Summary
Describimos un método para el rastreo retrógrado de las neuronas motoras embrionarias Drosophila utilizando colorantes fluorescentes lipofílicos.
Abstract
Describimos una técnica para el etiquetado retrógrado de las neuronas motoras en Drosophila. Usamos un tinte lipofílico disuelto con aceite y entregamos una pequeña gota a una preparación de filete embrionario por un microinyector. Cada neurona motora cuya membrana es contactada por la gota puede entonces ser etiquetada rápidamente. Las neuronas motoras individuales se etiquetan continuamente, lo que permite visualizar claramente los detalles estructurales finos. Dado que los colorantes lipofílicos vienen en varios colores, la técnica también proporciona un medio para conseguir neuronas adyacentes etiquetadas en multicolor. Esta técnica de rastreo es por lo tanto útil para el estudio de la morfogénesis neuronal y la conectividad sináptica en el sistema de neuronas motoras de Drosophila.
Introduction
El sistema de neuronas motoras embrionarias de Drosophila ofrece un potente modelo experimental para analizar los mecanismos subyacentes al desarrollo del sistema nervioso central (SNC)1,2,3. El sistema de neuronas motoras es susceptible de técnicas bioquímicas, genéticas, de imágenes y electrofisiológicas. Utilizando las técnicas, las manipulaciones genéticas y los análisis funcionales se pueden llevar a cabo a nivel de neuronas motoras individuales2,4,5,6.
Durante el desarrollo temprano del sistema nervioso, los neuroblastos se dividen y generan un gran número de glia y neuronas. La relación espaciotemporal entre la delaminación y el perfil de expresión génica de los neuroblastos se ha investigado previamente en detalle7,8,9. En el caso del sistema de neuronas motoras, la formación de unión neuromuscular embrionaria (NMJ) se ha estudiado ampliamente utilizando el aCC (célula de esquina anterior), RP2 (camarón crudo 2), y las neuronas motoras RP52,10. Por ejemplo, cuando la neurona motora RP5 forma una unión sináptica naciente, la filopodia presináptica y postsináptica se entremezclanitora 11,12,13. Dicha comunicación celular directa es vital para iniciar la formación de NMJ. Contrariamente a lo que sabemos sobre las ramas nerviosas periféricas, nuestro conocimiento de cómo las dendritas motoras inician la conectividad sináptica dentro del SNC sigue siendo primitivo.
En este informe, presentamos una técnica que permite el etiquetado retrógrado de las neuronas motoras en embriones mediante la administración mediada por micropipette de colorantes lipofílicos. Esta técnica nos permite rastrear las 38 neuronas motoras que inertan cada uno de los 30 músculos de la pared corporal en un hemisegmento a las 15 h después de la puesta de huevos (AEL)14. Mediante el uso de esta técnica, nuestro grupo ha investigado a fondo numerosos alelos de ganancia de función/pérdida de función15,16,17. Recientemente hemos desentrañado los mecanismos moleculares que impulsan el inicio de la conectividad de dendrita motora y hemos demostrado que una interacción Dscam1-Dock-Pak define el sitio de crecimiento de dendrita en la neurona motora aCC17. En general, esta técnica es adaptable para el análisis fenotípico de cualquier neurona motora embrionaria en cepas de tipo salvaje o mutantes, mejorando nuestra capacidad de proporcionar nuevos conocimientos sobre el diseño funcional del sistema nervioso Drosophila.
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Protocol
1. Equipos y suministros
- Materiales para recoger embriones y entrenar a adultos para poner óvulos
- Preparar el aparato de filtración cortando un tubo de 50 ml y cortando abrir un agujero en la tapa para fijar un filtro de malla con poros de 100 m(Tabla de materiales)entre el tubo y la tapa.
NOTA: Alternativamente, los coladores celulares con poros de 100 m(Tabla de Materiales)se pueden utilizar para el paso de filtración de la recolección de embriones. - Hacer platos de agar con premezcla de agar de uva(Tabla de Materiales)de acuerdo con las instrucciones enumeradas. Revuelva brevemente 1 paquete de la mezcla de polvo en 500 ml de temperatura ambiente (RT, 23 oC) dH2O y microonda la mezcla disuelta a hervir vigorosamente. Después de enfriar a 70 o75 oC, vierta la mezcla en los platos de Petri (60 mm). Después de solidificarse el agar, guarde las placas a 4oC.
- Preparar la pasta de levadura mezclando levadura seca activa(Tabla de Materiales)y agua a una consistencia de pasta, y manténgala a 4oC.
- Utilice jaulas de recolección de huevos (para plato Petri de 60 mm, Tabla de materiales)que proporcionen suficiente flujo de aire.
- Preparar el aparato de filtración cortando un tubo de 50 ml y cortando abrir un agujero en la tapa para fijar un filtro de malla con poros de 100 m(Tabla de materiales)entre el tubo y la tapa.
- Preparación de agujas de disección y micropipetas de inyección de tinte
- Preparar micropipette de inyección de tinte y aguja de disección del mismo tubo capilar con un diámetro interior de 0,6 mm y un diámetro exterior de 1,2 mm(Tabla de materiales). Tire del tubo capilar por un tirador de micropipeta al 7% de la salida máxima de 170 V(Tabla de materiales)para crear una aguja afilada con un cónico de 0,4 cm de longitud.
- Para la inyección de tinte, ajuste el micropipeta con un beveler de micropipeta(Tabla de materiales)mediante una técnica de biselado de burbujas descrita en el manual del instrumento.
- En resumen, remoje la amoladora con un agente humectante(Tabla de Materiales)para evitar que el agua 'arrastre' la punta de la aguja. Coloque la aguja en la abrazadera de micropipeta a 25 x 30o y baje la punta en dos tercios del radio desde el centro de la superficie biselada. Moler la aguja mientras una jeringa con tubo empuja el aire dentro de la aguja, para asegurarse de que el micropipeta estará libre de virutas de vidrio.
- Marque el micropipeta con un marcador permanente de punta fina para indicar la posición de la abertura en la punta después del biselado, ya que es difícil localizar la abertura estrecha de la micropipeta que se forma en un ángulo.
2. Preparación para la recogida de embriones
- Asegúrese de que las moscas adultas (20-40 de tipo salvaje Canton-S o moscas blancas), machos y hembras, se mantengan en condiciones jóvenes (<7 días) y saludables para la recolección ideal de huevos.
NOTA: Para estimular la puesta de huevos, las moscas son entrenadas en su jaula de recolección de huevos un par de días antes de la recolección de huevos en placas de agar rayadas con pasta de levadura al menos una vez al día.
3. Escenificación de embriones
- Permita que las moscas pongan huevos durante la noche (o al menos 15 h) en RT para recoger los embriones a 15 h AEL, es decir, etapa 1618,para ver la dendritogénesis de las neuronas motoras aCC y RP3. Por la mañana, recoge el plato con los huevos.
NOTA: Los embriones a 15 h AEL tendrán un intestino de 4 cámarasdistinto 18. Para obtener imágenes, las diferentes etapas siguen sus criterios morfológicos específicos y las condiciones de envejecimiento. - Para recoger los embriones, deschorionar los huevos puestos en el plato con 50% de lejía durante 5 min.
- Una vez que los coros se hayan despejado, vierta el contenido de la placa a través del aparato de filtración o colador celular para aislar los embriones. Usando una botella de agua, diluir la lejía que queda en la placa y recoger tantos embriones como sea posible decantando la mezcla en el filtro.
- Lavar los embriones en el filtro de 3 x 4 x con más agua o hasta que el olor de lejía se disipate. Retire el filtro del aparato y lave los embriones en otra placa limpia con agua. Decantar el agua de la nueva placa en la que están los embriones.
- Preparar una diapositiva de vidrio cubriéndola con dos capas de cinta de vinilo en el centro, formando un rectángulo. Corte una piscina rectangular de la cinta con una cuchilla de afeitar. Coloque una tira delgada de cinta adhesiva de doble cara hacia el extremo superior de la piscina, aquí es donde se colocarán los embriones como se muestra en la Figura 1.
- Usando fórceps finos, seleccione individualmente 5 x 10 embriones a 15 h AEL y colóquelos en la cinta de doble cara con el lado dorsal hacia arriba. Añadir la salina de insectos Ringer19 a la piscina de disección para proteger los embriones de la desecación(Figura 1).
4. Disección y tinción
- Usando una aguja de vidrio bajo un microscopio de disección(Tabla de Materiales), corta a través de la línea media de un solo embrión en su superficie desde su extremo posterior a su extremo anterior. A continuación, arrastre el embrión fuera de la membrana vitelina de la cinta al vidrio (en caja en la Figura 1). Tenga cuidado de no dañar los tejidos interiores del embrión.
- Voltear los tejidos epiteliales desde el centro y fijar el borde epidérmico en la superficie de la diapositiva de vidrio(Figura 1, recuadro).
- Usando una aguja conectada a un tubo con una abertura de punta de 300 m (preparada rompiendo la punta delgada de una aguja de disección), aspirar o soplar aire para separar y eliminar los troncos tracatos longitudinales dorsales, así como los intestinos restantes.
- Utilice un 4% de paraformaldehído (PFA) en solución salina con fosfato (PBS) para fijar los embriones durante 5 minutos en RT. Lavar los embriones 3 veces con PBS.
- Manchar los embriones con 1 l de anticuerpo anti-caballo peroxidasa conjugado con tinte cianina 3 (anti-HRP Cy3)(Tabla de Materiales)en 200 éL de PBS durante 1 h. Lavar los embriones con PBS 3x después de la tinción.
NOTA: El tinte de anti-HRP se puede cambiar en función de los tintes lipofílicos de elección para la inyección.
5. Relleno de la micropipeta de inyección
- Caliente los colorantes lipofílicos (5 mg/ml de DiO o DiD, Tabla de Materiales)a 60oC en una mezcla de 1:10 de etanol:aceite vegetal antes de su uso.
- Prepare un portaobjetos de colorante disuelto con aceite para la micropipeta de inyección. Coloque el micropipeta en el soporte capilar(Figura 2,#1). Usando el micromanipulador(Tabla de Materiales),ajuste el micropipeta para que esté sobre el tobogán de tinte. A continuación, ajuste el escenario para colocar el micropipeta en el tinte(Figura 2,#2).
- Para llenar el micropipeta, utilice un microinyector(Tabla de materiales)(Figura 2,#3). Recoja el tinte en el micropités ajustando el Pi (presión de inyección) entre 200-500 hPa (hectopascal), el Ti (tiempo de inyección) entre 0,1 x 0,5 s y Pc (presión de compensación) a 0 hPa durante 5 min(figura 2, #4).
- Una vez recogido el tinte, retire el tobogán de colorante y coloque la muestra en la etapa del microscopio. A continuación, aumente el Pc a un rango de 20 a 60 hPa antes de bajar el micropipeta en la muestra para evitar la contaminación de PBS por acción capilar.
6. Inyección de tinte en las neuronas
- Localice el embrión en el centro utilizando el microscopio con una lente objetivo 10x(Tabla de Materiales)y alinee la micropipeta con el embrión.
NOTA: El tamaño de la gota de tinte se puede ajustar cambiando la Pi o el tamaño de la abertura de la punta del micropipeta. La gota debe ser de 10 a 20 m, que es aproximadamente el ancho de 1 músculo. - Cambie la lente objetivo a una lente 40x de inmersión en agua(Tabla de materiales)y sumerja la lente en PBS para ver el embrión.
- Utilice la microscopía de fluorescencia para comprobar la morfología neuronal marcada por anti-HRP Cy3 y determinar el lugar de inyección.
- Durante la inyección, utilice la microscopía de campo brillante para ver la gota de tinte. Cuando el embrión esté enfocado, cambie la posición del micropipeta para establecer un contacto suave con la punta del axón de interés (por ejemplo, aCC, RP3).
- Suelte el tinte en un hemi-segmento abdominal derecho (A2-A6) en la unión neuromuscular de aCC o RP3(Figura 3)con DiD o DiO, utilizando las neuronas marcadas por anti-HRP Cy3. Uso del control manual (ratón; Figura 2, 5) liberar el tinte y quitar el micropipeta después de dejar caer el tinte con el micromanipulador y pasar al siguiente lugar de inyección.
NOTA: A diferencia de otros tintes (por ejemplo, amarillo Lucifer, calceína) que se propagan a las células vecinas a través de uniones de separación, los tintes lipofílicos se asocian con las membranas celulares y no se transfieren a los vecinos. Debido al tamaño relativamente grande de la gota de tinte, sin embargo, esta técnica también resulta en el etiquetado de los músculos asociados(Figura 3A).
- Incubar la muestra a RT durante 1 h después de la gota de tinte antes de la toma de imágenes.
NOTA: El protocolo se puede pausar aquí antes del montaje, y la muestra se puede mantener a 4 oC durante la noche. Los disteéticos lipofílicos también se pueden administrar utilizando iontoforesis, si un amplificador intracelular de acoplamiento directo (DC) está disponible20.
7. Imágenes con un microscopio confocal
- Retire la cinta de doble cara y la cinta de vinilo de la corredera de vidrio con la ayuda de fórceps.
- Preparar un resbalón de la cubierta (22 x 22 mm2 Vidrio de cubierta No.1) con una pequeña cantidad de grasa al vacío(Tabla de Materiales)en las cuatro esquinas y colocar cuidadosamente en la muestra, evitando las burbujas de aire. Elimine cualquier exceso de PBS con limpiaparabrisas de tareas.
- Empuje hacia abajo el deslizamiento de la cubierta para ajustar la distancia de trabajo entre la lente objetivo y la muestra. Selle completamente los bordes del deslizamiento de la cubierta con esmalte de uñas.
- Imagen a 10x y 100x aumento utilizando un microscopio confocal.
- Utilice el software ImageJ para procesar imágenes raw desde el microscopio(Tabla de materiales).
NOTA: La observación debe comenzar dentro de los 10 minutos después del montaje para obtener las mejores imágenes. De lo contrario, en RT, el tinte se extenderá a sitios adyacentes al lugar de inyección creando fondo no deseado para la toma de imágenes. Para ralentizar la difusión del tinte, la muestra se puede almacenar a 4 oC durante un par de horas.
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Representative Results
Una imagen representativa de las neuronas motoras aCC y RP3 se muestra en la Figura 3C para demostrar el etiquetado multicolor de las neuronas motoras a 15 h AEL. Sus morfologías dendríticas son en gran medida invariables entre embriones. El patrón de tinción obtenido con anticuerpos anti-HRP se muestra en gris. Una pequeña gota de DiO o DiD fue depositada en el NMJ del músculo 1 o 6/7, respectivamente. La Figura 4 demuestra la capacidad de medir cuantitativamente el fenotipo de interés. Contamos el número total de puntas de ndrita en un tipo salvaje, en comparación con un mutante (por ejemplo, dscam1-/-).
Figura 1: Configuración del grupo de disección. La cámara azul que se ve en la corredera de vidrio se crea con cinta de vinilo que mantiene los tampones dentro. La cinta de doble cara se aferra a los embriones que están correctamente alineados. También se muestra en la esquina inferior izquierda un ejemplo de un embrión diseccionado en salina. El extremo anterior está en la parte superior en esta y todas las figuras posteriores. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Equipo de inyección de tinte. El etiquetado de pipetas de vidrio en la figura muestra el lugar de instalación de la pipeta de vidrio (1). El microscopio epifluorescente está equipado con una fuente de luz LED y una serie de conjuntos de filtros. El micromanipulador (2) y los dispositivos de microinyección (3) están etiquetados a la derecha del microscopio. El recuadro es un primer plano de la pantalla del dispositivo de microinyección (4) con los valores adecuados de Pi, Tiy Pc). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Preparaciones de tinte lipofílico de neuronas motoras etiquetadas retrogradamente. (A) Neuronas motoras etiquetadas retrogradamente y sus músculos objetivo. El músculo de incubación de la neurona motora aCC 1 (DiO: excitación/emisión, 484 nm/501 nm); los músculos de la neurona motora RP3 6/7 (DiD: excitación/emisión, 644 nm/665 nm). Tenga en cuenta que los músculos 6/7 también reciben inervación de otra neurona motora (MNISNb/d-Is) en etapas larvales; sin embargo, MNISNb/d-Is no tiene una contraparte embrionaria3. Los círculos indican sitios de aplicaciones de tinte. (B) Un diagrama esquemático de los músculos de la pared corporal y las ramas del nervio periférico en 15 h AEL. El cordón del nervio ventral (VNC) consiste en neuromere segmentalmente repetido y bilateralmente simétrico con respecto a la línea media ventral (línea de puntos). Los músculos de la pared corporal de cada hemi-segmento están invadidos por 38 neuronas motoras. Las neuronas motoras proyectan sus axons a través de seis ramas nerviosas principales (ISN [nervio intersegmental], SNa [nervio segmental a], SNb, SNc, SNd y TN [nervio transversal]). (C) Las ramas dendríticas de las neuronas motoras aCC y RP3 muestran una amplia superposición. Ambas neuronas son neuronas bipolares, lo que significa que las neuronas establecen dos poblaciones diferentes de dendritas. Cada neurona proyecta un árbol en el neuropil ipsilateral y otro en el neuropil contralateral. Las puntas de flecha apuntan a puntas dendríticas. Las imágenes de fluorescencia se adquirieron con un objetivo 10x o un objetivo de inmersión en aceite de 100x. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: dendritogénesis aCC como se revela con el etiquetado retrógrado en embriones de hora-15. (A) En el tipo salvaje, aCC extiende sus dendritas en neuropils ipsilaterales y contralaterales. Para simplificar, sólo mostramos las dendritas ipsilaterales de aCC en esta figura. aCC está etiquetado con DiO, que se muestra en verde. (B) En los mutantes dscam1 (dscam121/21 del Dr. Tzumin Lee, Janelia Research Campus), aCC tiene pocas dendritas ipsilaterales en la mayoría de los casos observados17. Las puntas de flecha muestran puntas dendríticas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El uso del etiquetado de tintes para estudiar la morfología neuronal tiene varias ventajas sobre las técnicas genéticas de etiquetado celular. La técnica de etiquetado de tintes puede minimizar la cantidad de tiempo necesario para etiquetar e tomar imágenes de las morfologías de las neuronas motoras. El proceso de etiquetado del tinte es bastante rápido, ya que toma menos de 2 h y nos permite definir el contorno de las proyecciones neuronales. Como alternativa, se puede visualizar la neurona motora aCC eligiendo una línea GAL4 que expresa el factor de transcripción gal4 de levadura en aCC, y cruzándola con un reportero de proteína fluorescente verde (GFP) controlado por la secuencia de activación ascendente (UAS)21. Una técnica de etiquetado GFP como tal requiere una cruz genética y, por lo tanto, toma pocos días más.
Otra ventaja del etiquetado de tinte es permitir el etiquetado de la membrana plasmática a una densidad extremadamente alta. Una densidad suficiente de colorantes lipofílicos puede estar presente en cada parte de la membrana, lo que nos permite resolver los detalles finos de una estructura etiquetada. Por el contrario, la densidad de las moléculas de GFP a menudo depende del período de espera después de que el sistema UAS-GAL4 se activa. Por ejemplo, aCC comienza a expresar GFP a partir de 10 h AEL. A las 15 h AEL cuando observamos, la densidad de las moléculas de GFP es inadecuada para cubrir toda la membrana. Resulta en un etiquetado insuficiente de las proyecciones neuronales finas (D.K., datos no publicados).
Aunque esta técnica proporciona varias ventajas, es menos ventajosa cuando la proyección errónea de los axons motores es evidente. En ausencia de paso lateral,por ejemplo, las neuronas motoras muestran defectos axonales graves como estancamiento prematuro, cruce de fronteras segmentales y ramificación excesiva22. Como consecuencia, llegar a un cierto terminal de axón se vuelve engorroso. La eficiencia del etiquetado también depende de la edad, siendo eficaz en embriones menores de 20 h AEL. A medida que las proteínas de la matriz extracelular aumentan con el desarrollo, el etiquetado de las neuronas motoras parece ser muy complejo.
La técnica descrita aquí nos permite medir muchos parámetros morfológicos como la longitud y el número total de neuritas, y el patrón de rama de neurita y la forma15,16,17,23,24. Debido a que los colorantes lipofílicos de carbocyanina vienen en muchos colores (como DiO, DiA, DiI, DiD y DiR), el etiquetado multicolor de las neuronas motoras adyacentes también es alcanzable. Como se muestra en la Figura 4,las dendritas de las neuronas motoras aCC y RP3 se superponen ampliamente. Para profundizar nuestra comprensión en el desarrollo de circuitos motorizados, se investigarán los mecanismos de interacción dendrita-dendrita.
Aquí, detallamos la técnica versátil que proporciona una vía para estudiar la conectividad neuronal en el circuito motor. Aunque la demostración está restringida a las neuronas motoras aCC y RP3 en 15 h AEL, esta técnica se puede aplicar a otras neuronas motoras en diferentes etapas de desarrollo embrionario. Si un terminal de axón es accesible con una micropipeta de inyección, esta técnica también podría aplicarse al etiquetado de cualquier neurona en las etapas larvales y adultas de las moscas o incluso en otros organismos.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a los miembros del Laboratorio Kamiyama por sus comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por un NIH R01 NS107558 (a M.I., K.B. y D.K.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x objective lens | Nikon | Plan | |
| 40x water-immersion lens | Nikon | NIR Apo | |
| Capillary tubing | Frederick Haer&Co | 27-31-1 | |
| Confocal microscope | Andor | N/A | Dragonfly Spinning disk confocal unit |
| Cover glass | Corning | 22x22 mm Square #1 | |
| DiD | ThermoFisher | V22886 | |
| DiI | ThermoFisher | V22888 | |
| DiO | ThermoFisher | V22887 | |
| Dissecting microscope | Nikon | N/A | SMZ-U |
| Double Sided Tape | Scotch | 665 | |
| Dow Corning High-Vacuum Grease | Fisher Sci. | 14-635-5D | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Tools | 11252-20 | |
| Egg collection cage | FlyStuff | 59-100 | |
| FemtoJet 5247 | Eppendorf | discontinued | FemtoJet 4i (Cat No. 5252000021) |
| ImageJ | NIH | Image processing software | |
| Micromanipulator | Sutter | MP-225 | |
| Micropipette beveler | Sutter | BV-10-B | |
| Needle puller | Narishige | PC-100 | |
| Nutri-Fly Grape Agar Powder Premix Packets | FlyStuff | 47-102 | |
| Nylon Net Filter | Millipore | ||
| Paraformaldehyde 16% Solution, EM grade | Electron Microscopy Sciences | 15710 | Any EM grades |
| PBS | Roche | 11666789001 | Sold on sigmaaldrich, boxed 10x solution |
| Photo-Flo 200 | Kodak | 146 4510 | Wetting agent |
| Upright fluorescence microscope | Nikon | N/A | Eclipse Ci with a LED light source |
| Vinyl Electrical Tape | Scotch | 6143 | |
| VWR Cell Strainers | VWR | 10199-659 | |
| Yeast | FlyStuff | 62-103 | Active dry yeast (RED STAR) |
References
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