendritogenesis Site in Drosophila aCC Motoneuron by Membrane Enrichment of Pak1 through Dscam1. Developmental Cell. 35 (1), 93-106 (2015).
- Campos-Ortega, J. A., Hartenstein, V. . The embryonic development of Drosophila melanogaster. , (1985).
- . Drosophila Ringer’s solution. Cold Spring Harbor Protocols. 2007 (4), (2007).
- Rickert, C., Kunz, T., Harris, K. -. L., Whitington, P., Technau, G. Labeling of single cells in the central nervous system of Drosophila melanogaster. Journal of Visualized Experiments. (73), e50150 (2013).
- Fujioka, M., et al. Even-skipped, acting as a repressor, regulates axonal projections in Drosophila. Development. 130 (22), 5385-5400 (2003).
- Sink, H., Rehm, E. J., Richstone, L., Bulls, Y. M., Goodman, C. S. sidestep encodes a target-derived attractant essential for motor axon guidance in Drosophila. Cell. 105 (1), 57-67 (2001).
- Furrer, M. P., Kim, S., Wolf, B., Chiba, A. Robo and Frazzled/DCC mediate dendritic guidance at the CNS midline. Nature Neuroscience. 6 (3), 223-230 (2003).
- Landgraf, M., Jeffrey, V., Fujioka, M., Jaynes, J. B., Bate, M. Embryonic origins of a motor system: motor dendrites form a myotopic map in Drosophila. PLoS Biology. 1 (2), 41 (2003).
