Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Визуализация бактериальной резистентности с использованием флуоресцентных антибиотиков

Published: March 2, 2020 doi: 10.3791/60743
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Centre for Superbug Solutions, Institute for Molecular Biosciences, The University of Queensland

Summary

Флуоресцентно помеченные антибиотики являются мощными инструментами, которые могут быть использованы для изучения нескольких аспектов устойчивости к противомикробным препаратам. В этой статье описывается подготовка флуоресцентно помеченных антибиотиков и их применение для изучения устойчивости к антибиотикам у бактерий. Зонды могут быть использованы для изучения механизмов бактериальной резистентности (например, эффлюкс) с помощью спектрофотометрии, цитометрии потока и микроскопии.

Abstract

Флуоресцентные антибиотики являются многоцелевыми исследовательскими инструментами, которые легко используются для изучения устойчивости к противомикробным препаратам, благодаря их значительному преимуществу перед другими методами. Для подготовки этих зондов синтезируются производные азидных антибиотиков, а затем в сочетании с алкин-фторофорами с использованием азиде-алкина диполярного цикловупового щелочного производного применения путем щелчка химии. После очистки, активность антибиотиков флуоресцентного антибиотика проверяется минимальной ингибирующей концентрации оценки. Для изучения бактериального накопления может использоваться либо спектрофотометрия, либо цитометрия потока, что позволяет проводить гораздо более простой анализ, чем методы, опирающиеся на радиоактивные производные антибиотика. Кроме того, конфокальная микроскопия может быть использована для изучения локализации внутри бактерий, предоставляя ценную информацию о способе действия и изменениях, которые происходят в устойчивых видов. Использование флуоресцентных антибиотиков зондов в изучении устойчивости к противомикробным препаратам является мощным методом с большим потенциалом для будущего расширения.

Introduction

Устойчивость к противомикробным препаратам (УПП) представляет собой растущий кризис, который представляет собой серьезную угрозу для здоровья человека во всем мире. Сообщалось о резистентности к большинству антибиотиков, и появляются инфекции, вызванные бактериями, устойчивыми ко всем клинически доступным препаратам. Для борьбы с ростом УПП нам необходимо расширить наше понимание этого многогранного явления и лежащих в его основе механизмов и взаимодействий между антибиотиками и бактериями. Одним из аспектов, который был исторически плохо изучены является проникание антибиотиков в бактерии, наряду с явлениями накопления и efflux. Эти знания имеют решающее значение для разработки новых лекарств и понимания механизмов сопротивления. Таким образом, это играет важную роль в исследованиях AMR.

Есть два основных подхода, которые могут быть приняты для того, чтобы измерить концентрацию антибиотиков: измерение препарата непосредственно или пометки с moiety предназначен для облегчения количественной оценки. Хотя маркировка антибиотик улучшает обнаружение, это может возмутить биологическую активность препарата, такие как противомикробная активность и проницаемость. Это не проблема для немаркированных методов; однако, обнаружение может быть сложной задачей. В последние несколько лет, технологические достижения привели к буму в исследованиях с использованием масс-спектрометрии (MS) непосредственно измерить концентрацию антибиотиков вбактериях 1,2,3,4,5,6,7. Эти исследования показали, что можно изучать внутриклеточное накопление в различных бактериях, с грамотрицательными бактериями наиболее широко изученным. Количественная оценка проницаемости молекулы затем была связана с активностью и используется для информирования развития препарата2,3,4, хотя осторожность должна быть принята при непосредственном совмещении накопления и целевой активности5. До развития MS, только антибиотики, концентрация которых может быть непосредственно измерены были те, обладающие внутренней флуоресценции, такие как тетрациклин и хинолоны8,9,10,11. Хотя, очевидно, ограниченные по охвату, накопление и efflux были рассмотрены и количественно, иллюстрирующие полезность флуоресценции на основе количественной оценки.

Tagged антибиотики были использованы на протяжении многих десятилетий для изучения распределения, способы действия, и сопротивление, с радиоактивными и флуоресцентными метками является общим. Радио-тегами зонды имеют то преимущество, что почти идентичны родительского соединения, следовательно, биологическая активность вряд ли будет существенно отличаться. Изотопы, такие как 3H, 14C и 15N часто используются из-за известности этих элементов в антибиотиках, и различные антибиотики леса были рассмотрены1,10,12,13. Хотя обнаружение радиозондов является простым, существует ряд проблем материально-технического обеспечения (например, безопасность, изотопный период полураспада), которые ограничивают использование этого подхода. Другая стратегия - флуоресцентно помеченные антибиотиками. Эти зонды могут быть использованы для изучения распределения и способов действия и сопротивление родительского препарата, используя более простую технологию, чем MS и без логистических проблем излучения8. Основным недостатком этого подхода является то, что антибиотики, как правило, относительно небольшие молекулы, следовательно, введение флуоресцентных moiety представляет собой значительное химическое изменение. Это изменение может повлиять на физиохимические свойства и антибактериальную активность. Поэтому необходимо проявлять осторожность, чтобы оценить эти факторы, чтобы получить результаты, репрезентативные для родительского антибиотика.

В этой работе описан метод синтеза, оценки и использования флуоресцентных антибиотиков, как в наших предыдущих публикациях14,15,16. В рамках предыдущей работы был подготовлен и использован ряд флуоресцентных антибиотиков для различных целей (см. Камень и др.8). Для минимизации вероятности воздействия на биологическую активность в этой работе используются очень маленькие фторофоры: нитробенксадиазозол (NBD, зеленый) и 7-(диметиламино)-2-оксо-2H-хромн-4-yl (DMACA, синий). Далее описывается оценка антибактериальной активности с использованием минимальной концентрации ингибирования микроброта (MIC), так что можно измерить влияние изменений на активность. Эти флуоресцентно помеченные зонды могут быть использованы в спектрофотометрических анализах, цитометрии потока и микроскопии. Диапазон возможных применений заключается в том, что преимущество флуоресцентных антибиотиков заключается в этом. Сотовая накопление может быть количественно, классифицированы, и визуализированы, что-то не представляется возможным с помощью MS в одиночку. Следует надеяться, что знания, полученные в результате использования флуоресцентных антибиотиков, помогут нам понять устойчивость и бороться с УПП.

Protocol

1. Синтез алкин-фторофоров

  1. Синтез NBD-алкин (7-нитро-N-(prop-2-yn-1-yl)benzoc
    1. Растворите 1031 мг 4-хлоро-7-нитро-бензофуран (5,181 ммоль) в 60 мл тетрагидрофурана (THF). Добавьте 1857 мг CSCO3 (5,696 ммоль), затем 0,39 мл пропаргиламина (6,1 ммоль). Нагрейте реакцию до 50 градусов по Цельсию в течение 2 ч, которая превратится из коричневого в зеленый, затем охладите до комнатной температуры (RT).
    2. Фильтр реакции с помощью фильтрации помощи (см. Таблица материалов),и мыть с этиловый ацетат (EA). Сосредоточьтесь на фильтре под пониженным давлением, затем растворите остатки в 150 мл ЕА и перейдите к 500 мл, разделяющей воронку.
    3. Вымойте раствор EA 100 мл водой и рассолом соответственно. Затем смешайте ваковые фазы и промойте 2x с 100 мл Е.А.
    4. Сушите комбинированные органические фазы над ангислойным сульфатом магния, затем процедите и концентрируйтесь под пониженным давлением.
    5. Очистите сырой продукт с помощью флэш-хроматографии на кремнеземном геле (20-30% EA в нефтяном эфире , проверка чистоты с помощью жидкой хроматографии масс-спектрометрии (LCMS, МЗЗ) и/или ядерной магнитной резонансной (NMR) спектроскопии, химических сдвигов следующим образом:
      1 H NMR (CD3OD, 600 МГц) 8,54 (д, J 8,7 Гц, 1H), 6,35 (д, J 8,4 Гц, 1H), 4,31 (dd, J 5,7 Гц, J 2,5 Гц, 2H), 2,43 (т, J 2,5 Гц, 1H) 13 Год C NMR (CD3OD, 150 МГц) 144,3, 143,7, 142,2, 135,8, 125,7, 100,0, 76,5, 74,2, 33,4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: При выполнении очистки с помощью кремнезема гель хроматографии, подготовить колонку, используя менее полярные из перечисленных растворителей. Сырая смесь может быть загружена в качестве концентрированного раствора или адсорбирована на кремнезем, если растворимость не позволяет этого. После того, как соединение было добавлено в верхней части кремнезема, пробежать через 1-2 колонки объемов же растворителя, используемого для смачивания кремнезема. Затем начните с перечисленного коэффициента растворителя, протекаемого по крайней мере через 1 столбец объема каждого растворителя, и убедитесь, что не делайте больших скачков в составе растворителя. Сбор фракций, и проверить чистоту / идентичность по LCMS или TLC (тонкий слой хроматографии). Комбинат чистых фракций и концентрат под пониженным давлением путем роторного испарения.
  2. Синтез DMACA-алкин (2-(7-(диметиламино)-2-оксо-2H-хромн-4-ил)-N-(prop-2-yn-1-yl)ацетамид).
    1. Растворите 5,02 г 3-(диметиламино)фенола (36,6 ммоль) в 30 мл этанола, затем добавьте 6,7 мл диэтила 1,3-ацетонедикарбоксилата (36 ммоль). Добавьте 10,5 г nCl2 (77,2 ммоль), затем рефлюкс красный раствор для 42 ч. Добавить дополнительные 9,20 г nCl2 (67,6 ммоль), затем рефлюкс для 8 ч.
    2. Охладите реакцию и сконцентрируйтесь под пониженным давлением. Разогнать полученное красное твердое тело в 200 мл Е.А., процедите, затем перенесите на 500 мл, отделяющую воронку.
    3. Вымойте EA с 200 мл каждого из воды и рассола, а затем высушить над ангислой сульфат магния. Фильтр сушеных органических фазы и концентрат под пониженным давлением.
    4. Очистите красный твердый (этил 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2 H-хромн-4-yl)acetate) флэш-хроматографии на кремнезема гель (0-100% EA в PE), проверка чистоты по LCMS (МЗХ) 275.1) и / или NMR, химические сдвиги следующим образом:
      1 H NMR (CDCl3, 600 МГц) 7,30 (д, J 8.9 Гц, 1H), 6.52 (dd, J 8.9 Гц, J 2.6 Гц, 1H), 6.40 (d, J 2.6 Гц, 1H), 5.87 (м, 1H), 2.96 (м, 8H), 2.25 (d, J 1.2 Hz, 3H).
    5. Растворите 488 мг этила 2-(7-(диметиламино)-2-оксо-2 H-хромн-4-yl)ацетат (1,18 мммол) в 10 мл THF, затем добавьте раствор 157 мг ЛиОХ H2O (3,74 ммоль) в 15 мл воды. Перемешать реакцию на RT в течение 3 ч, затем перейти к отделяющей воронке и разбавить дополнительными 50 мл воды.
    6. Вымойте реакционную смесь 2x с 50 мл диэтилового эфира (Et2O), затем вымойте комбинированную органическую фазу 2x с 25 мл воды. Возьмите любой желтый осадок с органическим слоем. Концентрируйте органическую фазу под пониженным давлением с помощью роторного испарителя.
    7. Кислота воднуя фаза до рН 2 с концентрированным HCl, и охладить до 4 градусов по Цельсию в одночасье. Фильтр подкисленной ваквистой фазы и добавить желтый твердых к концентрированной органической фазы.
      ПРИМЕЧАНИЕ: 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-хромн-4-yl)уксусная кислота может быть использована без дальнейшего очищения, но это может быть проверено LCMS (МЗЗ) 247.1) и/или NMR, химические сдвиги следующим образом:
      1 H NMR (CDCl3, 600 МГц) 7,41 (д, J - 9,0 Гц, 1H), 6,62 (dd, J - 9,2 Гц, J - 2,8 Гц, 1H), 6,52 (д, J 2.8 Гц, 1H), 5,98 (д, J 0,9 Гц, 1H), 3,05 (с, 6H), 2,35 (d, J q 0.9 Hz, 2,9 Гц, 2 Hz, 2 Hz, 2H), 3,05 (с, 6H), 2,35 (d, J 13 Год C NMR (CDCl3,150 МГц) 162,2, 155,7, 152,9, 152,8, 125,3, 109,7, 109,3, 109,1, 108,8, 98,3, 40,2, 18,5.
    8. Растворите 466 мг 2-(7-(диметиламино)-2-оксо-2 H-chromen-4-yl)acetic кислоты (1,89 ммоль) в 7 мл сухого N,N-диметилформамида (DMF) и поместить под атмосферу азота.
    9. Растворите 0,33 мл пропаргиламина (5,1 ммоль) в 7 мл сухого DMF под азотом. Добавьте 1,30 мл ди-изопропилэтил амина (DIPEA, 7.50 ммоль) в раствор красителя, затем 535 мг O-(1H-6-хлороготротризол-1-yl)-1,1,3,3-тетраметилурурон гексафторофосфат (HTUC, 1.29 mmol. Перемешать активированный раствор красителя в течение 15 минут на RT, затем добавить раствор амина dropwise, и оставить перемешать на ночь.
    10. На следующий день разбавить реакцию 35 мл воды, затем концентрируйте под пониженным давлением.
    11. Разделите результирующее оранжевое твердое тело между EA и рассолом (100 мл каждый) в 250 мл, разделяющей воронку. Разделите слои (запустите два слоя в разные фляги) и промойте ваковую фазу 100 мл Е.А.
    12. Сосредоточьтесь на комбинированных органических фазах под пониженным давлением, затем распустите оранжевое твердое вещество в 3 мл 1:1 ацетонитрила (ACN)/воды (v/v). Очистите сырой продукт путем введения на обратную фазу среднего давления жидкой хроматографии (MPLC) системы оснащены картриджа C18 колонки (растворитель: вода, растворитель B: ACN).
    13. Проверьте фракции на чистоту по LCMS (МЗХЗ) 284,1, NMR химических сдвигов, приведенных ниже), а затем объединить и лиофилизировать соответствующие фракции, чтобы дать 2-(7-(dimethylamino)-2-oxo-2H-хромн-4-yl)- N -(prop-2-yn-1-yl)acetamide, NMR химический сдвиг следующим образом:N-(prop-2-yn-1-yl)acetande
      1 H NMR (600 МГц, DMSO-d6) 8,65 (т, J - 5,4 Гц, 1 H), 7,52 (d, J - 9,0 Гц, 1H), 6,72 (dd, J - 9,1, 2,6 Гц, 1H), 6,55 (d, J 2,6 Гц, 1H), 6,00 (ы, 1H), 3,88-3,87 (м, 2H), 3,62 (ы, 2H), 3,13 (т, J 2,5 Гц, 1H), 3,01 (ы, 6H); 13 Год C NMR (125 МГц, ДМСО-д6) 167,7, 160,7, 155,4, 152,9, 151,0, 126,0, 109,4, 109,1, 108.1, 97,5, 80,9, 73,3, 39,7, 38,48

2. Синтез флуоресцентных антибиотиков

  1. Подготовка азид-производного антибиотика, как описано ранее14,15,16.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура специфична для каждого антибиотика и требует тщательного изучения структуры отношения деятельности (SAR) родительской молекулы, чтобы гарантировать, что функционализированный антибиотик сохраняет активность, сравнимую с родителем. (например, ципрофлоксацин16,линезолид14и триметоприм15). См. Рисунок 1 для примеров опубликованных флуоресцентных антибиотиков, а также общей схемы синтеза.
  2. Нажмите на процедуру реакции A
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для большинства антибиотиков, следуйте процедуре, подробно описанной здесь для меди катализировали Huisgen (2'3" цикловдуги азида (шаг 2.1) и флуоресцентный алкин (подготовлен в шаге 1).
    1. Поместите азидея-антибиотик в круглую нижнюю колбу и добавьте терт-бутанол(tBuOH) и воду (1:1 v/v, 25 мл каждый на азид ммоль).
    2. Добавьте фторофор-алкин, приготовленный в шаге 1.1 (3 экв.) и нагрейте реакцию до 50 градусов по Цельсию. Затем добавьте медный сульфат (100 мм в воде, 0,6 кв.м.) к реакции, за которой следует аскорбиновая кислота (500 мм в воде, 2,4 ц/с.).
    3. Перемешать реакцию при 50 градусах по Цельсию в течение 1 ч, или до анализа LCMS при указании на завершение реакции (полное потребление стартового азида).
    4. Охладить реакцию и очистить по мере необходимости для антибиотиков эшафот и приступить к очистке либо шаг 2.3 или 2.4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Возможны несколько различных методов очистки, в зависимости от полярности и стабильности эшафота.
  3. Нажмите на процедуру реакции B
    ПРИМЕЧАНИЕ: Следуйте этой процедуре для пептидных антибиотиков на основе, чтобы обеспечить более сильные условия реакции (неопубликованная работа, Фетсанг, 2019).
    1. Поместите пептид ный азид-антибиотик в круглую нижнюю колбу и добавьте достаточно DMF (750 мл/моль азиде), чтобы раствориться.
    2. Добавьте фторофор-алкин, приготовленный в шаге 1 (5 экв.) и нагрейте реакцию до 50 градусов по Цельсию в течение 1 ч.
    3. Добавьте медь (I) йодид (20 экв.), затем DIPEA (120 eq.), затем уксусную кислоту (240 eq.).
    4. Перемешать реакцию при 50 градусах по Цельсию в течение 1 ч, или до тех пор, пока анализ LCMS не упоказывает завершение реакции (т.е. полное потребление стартового азида). Охладить реакцию и приступить к очищению методом 1 (см. шаг 2.3).
  4. Метод очистки 1 (используется для ципрофлоксацина, триметоприма и линезолида)
    1. Введите охлажденный клик реакции непосредственно на MPLC C18 картриджа колонки.
    2. Включите длинную фазу стирки (примерно 10 мин) в начале запуска (100% растворителя А), затем запустите градиент до 100% растворителя B, а затем возврат к растворителю А.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Растворитель А может быть выбран из воды, 0,05-0,1% для фосовой кислоты (ФА) в воде, 0,05-0,1% трифтороацетической кислоты (TFA) в воде, в зависимости от растворимости, стабильности и наилучшего разрешения пиков. Solvent B может быть выбран из ацетонитрила (ACN), 0,05-0,1% FA в ACN, 0,05-0,1% TFA в ACN, чтобы соответствовать растворителю А. Если элуция окажется трудной, метанол может быть использован вместо ACN.
    3. Сбор и объединить соответствующие фракции, как указано на LCMS и цвет (правильная масса видел, сингулярный пик), а затем лиофилизировать, чтобы дать (полу) чистый флуоресцентный антибиотик.
    4. Дальнейшее очищение продукта, если это необходимо. Оцените чистоту по ЯМР и/или LCMS и жидкой хроматографии высокого давления (HPLC), используя колонку и метод, подходящий для эшафота.
  5. Метод очистки 2
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если растворимость позволяет, prepurification может быть проведена aqueous workup (используется для макролидов, неопубликованные работы, Камень 2019).
    1. Разбавить охлажденный клик реакции с водой и Et2O (1:1 v/v, примерно 10-раз раз разбавления от первоначального объема реакции), переход явился в соответствующий размер разделения воронки.
    2. Разделите слои и промойте вавную фазу дважды с et2O.
    3. Вымойте комбинированные органические фазы 2x с водой (равный объем с органической фазой), затем высушите над Na2SO4.
    4. Фильтр сушеных органических фазы и концентрат под пониженным давлением.
    5. Очистка сырого продукта MPLC и/или HPLC, как описано в шаге 2.4.4.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смотрите рисунок 2 для примеров неполных, полных и очищенных следов реакции нажмите LCMS. Типичные очищенные урожаи для антибиотико-фторфора кликов реакции варьируются от 30-80%.
      ВНИМАНИЕ: Большинство химических веществ, используемых в этих синтезах, обладают особыми опасностями для безопасности. Следует всегда соблюдать осторожность, в том числе с использованием средств индивидуальной защиты. Et2O, tBuOH, FA, уксусная кислота, PE, EA, THF, ACN, DMF, EtOH, DIPEA, пропаргиламин и HCTU все легковоспламеняющиеся; избегать контакта с источниками тепла или искры. THF, пропаргиламин, DIPEA, tBuOH, FA, DMF, и PE все токсичны; избежать воздействия. Пропаргиламин, CsCO3, NCl2, LiOH-H2O, DIPEA, CuI, FA, уксусная кислота, и HCl все коррозионные; избегать контакта и быть в курсе контакта поверхности. NCl2, CuSO4, CuI, и PE представляют экологические опасности; помнить об условиях утилизации. THF может образовывать взрывоопасные перекиси; заботиться об условиях хранения. Органические азиды взрывоопасны; заботиться особенно с крупномасштабным производством.

3. Оценка противомикробной активности

ПРИМЕЧАНИЕ: Все работы с участием бактерий должны проводиться в стерильных условиях, чтобы избежать загрязнения либо ассаида или лаборатории. Все носители должны быть автоматически автоматически перед использованием, а пластичная посуда и оборудование, такие как пипетки, должны быть стерильными. Рекомендуется, чтобы работа была сделана в биоконтейнерном капоте (тип 2).

  1. Streak glycerol запасы бактериальных штаммов, подходящих для антибиотиков эшафот на лисогенный бульон агар (LB, подготовленный в инструкции производителя), и расти в одночасье при 37 градусов по Цельсию.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выбор бактерий для тестирования антибактериальной активности должны быть сделаны на основе антибиотиков эшафот используется. Представительный диапазон 5-10 бактерий должны быть выбраны из видов, которые, как известно, восприимчивы к антибиотику, с учетом материально-технических возможностей лаборатории. Если это возможно, устойчивые бактерии также должны быть проверены. Протокол, приведенный ниже будет работать на большинстве бактерий, но проверить, если специальные условия необходимы (например, CO2, специальные средства массовой информации) и внести изменения по мере необходимости. Бактерии успешно асссис с помощью этих условий включают стафилококки, streptococci, Bacilli, E. coli, Klebsiella пневмонии, Pseudomonas aeruginosa, и Enterococcus faecium.
  2. Выберите одну колонию из пластины, и культура ночь в 5 мл катионов скорректированы Мюллер-Хинтон бульон (CAMHB, подготовленный в инструкции производителя) на 37 градусов по Цельсию.
  3. Разбавить ночные культуры в 40 раз в CAMHB и вырасти до середины журнала фазы, оптическая плотность на 600 нм (OD600) 0,4-0,8, объем 5 мл).
  4. Подготовьте стоковые растворы каждого флуоресцентного антибиотика при 1,28 мг/мл в стерильной воде и пипетке 10 л антибиотика к первому столбику пластины 96 скважин.
  5. Добавьте 90 кЛ CAMHB к первой колонке и 50 Зл ко всем другим скважинам. Затем выполните серийное 2-кратное разбавление по перечне.
  6. Тщательно перемешать, затем разбавить среднего журнала фазы культур до 106 колоний формирования единиц (CFU) / мл и добавить 50 qL для всех скважин, чтобы обеспечить окончательную концентрацию 5 х 105 CFU / мл.

    объем культуры (мЛ) (объем мультимедиа в мЛ)/(OD600 x 1000)

    например, для культуры OD600 и 0.5 в желаемом объеме носителя 12 мл, добавьте (12/(0.5 x 1.000) и 0.024 мл культуры до 12 мл носителей
  7. Накройте тарелки крышками и инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 18-24 ч без тряски.
  8. Визуально осматривать пластины, при этом MIC является самой низкой концентрацией, не имея видимого роста.
    ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу 1 для некоторых примеров активных и неактивных флуоресцентных антибиотиков.

4. Анализ накопления зонда спектрофотометрией и цитометрией потока

ПРИМЕЧАНИЕ: Эти центрифугации раз были оптимизированы для кишечной палочки, так что небольшие изменения могут быть необходимы для других видов. Представлены репрезентативные данные для накопления зонда для зонда ципрофлоксацина с маркировкой NBD.

  1. Полоса глицерола запасов бактериальных штаммов на LB агар и расти в одночасье при 37 градусов по Цельсию.
  2. Выберите одну колонию из тарелки и культуры на ночь в LB на 37 градусов по Цельсию.
  3. Разбавить ночные культуры в 50 раз в средствах массовой информации и вырасти до середины журнала фазы (OD600 и 0,4-0,8).
  4. Centrifuge культур на 1470 х г в течение 25 мин и decant средств массовой информации.
  5. Приостановите бактерии в 1 мл фосфат-буферизированного сосудистого раствора (PBS), затем центрифугу на 1470 х г в течение 15 мин.
  6. Декант средств массовой информации и resuspend промываютграмые гранулы в PBS до окончательного OD600 и 2.
  7. При желании добавьте 10,1 л карбонила цианида 3-хлорофенигидразона (CCCP, 10 мМ в PBS) до 1 мл бактерий (окончательная концентрация 100 мкм) и инкубировать при 37 градусах По чен не менее 10 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: CCCP является ингибитором насоса efflux. Добавление CCCP позволит изучить влияние efflux.
  8. Centrifuge культур на 18000 х г в течение 4 мин при 20 градусов по Цельсию и decant средств массовой информации.
  9. Добавьте 1 мл флуоресцентного антибиотикодума (10–100 мкм в PBS) в гранулы и инкубинуприте при 37 градусах По цельсию в течение 30 мин.
  10. Centrifuge культур на 18000 х г в течение 7 мин при 4 кс и decant средств массовой информации.
  11. Resuspend бактерий в 1 мл холодного PBS, и повторить шаг 4.9.
  12. Повторите шаг 4.10 в общей сложности 4x.
  13. При желании, лисбактерии, добавив 180 л люцис буфера (20 мм Tris-HCl, рН 8,0, и 2 мМ натрия EDTA), то 70 л лиззима (72 мг/мл в H2O).
  14. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение 30 мин, затем заморозить оттепель 3x (78 градусов по Цельсию в течение 5 мин, затем 34 градусов по Цельсию в течение 15 мин).
  15. Сножайте образцы в течение 20 мин, затем нагревайте до 65 градусов по Цельсию в течение 30 мин.
  16. Centrifuge лиизированные образцы (18000 х г,8 мин), затем фильтр через 10 kDa фильтр мембраны.
  17. Вымойте фильтр 4x с 100 л воды.
  18. Перенесите лисат на плоскую нижнюю черную пластину 96 скважин и измерьте интенсивность флуоресценции на считывателе пластин с возбуждением и длинами волн, подходящими для фторофора (т.е. DMACA: qex 400 нм,em 490 нм; НБД: йе- 475 нм,й ет - 545 нм).
    ПРИМЕЧАНИЕ: См Рисунок 3 для примеров спектрофотометрического анализа бактерий с использованием флуоресцентных NBD-маркированных антибиотикципрофлоксацин.
  19. Для анализа по цитометрии потока могут использоваться те же условия роста и окрашивания (шаги 4.1-4.17), с изменениями исключительно в окончательной подготовке.
    1. Довести общий объем до 1 мл PBS.
    2. Прочитайте образцы на цитометре потока со скоростью потока около 60 л/мин, используя логарифмическое усиление для получения данных (F1 excitation - 488 нм; излучение 525/20 нм).
    3. Запишите в общей сложности 10 000 событий, а затем проанализируйте данные с помощью соответствующего программного обеспечения.
    4. Участок флуоресценции интенсивности от F1 против числа событий рассчитывает, оценивая среднюю интенсивность флуоресценции от гистограммы пиков после бактерий был окрашен.
      ПРИМЕЧАНИЕ: См Рисунок 4 для примеров потока цитометрии анализы бактерий с использованием NBD-маркированных антибиотикципрофлоксацин.

5. Подготовка к микроскопическому анализу

  1. Выращивайте субкультуры доOD 600 и 0,4, как для оценки MIC, затем разделите на 1 мл аликвоты и центрифуги на 18000 х г в течение 3-5 мин.
  2. Декант и отбросить средства массовой информации, а затем повторно бактериальных гранул в 500 Зл HBSS.
  3. Центрифуга на 18000 х г в течение 3 мин, затем декант и отбросить средства массовой информации.
  4. Подготовьте растворы антибиотиковых зондов в HBSS в концентрациях 1-100 мкм.
  5. Отрежь промытые бактерии в 500 л раствора зонда и инкубировать при 37 градусах По Цельсия в течение 30 мин.
  6. Повторите шаг 5.3. Для проведения многократного эксперимента по маркировке, повторно приостановить гранулы в 500 л ортогонически цветной нуклеиновой кислоты красителя. Для зеленого цвета используйте Syto9 (5 мкм в HBSS); для синего цвета используйте Hoechst 33342 (20 мкг/мл в HBSS). Инкубировать на RT в течение 15-30 мин.
  7. Повторите шаг 5.3, затем повторно приостановите в 500 л FM4-64FX (5 мкг/мл в HBSS) и инкубировать на RT в течение 5 мин.
  8. Повторите шаг 5.3, затем повторно приостановите в 500 Зл HBSS, и повторите шаг 5.3 еще раз.
  9. Повторите шаг 5.8, затем, наконец, приостановить промывают, окрашенные бактерии в 15 Зл л монтажа среды (см. Таблица материалов).
  10. Pipette монтаж среды на микроскоп слайд и сверху с высокой производительностью покрытия скольжения, а затем уплотнения края с четким лаком для ногтей.
    ПРИМЕЧАНИЕ: См. Рисунок 5 для примеров конфокальной микроскопии изображения, сделанные с NBD-маркированных ципрофлоксацин и триметоприм антибиотики, и Рисунок 6 для DMACA помечены оксазолидинон (линезолид) антибиотик.

Representative Results

Рисунок 1 Иллюстрирует ключевой клик реакции химии (A) для подготовки флуоресцентных антибиотиков, а также с (B) примеры структур наших опубликованных флуоресцентных антибиотиков на основе ципрофлоксацина (ципро), триметоприм (TMP), и linezolid. Все эти зонды были синтезированы из соответствующих антибиотиков через азид промежуточных. Затем они были соединены с фторофорами NBD и DMACA, каждый из которых функционализировался с алкином.

На рисунке 2 показаны следы LCMS из ципрофлоксацина-N3 и NBD-alkyne click reaction, где азид eluted на 3.2 мин и продукт на 3.8 мин. Сравнение 1 и 2 показывает, как прогресс реакции щелчка может сопровождаться исчезновением пика азида (по УФ или MS детектор). Spectra 3 демонстрирует влияние очистки, с ошибочными пиками, исчезают из ms и УФ-следов. Как чистота, так и прогресс реакции могут быть количественно оценены интеграцией пика продукта и любых пиков примесей.

Рисунок 3 демонстрирует типичные результаты оценки внутриклеточного накопления флуоресценцией спектроскопии при наличии и отсутствии эффлюкса. В этом эксперименте, e. coli было обработано с TMP-NBD с или без добавления CCCP, которое разрушает усилие мотива протона (PMF). Внутриклеточная флуоресценция бактерий была значительно выше при предварительном лечении CCCP, что указывает на то, что efflux уменьшило накопление в этих бактериях. Этот эксперимент был повторен с использованием бактерий, недотечанных в толК, отображение способности этого исследования для изучения воздействия отдельных компонентов насоса efflux. В этом случае, хотя было увеличение внутриклеточной флуоресценции по сравнению с бактериями дикого типа, накопление CCCP по-прежнему увеличивается. Эти выводы показывают, что tolC принимает участие в TMP efflux, но не является единственным PMF-диск насос участие.

На рисунке 4 показан результат того же эксперимента, что и рисунок 2,но при накоплении измеряется цитометрией потока вместо спектроскопии. Наблюдались те же тенденции данных, что свидетельствует о том, что любой метод может быть использован для изучения феномена опосредованного внутриклеточного накопления.

На рисунке 5 показаны репрезентативные конфокальные микроскопии изображения грамположительных(S. aureus)и грамотрицательных бактерий(E. coli),помеченных TMP-NBD (1) и cipro-NBD(2 - 3) флуоресцентные зонды, соответственно. В обоих случаях для сравнения локализации был добавлен красный мембранный краситель FM4-64FX. Для TMP-NBD также использовался синий краситель нуклеиновой кислоты Hoechst-33342. Путем наложения этих изображений, локализация антибиотика в бактериях была визуализирована. Сравнение панелей 2 и 3 показывает, как было изучено воздействие эффлюкса, с ингибитором efflux CCCP, используемым в 2,что приводит к внутриклеточному накоплению. В панели 3, не CCCP был добавлен. Таким образом, efflux активен, и никакого накопления зонда не было замечено.

На рисунке 6 показаны репрезентативные конфокальные микроскопии изображений грамположительных (S. aureus) бактерий, помеченных DMACA-маркированным зондом оксазолидинона Lz-NBD. Красный мембранный краситель FM4-64FX был добавлен для того, чтобы сравнить локализацию, и зеленый краситель нуклеиновой кислоты Hoechst-33342 также был использован. Путем наложения этих изображений, локализация антибиотика в бактериях была визуализирована, показывая внутреннюю локализацию, отличную от мембраны и нуклеиновой кислоты.

В таблице 1 показаны значения MIC для трех серий флуоресцентных антибиотиков, ципрофлоксацина, триметоприма (TMP) и линезолида (Lz), с данными, представленными для родительского антибиотика, производных NBD и DMACA каждого из них. Были выбраны представительные виды для каждого антибиотика, в том числе как грамположительные, так и грамотрицательные. Для серии ципрофлоксацина, как флуоресцентные зонды потеряли активность антибиотиков по сравнению с родительским препаратом, но сохранили некоторую активность против всех видов. Аналогичным образом, линейные зонды потеряли некоторую активность, но оставались умеренным и слабым антибиотиком. Зонды TMP потеряли почти всю активность против бактерий дикого типа, но были активны против эффлюкса недостаточной кишечной палочки,указывая, что потеря антибактериальной активности была из-за отсутствия накопления.

Figure 1
Рисунок 1: Синтез и структуры зондов, полученных от антибиотиков. ()Общая схема реакции для синтеза флуоресцентных антибиотиков зондов из азид-антибиотиков и алкин-фторофоров. (B) Структуры наших опубликованных зондов на основе ципрофлоксацина, триметоприма и линезолида. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 2
Рисунок 2: Измерение чистоты зонда, полученного от антибиотиков, с помощью LCMS. Аналитические LCMS следы от (1) неполный, (2) полный, и (3) HPLC очищенный ципрофлоксацин-N3 N NBD-alkyne нажмите реакции, демонстрирующие исчезновение исходного материала по завершении реакции, и различные пики по очистке. А - ультрафиолетовая трасса (абсорбция на 250 нм), трасса B и MS (положительный и отрицательный режим). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 3
Рисунок 3: Измерение считывателя плиты накопления зонда, полученного от антибиотиков. Спектроскопическое измерение клеточного накопления ТМП-НБД (50 мкм) в диком типе (1, ATCC 25922) и NotolC (2, ATCC 25922) E. coli инкубированный(A)с и (B) без добавления CCCP (100 мкм). Статистическая значимость (зп 0,01; »п» 0,001) отображается между отсутствием или присутствием CCCP и между диким типом иtolCE. coli. Данные, представленные являются средними SD для трех экспериментов. Эта цифра адаптирована из нашей предыдущей публикации15, и иллюстрирует использование спектроскопии, чтобы прояснить роль efflux на внутриклеточное накопление. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 4
Рисунок 4: Измерение цитометрии потока накопления зонда, полученного антибиотиками. Измерение цитометрии потока клеточного накопления с использованием TMP-NBD в диком типе (1, ATCC 25922) и QtolC (2, ATCC 25922) E. coli инкубировался с и без добавления CCCP (100 мкм). Медианная активность флуоресценции показана от 10 000 бактериальных событий, Статистическая значимость (яп. ) , р 0,001; , р 0,0001) показана между отсутствием и присутствием CCCP и между диким типом икишечнойпалочкой. Данные, представленные являются средними SD для трех экспериментов. Эта цифра адаптирована из нашей предыдущей публикации15, и иллюстрирует использование цитометрии потока, чтобы выяснить роль efflux на внутриклеточное накопление. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 5
Рисунок 5: Конфокальная микроскопия визуализации nBD-зонда локализации. Конфокальная микроскопия изображений 1) живой S. aureus помечены Hoechst-33342 (синий, нуклеиновая кислота), TMP-NBD (зеленый), FM4-64FX (красный, мембраны), и накладные; 2) жить E. coli, обработанный CCCP (ингибитор омлукса) помечены cipro-NBD (зеленый), FM4-64FX (красный, мембраны), и накладывается; 3) жить Кишечной палочки помечены cipro-NBD (зеленый), FM4-64FX (красный, мембраны), и накладные. Эта цифра адаптирована из наших предыдущих публикаций15,16, и иллюстрирует использование микроскопии для изучения локализации зонда, в том числе влияние efflux. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

Figure 6
Рисунок 6: Конфокальная микроскопия визуализации локализации DMACA-зонда. Конфокальная микроскопическая копия живых S. aureus помечена оксазолидиноном зондом Lz-DMACA (синий), Sytox green (зеленая, нуклеиновая кислота) и FM4-64FX (красный, мембрана). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть большую версию этой цифры.

MIC (мкг/мл)
Видов Деформации Cipro Чипро-НБД Cipro-DMACA Tmp TMP-NBD TMP-DMACA Линезолид (Lz) Lz-NBD Lz-DMACA
Золотистый стафилококк ATCC 25923 0.125 - 0.5 32 - 64 16 1 16 Nogt;64
ATCC 43300 1 16 Nogt;64
Стрептококк пневмонии ATCC 700677 1 4 64
Энтерококк фекиум ATCC 35667 1 - 8 32 32 - 64
ATCC 51559 2 16 32
Клебсиелла пневмония ATCC 13883 0.015 - 0.06 8 - 16 8 - 32
Псевдомонас аэругиноса ATCC 27853 0.25 - 1 32 - 64 32 - 64
Эшеричия палочка ATCC 25922 0,004 евро 8 2 0.5 Nogt;64 Nogt;64
Мутант ЗтолК 0.125 0.25 2

Таблица 1. Антибионовые действия флуоресцентных антибиотиков зондов на основе ципрофлоксацина, триметоприма и линезолида против соответствующих клинически значимых бактериальных штаммов, измеряемых анализами микроразбавления бульона MIC. В большинстве случаев, зонды потеряли некоторую активность по сравнению с родительским препаратом, но сохранили некоторые измеримые антибиотики потенции (достаточно, чтобы быть полезным в дальнейших исследованиях).

Discussion

Создание успешного флуоресцентного антибиотиков зонд должен начаться с тщательного планирования и рассмотрения SAR родительского препарата. Если САР не известно или полностью изучено, возможно, потребуется протестировать несколько вариантов, чтобы найти место, которое может быть выборочно изменено без отмены биологической активности. После того, как сайт / с были определены, установка ссылка moiety часто имеет важное значение для того, чтобы обеспечить стерическое расстояние между биологическим местом действия и неактивных фторфора. Следует позаботиться о том, что реакция, используемая для присоединения связующего к антибиотику, оставляет биостабильную функциональную группу, избегая, например, эфиров, которые подвержены расщеплению эстеразами in vivo. В зависимости от фармакодинамического и фармакокинетического профиля антибиотика, простой алкил связующего может быть использован, или же менее липофильные вариант, такие как полиэтиленгликоль (PEG) связующее должно быть рассмотрено. С связующим прилагается, антибактериальная активность должна быть оценена для обеспечения MICs против соответствующих бактерий похожи на родительское соединение.

В этой работе мы рекомендуем использовать Huigsen azide-alkyne (нажмите химию, см. Рисунок 1)для переливни фторфора к антибиотику, по ряду причин. Реакции нажмите очень избирательны, а это означает, что защита реактивных групп на антибиотикне не является необходимым, и далее, реакция оставляет стабильный, биосовместимый триазол муати. Компонент азида вводится в антибиотик часть в наших процедурах, так как это, как правило, легче выполнить с различными структурными типами, чем введение алкина. Здесь описаны синтезы двух алкин-произвятленных флюорофоров, хотя при желании можно было бы исследовать другие. NBD и DMACA были выбраны из-за их небольшого размера, минимизируя возможность вмешательства в проникновение клеток и целевое взаимодействие. Реакция щелчка сама осуществляется с использованием медного катализа, где либо Cu2 "(CuSO 4, с аскорбиновой кислотой, уменьшающий агент) или Cuq (CuI) может быть использован в качестве стартового реагента. После очистки (Рисунок 2), MICs должны быть проверены, как с азидом. Даже при тщательном рассмотрении выбора фторофора и места привязанности, вполне возможно, что плохая активность антибиотиков будет наблюдаться. Это, однако, не означает, что неактивный зонд не используется. Как показано с зондами TMP, соединения с плохой антибактериальной активностью все еще могут связываться с той же целью, что и родительский препарат. Это может позволить исследования о способе действия и изучение явлений, ведущих к резистентности, таких как efflux.

Как указано в разделе протоколов, можно проанализировать бактериальную маркировку флуоресцентными антибиотиками, используя либо простой спектрофотометрию(рисунок 3),либо цитометрию потока(рисунок 4). Оба метода способны количественно оценить клеточное накопление, а при лизии клеток и изучении локализации флуоресценции в лизате можно оценить внутриклеточное накопление. В этом протоколе описано использование лизозима для клеточного лиза, так как это быстрая, универсальная техника. Другие условия лиза, такие как ночное лечение глицином-HCl7, также успешно используются. Используя этот метод, можно изучить влияние эффлюкса на накопление антибиотиков, что является основным механизмом резистентности. Если efflux действительно присутствует в бактериях, отсутствие внутриклеточного накопления будет наблюдаться, хотя это может быть спасено с помощью ингибитора эффлукс, как CCCP.

Микроскопия может также проводиться для визуальной проверки локализации зонда в различных бактериях, получения информации о режиме действия и потенциально также устойчивости (см. рисунок 5 для репрезентативных примеров). Для того, чтобы увидеть локализацию внутри бактерий, требуется конфокальный микроскоп с высоким разрешением, оснащенный такими возможностями, как SIM (структурированная микроскопия освещения), SR-SIM (суперразрешение-SIM), Airyscan или STED (стимулированное истощение выбросов). Кроме того, следует использовать высокопроизводительные квитанции о крышках и послевизуализации анализ, проведенный на соответствующем программном обеспечении (например, FIJI, Дзен или Imaris). Локализация зондов сравнивается с красителем, которые окрашивали специфические архитектуры, такие как Hoechst-33342 (синяя, нуклеиновая кислота), Syto-9 (зеленая, нуклеиновая кислота) и FM4-64FX (красный, мембрана). Выбор красителей должен быть сделан в соответствии с флуоресцентным антибиотиком, так что каждый используемый цвет имеет минимальное спектральное перекрытие. Для получения наилучших изображений может потребоваться оптимизация. Например, если бактерии слишком переполнены на слайде, возьмите только часть взвешенных гранул, затем разбавьте более монтажной средой. В отличие от этого, если бактерии слишком редки на слайде, просто начните с более бактерий. В этом протоколе, использование термообратимого геля, который совместим с живыми клетками (например, Cygel) рекомендуется для визуализации живых клеток, так как он обездвиживает бактерии (в том числе мотилированные бактерии), но другие монтажные средства массовой информации или агарозы также успешно используются.

В целом, несмотря на проблемы, с которыми могут столкнуться при подготовке биологически активных флуоресцентных производных антибиотиков, простота их использования и их универсальность делают эти зонды привлекательными инструментами для исследований в AMR. Будущая работа с использованием флуоресцентных антибиотиков может дать представление о механизмах устойчивости к антибиотикам, улучшить наше понимание того, как работают современные антибиотики, и помочь в разработке более эффективных лекарств.

Disclosures

Авторам нечего декларировать.

Acknowledgments

MRLS поддерживается Австралийской премией аспирантов (APA) и Премией Научно-исследовательского института молекулярной бионауки. Ванида Фетсанг была поддержана Международной стипендией «УК» (УКИ) и премией IMB Postgraduate Award (IMBPA). MAC является nHMRC принцип научно-исследовательский научный сотрудник (APP1059354), а также имеет дробный профессорский научный сотрудник назначения в Университете Квинсленда, с его оставшееся время в качестве генерального директора Inflazome Ltd, компания, разрабатывающая препараты для решения клинических неудовлетворенных потребностей в воспалительных заболеваниях. MATB частично поддерживается Wellcome Trust Стратегический грант WT1104797/q/14/) и NHMRC развития грант app11113719. Микроскопия была проведена в Австралийском фонде исследований рака (ACRF)/Институт молекулярной бионауки о биологии рака Imaging Foundation, который был создан при поддержке ACRF.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
3-(dimethylamino)phenol Alfa-Aesar B23067
4-chloro-7-nitro-benzofuran Sigma-Aldrich 163260-5G
Amicon Ultra-0.5 centrifugal filter unit with Ultracel- 10 membrane Merck UFC501096
Atlantis Prep T3 OBD (100 A, 5 uM, 10x250 mm) Waters 186008205
Atlantis T3 column (100 A, 5 uM, 2.1 × 50 mm) Waters 186003734
Bruker Avance 600 MHz spectrometer Bruker
Buchi Reveleris C18 12g Cartridge Buchi BUC145152103
CCCP Sigma-Aldrich C2759
Celite 545 Sigma-Aldrich 22140-5KG-F
Cygel ABCAM Ab109204
Elyra PS,1 SIM/STORM confocal microscope Zeiss
FM4-64FX, fixable analog of FM™ 4-64 membrane stain Life Technologies Australia Pt F34653
Gallios flow cytometer Beckman Coulter
Gamma 2-16 LSCplus lyophilise CHRIST
Gilson HPLC 2020 Gilson
Hanks' Balanced Salt solution, Modified, with sodium bicarbonate, without phenol red, calcium chloride and magnesium sulfate, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture Sigma-Aldrich H6648-500ML
Hettich Zentrifugen Rotofix 32 Hettich
High performance #1.5 cover slips (18 x 18 mm) Schott/Zeiss 474030-9000-000
Hoechst 33342, Trihydrochloride, Trihydrate - Fluo Life Technologies Australia Pt H21492
LB AMRESCO J106
Leica STED 3X Super Resolution Microscope with White Light Laser excitation Leica
Lysozyme from chicken egg white
lyophilized powder		 Sigma-Aldrich L6876
Mueller Hinton II Broth Cation adjusted Becton Dickinson 212322
Propargylamine Sigma-Aldrich P50900-5G
Reveleris GRACE MPLC Buchi
Shimadzu LCMS-2020 Shimadzu
Sigma 1-15 Microcentrifuge Sigma-Aldrich
Silica gel 60 (0.040-0.063 mm) for column chromatography (230-400 mesh ASTM) Merck 1093859025
SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain Life Technologies Australia Pt S34854
TECAN Infinite M1000 PRO TECAN

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Cai, H., Rose, K., Liang, L. H., Dunham, S., Stover, C. Development of a liquid chromatography/mass spectrometry-based drug accumulation assay in Pseudomonas aeruginosa. Analytical Biochemistry. 385 (2), 321-325 (2009).
  2. Bhat, J., Narayan, A., Venkatraman, J., Chatterji, M. LC-MS based assay to measure intracellular compound levels in Mycobacterium smegmatis: Linking compound levels to cellular potency. Journal of Microbiological Methods. 94 (2), 152-158 (2013).
  3. Davis, T. D., Gerry, C. J., Tan, D. S. General Platform for Systematic Quantitative Evaluation of Small-Molecule Permeability in Bacteria. ACS Chemical Biology. 9 (11), 2535-2544 (2014).
  4. Richter, M. F., et al. Predictive compound accumulation rules yield a broad-spectrum antibiotic. Nature. 545, 299 (2017).
  5. Iyer, R., et al. Evaluating LC-MS/MS To Measure Accumulation of Compounds within Bacteria. ACS Infectious Diseases. 4 (9), 1336-1345 (2018).
  6. Prochnow, H., et al. Subcellular Quantification of Uptake in Gram-Negative Bacteria. Analytical Chemistry. 91 (3), 1863-1872 (2019).
  7. Dumont, E., et al. Antibiotics and efflux: combined spectrofluorimetry and mass spectrometry to evaluate the involvement of concentration and efflux activity in antibiotic intracellular accumulation. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 74 (1), 58-65 (2019).
  8. Stone, M. R. L., Butler, M. S., Phetsang, W., Cooper, M. A., Blaskovich, M. A. T. Fluorescent Antibiotics: New Research Tools to Fight Antibiotic Resistance. Trends in Biotechnology. 36 (5), 523-536 (2018).
  9. Piddock, L. J. V., Johnson, M. M. Accumulation of 10 fluoroquinolones by wild-type or efflux mutant Streptococcus pneumoniae. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 46 (3), 813-820 (2002).
  10. Mortimer, P. G. S., Piddock, L. J. V. A comparison of methods used for measuring the accumulation of quinolones by enterobacteriaceae, pseudomonas aeruginosa and staphylococcus aureus. Journal of Antimicrobial Chemotherapy. 28 (5), 639-653 (1991).
  11. Li, X. Z., Nikaido, H., Poole, K. Role of MexA-MexB-OprM in antibiotic efflux in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 39 (9), 1948-1953 (1995).
  12. Vince, R., Weiss, D., Pestka, S. Binding of N-substituted erythromycylamines to ribosomes. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 9 (1), 131-136 (1976).
  13. Vazquez, D. Antibiotics affecting chloramphenicol uptake by bacteria Their effect on amino acid incorporation in a cell-free system. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Nucleic Acids and Protein Synthesis. 114 (2), 289-295 (1966).
  14. Phetsang, W., et al. An azido-oxazolidinone antibiotic for live bacterial cell imaging and generation of antibiotic variants. Bioorganic and Medicinal Chemistry. 22 (16), 4490-4498 (2014).
  15. Phetsang, W., et al. Fluorescent trimethoprim conjugate probes to assess drug accumulation in wild type and mutant Escherichia coli. ACS Infectious Diseases. 2 (10), 688-701 (2016).
  16. Stone, M. R. L., et al. Fluoroquinolone-derived fluorescent probes for studies of bacterial penetration and efflux. MedChemComm. 10 (6), 901-906 (2019).

Tags

Иммунология и инфекция Выпуск 157 антибиотик резистентность бактерии эффлукс флуоресцентные микроскопия
Визуализация бактериальной резистентности с использованием флуоресцентных антибиотиков
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Stone, M. R. L., Phetsang, W.,… More

Stone, M. R. L., Phetsang, W., Cooper, M. A., Blaskovich, M. A. T. Visualization of Bacterial Resistance using Fluorescent Antibiotic Probes. J. Vis. Exp. (157), e60743, doi:10.3791/60743 (2020).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter