Summary
هنا نحن نصف أساليب استخدام الفاصل الزمني، والمجهر المرحلة التباين لتصوير البلعامة المقيم الماوس في التدرج المكمل الكيميائي C5a. يمكن توسيع البروتوكولات إلى الخلايا المناعية الأخرى.
Abstract
Chemotaxis هو التوجيه بوساطة مستقبلات الخلايا على طول التدرج الكيميائي، في حين chemokinesis هو تحفيز حركية الخلايا عشوائية من قبل مادة كيميائية. العلاج الكيميائي وchemotaxis أساسية لتعبئة ونشر الخلايا المناعية. على سبيل المثال، يمكن لchemokines (السيتوكينات الكيميائية) تجنيد العدلات وأحاديات الخلايا المتداولة بسرعة إلى مواقع خارج الأوعية الدموية للالتهاب. مستقبلات المنجذبة الكيميائية تنتمي إلى عائلة كبيرة من مستقبلات G التي تقترن بالبروتين. كيف chemoattractant (أي ligand) التدرجات الهجرة الخلايا المباشرة عبر G البروتين مقرونة بإشارات مستقبلات لم يفهم تماما بعد. في مجال علم المناعة، العدلات هي خلايا نموذج شعبية لدراسة chemotaxis في المختبر. هنا نحن نصف في الوقت الحقيقي ثنائي الأبعاد (2D) chemotaxis assay مصممة خصيصا للالضامة الماوس المقيمين، والتي كانت تقليديا أكثر صعوبة في الدراسة. تتحرك الضامة بوتيرة بطيئة تبلغ ~ 1 ميكرومتر/دقيقة على سطح 2D وهي أقل ملاءمة لمقالات الهجرة من مصدر نقطة (على سبيل المثال، الهجرة نحو غيض من ميكروبيبيت مليئة بالمعالج الكيميائي) من العدلات أو ديسكو ديكلوستيليوم، والتي تحرك ترتيب استياب أسرع. مقالات ترانسويل المستخدمة على نطاق واسع مفيدة لدراسة النشاط الكيميائي للمواد المختلفة ، ولكنها لا توفر معلومات عن مورفولوجيا الخلايا أو السرعة أو الملاحة الكيميائية. هنا نحن نصف الوقت الفاصل المجهري القائم على القول الكيميائي التكيس الكلية التي تسمح بالقياس الكمي لسرعة الخلية وكفاءة التكتيك الكيميائي ويوفر منصة لتحديد محولات، ومسارات الإشارة، وتأثيرات chemotaxis.
Introduction
الخلايا المناعية عادة ما تهاجر بشكل مُنسَب على سطح 2D بطريقة الأميبويد1,2, الذي ينطوي على دورات متكررة من نتوء الجبهة, الالتصاق الخلايا بوساطة integrin, وتراجع من الخلف. خطوة شرط أساسي هو الاستقطاب الخلية، التي تشكل الخلايا الأمامية والخلفية ينتهي3. Chemotaxis يبدأ مع الكشف عن chemoattractants من قبل مستقبلات G البروتين المقترنة بالبروتين وشبكة الإشارات المعقدة بوساطة الغشاء الراسية بروتينات G غير الستيروتيرية والبروتينات الصغيرة G أحادية، فضلا عن عوامل تبادل النيوكليوتيدات الفوسفوليبيد (GEFs)4,5. تفعيل RHO GTPases من CDC42 وراك الأسر الفرعية تحفز نتوءات في الجبهة6 وأعضاء الأسرة الفرعية Rho, خصوصا RhoA, تنشيط انكماش الخلفية5,7. في بيئة ثلاثية الأبعاد (3D) ، integrins زائدة إلى حد كبير عن هجرة الكريات البيض وRhoA يصبح أكثر أهمية لعصر الخلايا من خلال الممرات الضيقة8، في حين CDC42 - أو Rac الناجمة عن نشاط Arp2 /3 لا يزال مهمًا لتوجيه chemotactic9،10.
قد تواجه الخلايا المناعية مواد جذب كيميائي مختلفة، خاصة في إعدادات إصابة الأنسجة، وغزو مسببات الأمراض، والالتهاب. يتم إنشاء المنجذبات الكيميائية الذاتية التي يتم التعبير عنها على البلعوم C3a و C5a ، بسرعة عن طريق تنشيط السلسلة التعاقبية المكملة ، ويتم التعرف عليها من خلال مستقبلات C3a و C5a المكملة. وبالمثل، الخلايا النخرية تجنيد البلعوم عبر مستقبلات الببتيد formyl، والتي تعترف الميتوكوندريا المستمدة وكذلك الببتيدات formyl المستمدة من البكتيريا11. الخلايا المناعية أيضا التعبير عن مستقبلات G البروتين المقترنة لchemokines, عائلة كبيرة من الببتيدات chemoattractant تشارك في تنظيم الاتجار بالخلايا المناعية خلال كل من التوازن والالتهاب. يتم تصنيف Chemokines إلى أربع مجموعات اعتمادا على التباعد بين أول اثنين من السيستين (C) بقايا: C, CC, CXC, وCX3C السيتوكينات, حيث X هو حمض أميني. وبالتالي، في الخلايا المناعية على الجسم الحي تحتاج إلى الاستجابة بشكل مناسب للإشارات المكانية والزمنية معقدة للغاية، مما يجعل دراسة chemotaxis مهمة شاقة. وفيما يلي نقدم لمحة تاريخية عن chemotaxis، والتي بدأت مع نهج التصوير intravital.
دراسة الكريات البيض chemotaxis يعود تاريخها إلى 188812, عندما وصف طبيب العيون ثيودور كارل غوستاف ليبر بوضوح الهجرة الموجهة من الكريات البيض إلى, وتراكم في, مواقع الالتهاب في نموذج من التهاب الكيراتي (الفطرية) النخاعي. وأكد ليبر أن جذب الكريات البيض الزائدة من قبل المواد المشتقة من مسببات الأمراض مهم للقضاء على الكائنات الحية الدقيقة الضارة عن طريق البلعوم ، والتي وصفها Metchnikoff (المعروف أيضا باسم Metschnikoff) في وقت سابق من نفس العقد13. في التجارب على الفيفو كما أجريت في 1920s كلارك وكلارك14,15, الذي استغل شفافية الشراغوف وأظهرت أن التهاب معقم الناجمة عن زيت الكروتون14 أو غيرها من المهيجات15 تسبب الكريات البيض على الالتزام الأوعية الدموية, تليها diapedesis (الهجرة عبر الاندوسلي) والهجرة السريعة من خلال مساحات الأنسجة نحو المهيجات. في المختبر التجارب باستخدام طريقة التصوير المجهري التي وضعها جان كوماندون16 أظهرت أن الكريات البيض هاجرت نحو مصدر الجسيمات chemoattractant مثل البكتيريا17. في ذلك الوقت، كانت الهويات الجزيئية للعوامل الكيميائية غير معروفة. في 1960s، ستيفن بويدن18 اعترف بأن تقنيات لدراسة النشاط الكيميائي للمواد القابلة للذوبان كانت تفتقر. ابتكر غرفة، تعرف فيما بعد باسم غرفة بويدن، مع حجرتين يفصل بينهما غشاء ورق مرشح. يتم إضافة تعليق الخلية إلى المقصورة العليا ويتم إضافة مادة الاختبار إما إلى كلا المقصورات أو إلى المقصورة السفلية فقط. بعد فترة الحضانة ، تتم إزالة غشاء الفلتر ، ويتم إصلاح الخلايا وتلطيخها. من خلال مقارنة عدد الخلايا التي تهاجر عبر غشاء الفلتر نحو البئر السفلي مع مادة الاختبار في كلا المقصورات ، أو في أي من المقصورة ، أو فقط في المقصورة السفلية ، يمكن تحديد النشاط الكيميائي. المقالات الترانسويل لا تزال شعبية اليوم وتم تعديلها بطرق مختلفة، بما في ذلك استخدام أغشية البولي المختلفة مع أحجام المسام المحددة والكثافات19،20. عيب رئيسي من المقالات Transwell هو أنه من غير العملي تصور الخلايا الهجرة مباشرة ومسار الهجرة عبر الغشاء عادة لا يتجاوز قطر الخلية المناعية.
وضعت سالي H. زيغموند غرفة chemotaxis21 التي مكنت التصور من كل من تشكيل التدرج ومورفولوجيا الخلية باستخدام الأصباغ الفلورية. تتكون الغرفة من شريحة زجاج شبكي (أكريليك) مع بئرين خطيين متوازيين ، كل منهما بحجم 100 ميكرولتر ~ ، يفصل بينهما جسر بعرض 1 مم 3-10 ميكرومتر تحت المستوى العلوي للشريحة. يتم عكس غطاء مبذر مع الخلايا ووضعها على الشريحة بحيث تمتد على البئرين. بعد إضافة chemoattractant إلى واحدة من الآبار، وانحدار أشكال التدرج الكيميائي عبر الجسر، وعادة في غضون 30-90 دقيقة. ويلاحظ الكريات البيض متعددة الأشكال النووية البشرية (الخلايا الحبيبية) في غرفة زيغموند توجيه أنفسهم نحو chemoattractant. وقد تم الإبلاغ عن اختلافات في غرفة زيغموند، بما في ذلك غرف دان22 وInsall23، وكلاهما يستخدم غطاء مبذر مع خلايا وضعت عبر بئرين يفصل بينهما جسر بعرض 1 مم. تتكون غرفة دان من آبار متحدة المركز يفصل بينها جسر دائري ، في حين أن غرفة Insall أكثر ارتباطًا بغرفة Zigmond ، ولكنها توفر جسورًا بعرضين مختلفين ، 0.5 مم و 1 مم. وقد وصفت غرفة العلاج الكيميائي رواية، يطلق عليها μ-الشريحة Chemotaxis وتصنيعها عن طريق صب حقن البلاستيك، من قبل زيمجيل وآخرون24. تتكون غرفة التكيس الكيميائي من خزانين 40 ميكرولتر تفصل بينهما قناة بعرض 1 مم بطول 2 مم وارتفاع 70 ميكرومتر. الجزء السفلي من الغرفة يتم تشكيله من قبل ورقة بلاستيكية رقيقة وقابلة للنفاذة بالغاز بنفس السماكة والخصائص البصرية لغطاء زجاجي رقم 1.524. هنا نصف قاز chemotaxis باستخدام غرفة Chemotaxis μ-Slide لتصور هجرة الضامة الجبقية المقيمة للفأرة لمدة تصل إلى 14 ساعة في تدرج chemotactic (مكمل C5a).
Protocol
تتبع البروتوكولات المبادئ التوجيهية للجنة أخلاقيات البحث المحلية لدينا، وكذلك المبادئ التوجيهية لرعاية الحيوانات.
ملاحظة: يوضح الشكل 1 سير عمل من القول chemotaxis.
1. قبل ملء الشرائح Chemotaxis
-
Prefill 1 مم واسعة و 2 مم قنوات ربط طويلة من واحد أو اثنين من الشرائح chemotaxis باستخدام معدلة RPMI 1640 HEPES المتوسطة، وتتكون من بيكربونات خالية RPMI 1640 المتوسطة التي تحتوي على 20 mM 4-(2-hydroxyethyl حمض)-1-piperazineethanesulfonic (HEPES)، 10٪ من المصل البقري الجنيني المعطلة بالحرارة (FBS)، والمضادات الحيوية مثل البنسلين (100 U/mL) والعقديات (100 ميكروغرام/مل)، التي أعدت عن طريق تخفيف 100x البنسلين/العقديات، و 1 ميكروغرام / مل lipopolysaccharide (من E. القولونية)، ومستقبلات مثل حصيلة 4 ليغاند المستخدمة لتنشيط الخلايا.
- وضع شريحة chemotaxis(الشكل 2A)في جولة (10 سم قطرها) طبق ثقافة الخلية، وكلاهما محمّى مسبقا إلى 37 درجة مئوية، وتعيين الطبق على كتلة الألومنيوم ساخنة (37 درجة مئوية). إدراج المقابس في المنافذ 1 و 4(الشكل 2B).
ملاحظة: كتلة الألومنيوم الحفاظ على 37 درجة مئوية ووضعها داخل غطاء تدفق لاميمفيدة مفيد لإعداد غرف chemotaxis. من الناحية المثالية ، يجب أن توفر الكتلة الساخنة منطقة عمل مسطحة وآبارًا لمختلف الأنابيب ، مثل أنابيب 50 مل وأنابيب الطرد المركزي الدقيقة 2 مل. - باستخدام تلميح ماصة 10-200 ميكرولتر مع طرف مبسد ، قم بإيداع 15 ميكرولتر من RPMI المعدلة 1640 HEPES المتوسطة في منفذ التعبئة 3(الشكل 2B). بعد ذلك ، مع حجم لا يزال تعيين في 15 μL وزر التحكم من (2-20 μL حجم) ماصة الاكتئاب ، وإدراج تلميح ماصة في الميناء 2 ونسخ 15 μL بمعدل سريع معتدل(الشكل 2B). وهذا من شأنها أن تملأ مسبقا قناة الربط 1 مم × 2 ملم (منطقة المراقبة)، فضلا عن قناتي الإمداد المحيطتين (بين منطقة المراقبة المركزية والموانئ 2 و 3، على التوالي). تغطية ملء الموانئ 2 و 3 مع قبعات.
- بعد التعبئة المسبقة، ضع شرائح chemotaxis على رف محفوظ في غرفة رطوبة مغلقة داخل حاضنة جافة وخالية من CO2عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: من المهم استخدام تلميح ماصة الصحيح لملء الشريحة chemotaxis. وشرائح الماصة المنحرفة في الجزء العلوي من ميناء التعبئة، في حين يمكن إدراج نصائح ماصة مدببة شائعة الاستخدام بشكل أعمق في ميناء التعبئة وقد تزيد بشكل كبير من مقاومة تدفق السوائل.
- وضع شريحة chemotaxis(الشكل 2A)في جولة (10 سم قطرها) طبق ثقافة الخلية، وكلاهما محمّى مسبقا إلى 37 درجة مئوية، وتعيين الطبق على كتلة الألومنيوم ساخنة (37 درجة مئوية). إدراج المقابس في المنافذ 1 و 4(الشكل 2B).
2. عزل الماوس المقيم الضامة peritoneal
- التضحية بفأر عمره 3-4 أشهر باستخدام تركيز عال ٍ من الإيزوفوران مخدر متقلب (أكثر من 5٪ في الهواء) أو ثاني أكسيد الكربون25، يليه خلع عنق الرحم. فقدان رد الفعل الحق في القوارض يرتبط مع فقدان الوعي في البشر26. تنظيف بطن الماوس مع الإيثانول 80٪ في الماء ومن ثم جعل شق الجلد خط الوسط 1-2 سم باستخدام مقص الجراحية مع نصائح حادة. قشر مرة أخرى الجلد لفضح جدار البطن الكامنة.
- أدخل قسطرة بلاستيكية 24 غ في التجويف الجبهي. باستخدام حقنة بلاستيكية 5 مل، وإزالة التجويف باستخدام 2 × 4.5 مل الجليد الباردة هانك محلول الملح المخزنة مؤقتا (HBSS)، دون Ca2 + وMg2 +. اترك حوالي 0.5 مل من HBSS المتبقية في الحقنة بحيث يمكن طرد الأنسجة التي تم امتصاصها عن غير قصد على طرف القسطرة.
- نقل المتوسطة اللافج, عادة 8-8.5 مل في المجموع, إلى 14 مل أنبوب القاع جولة البولي بروبلين. طرد مركزي الأنبوب في 300 × ز لمدة 6.5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
ملاحظة: الأنبوب السفلي الجولة يسمح supernatant أن يكون decanted تماما ويقلل من تكتل الخلية. - تجاهل supernatant وإعادة تعليق الخلايا الجبقية (عادة ~ 4 × 106 خلايا لكل فأر) في 200 ميكرولتر من متوسط RPMI 1640 HEPES المعدلة. تمييع عينة من تعليق الخلية 1:20 واستخدام جهاز العد، مثل غرفة العد نيوباور محسنة، لحساب الخلايا. بعد ذلك، تمييع تعليق الخلية إلى تركيز نهائي من 10 × 106 خلايا /مل والحفاظ على الخلايا في أنبوب الطرد المركزي الدقيق البولي بروبلين السفلي 2 مل عند 37 درجة مئوية باستخدام كتلة من الألومنيوم ساخنة (انظر ملاحظة في الخطوة 1.1.1).
3. البذر الخلايا الجبرية في الشرائح Chemotaxis
- بعد الأنابيب تعليق الخلية صعودا وهبوطا 5x مع حجم ماصة تعيين في 100 μL (أو في نصف حجم التعليق) للحد من تكتل، إيداع بلطف 10 μL من تعليق الخلية في الميناء 3 من غرفة chemotaxis(الشكل 2C). ضع طرف ماصة في المنفذ 2 وارسم تعليق الخلية ببطء في قناة الاتصال(الشكل 2C). بمجرد إدخال تعليق الخلية، قم بإزالة المقابس في الميناءين 1 و4، مما سيساعد على إيقاف تدفق تعليق الخلية. ضع قبعات على جميع منافذ التعبئة الأربعة.
- كرر الخطوة 3.1 لجميع غرف chemotaxis. باستخدام مجهر مقلوب صغير وعدسة موضوعية 10x على النقيض من المرحلة ، افحص شرائح chemotaxis بحثًا عن فقاعات الهواء غير المرغوب فيها.
- ضع شرائح chemotaxis المصنفة بالخلايا الجبقية في غرفة الرطوبة عند 37 درجة مئوية لمدة 2-3 ساعة.
4. ملء الخزانات وإضافة Chemoattractant
- فحص منطقة المراقبة (قناة تربط خزاني 40 ميكرولتر) باستخدام مجهر مقلوب.
ملاحظة: في هذه المرحلة ، ستكون كثافة الخلية أعلى من بعد ملء الخزانات ، لأن الخلايا ضعيفة الأتباع ، وغالبًا CD19+ الخلايا (خلايا B1) ، سيتم غسلها من منطقة المراقبة أثناء إجراء التعبئة(الشكل 2C-E). - ضع المقابس في منافذ التعبئة 1 و 2(الشكل 2D). تأكد من أن يتم تعبئة ميناء 3 إلى الأعلى مع فقاعات الهواء المتوسطة والخالية. استخدام إبرة حقنة 27 G المعقمة لطرد فقاعات الهواء غير المرغوب فيها، إذا لزم الأمر.
- باستخدام ماصة ميكانيكية بحجم 10-100 ميكرولتر، نستنشق ~ 60 ميكرولتر من متوسط RPMI 1640 HEPES المعدل ووضع طرف الماصة في ميناء التعبئة 3. استخدام حلقة إعداد حجم ماصة لحقن ببطء وثبات المتوسطة في الخزان بحيث تصل المتوسطة إلى الجزء العلوي من ميناء ملء 4 بعد 1-2 دقيقة(الشكل 2D).
- ملء الخزان الثاني. نقل المكونات من المنفذ 1 وإدراجه ببطء في المنفذ 3(الشكل 2D). بعد ذلك ، استنشق ~ 50 ميكرولتر من متوسط RPMI 1640 HEPES المعدل ة ووضع طرف الماصة في منفذ التعبئة 4. استخدم حلقة إعداد الحجم لطيّة الحجم 10-100 ميكرولتر لحقن متوسطة ببطء وثبات في الخزان الثاني بحيث يصل المتوسط إلى أعلى منفذ التعبئة 1 بعد 1-2 دقيقة(الشكل 2D).
- ضع 495 ميكرولتر من RPMI المعدل 1640 HEPES المتوسطة في (أسفل مستدير) 2 مل أنبوب الطرد المركزي الدقيق وإضافة 5 ميكرولتر من براءات الاختراع الأزرق الخامس (محلول الأسهم: 10 ملغ / مل في محلول المحلول المؤقت الفوسفات [PBS]) ، صبغة زرقاء تستخدم كمؤشر مرئي لتشكيل تدرج التركيز. تخلط عن طريق الدوامة وجيزة. إضافة 5.4 μL من الماوس المؤتلف تكمل C5a (محلول الأسهم: 50 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني مع 0.1٪ الزل في مصل البقري) وتخلط عن طريق دوامة قصيرة.
- إيداع 15 ميكرولتر من اللون الأزرق، واستكمال C5a التي تحتوي على المتوسطة في ميناء ملء 1(الشكل 3A)،بعد التأكد من أن الاكتئاب الضحلة في الجزء العلوي من الميناء هو متوسط الحرة (وإلا فإن الانخفاض قد لا امتداد).
- إدراج تلميح ماصة 10-200 ميكرولتر في ميناء ملء 4 وتدوير ببطء وثبات حلقة إعداد حجم ماصة حجم 10-100 μL لرسم قطرة من الأزرق، واستكمال C5a التي تحتوي على المتوسطة في الخزان المعاكس(الشكل 3B). سيبدأ الهواء في إدخال العمود الرأسي القصير لميناء التعبئة 1. ارسم الهواء حتى تكون واجهة السائل والهواء في منتصف العمود الرأسي، ثم أدخل قابسًا ببطء في المنفذ.
- ارفع الماصة بلطف من المنفذ 4، باستخدام اليد الأخرى لضمان بقاء الشريحة ثابتة في مكانها. وأخيرا، المكونات ببطء منفذ 4(الشكل 3B).
- تفقد الشريحة chemotaxis على المجهر مقلوب.
ملاحظة: وينبغي أن تكون الخلايا المتبقية في منطقة المراقبة في الغالب من الضامة. ويمكن تأكيد ذلك باستخدام الأجسام المضادة المضادة الموسومة بشكل فلوري المضادة F4/80 (F4/80 هو علامة محددة للالضامة الماوس). يمكن التعرف على الخلايا B باستخدام الأجسام المضادة المضادة لCD19 الموسومة بفلورية وF4/80-/ CD19- يمكن اكتشاف الخلايا باستخدام بقعة حمض الحمض النووي الفلوري الأزرق(الشكل 4).
5. التصوير هجرة الضامة عن طريق الفاصل الزمني، مرحلة على النقيض من المجهر
- ضع شريحة chemotaxis على خشبة مسرح المجهر المقلوب المزود بحاضنة خشبة المسرح. الحفاظ على درجة الحرارة عند 37 درجة مئوية.
- صورة منطقة المراقبة 1 مم × 2 مم باستخدام عدسة موضوعية 10x تباين المرحلة والتركيز على lamellipodia الضامة: رقيقة، ورقة مثل نتوءات الغشاء. التقط صورًا لمدة 14 ساعة بمعدل إطار واحد كل دقيقتين.
6. تحليل الصور الفاصلالزمني
- تحليل الوقت الفاصل ، صور التباين المرحلة باستخدام الآلي تحليل الصور البرمجيات أو دليل تتبع البرنامج المساعد ، التي تنتجها فابريس P. Cordelières ، لImageJ.
ملاحظة: يمكن استخدام برامج التتبع التلقائية لتحليل الخلايا التي يتم تصويرها إما عن طريق الفاصل الزمني أو تباين الطور أو المجهر الفلوري. على سبيل المثال، يمكن استخدام برنامج iTrack4U المستند إلى جافا الذي تنتجه Cordelières et al.27 لتتبع الخلايا الآلية وتحليلها باستخدام صور الفاصل الزمني أو تباين الطور أو الفلورسينس كمدخلات. تتبع يدوي هو أكثر مضيعة للوقت، ولكن المسارات التي تم إنشاؤها بواسطة ImageJ البرنامج المساعد دليل تتبع يمكن استيرادها مباشرة وتحليلها تلقائيا من قبل ImageJ المساعد Chemotaxis وأداة الهجرة28،29.
Representative Results
ويرد رسم تخطيطي للشريحة chemotaxis المستخدمة لالمجهر الفيديو الفاصل الزمني من الضامة بالماوس الجيوم ية المهاجرة في تدرج chemotactic في الشكل 2A. تحتوي الشريحة على ثلاث غرف chemotaxis ، كل منها يحتوي على أربعة منافذ تعبئة. يمكن إغلاق المنافذ بشكل فردي باستخدام المقابس المعروضة أعلى الشريحة. بدلاً من ذلك، يمكن وضع غطاء غير الختم فوق منفذ غير موصول للحفاظ على العقم. بعد توصيل المنافذ 1 و4، يمكن تعبئة منطقة المراقبة (1 مم واسعة × 2 مم طويلة × 70 ميكرومتر قناة عالية تربط بين المناسير 2 و 3) بين الميناءين 2 و 3 مع المتوسطة عن طريق وضع انخفاض 15 ميكرولتر في الميناء 3 وaspirating مع 2-20 ميكرولتر حجم ماصة في الميناء 2(الشكل 2B). تم زرع تعليق للخلايا الجهوية المقيمة للفأرة (10 × 106 خلايا /مل) في منطقة المراقبة عن طريق وضع قطرة تعليق 10 ميكرولتر في الميناء 3 وaspirating ببطء في الميناء 2(الشكل 2C). تظهر في الشكل 2Cصورة نموذجية للخلايا المصنفة في منطقة المراقبة التي يتم التقاطها بواسطة المجهر على النقيض من الطور باستخدام عدسة موضوعية 10x . بعد احتضان لمدة 2-3 ساعة ، تم تعبئة شريحة chemotaxis ببطء مع المتوسط(الشكل 2D). بعد توصيل المنافذ 1 و 2، تم حقن المتوسطة ببطء عبر المنفذ 3 حتى خرج من المنفذ 4. بعد ذلك، تم تبديل القابس من المنفذ 1 إلى المنفذ 3، ثم تم ملء الخزان الثاني عن طريق حقن المتوسط ببطء عبر المنفذ 4 حتى ظهر في المنفذ 1. في هذه المرحلة، تم إعادة فحص الخلايا في منطقة المراقبة باستخدام المجهر المقلوب(الشكل 2E). من خلال مقارنة الصور قبل فترةوجيزة (الشكل 2C)وبعد(الشكل 2E)ملء الخزانات ، تم غسل ما يصل إلى ثلثي الخلايا من منطقة المراقبة. عموما، تم غسلها CD19* الخلايا (خلايا B1) ضعيفة الأتباع والخلايا المتبقية كانت في الغالب F4/80+ خلايا (الضامة). وقد تجلى ذلك من خلال المجهر الفلوري بعد وضع علامة على كل نوع من أنواع الخلايا مع الأجسام المضادة المحددة المسماة بشكل فلوري(الشكل 4). في الشكل 4A، تم تسمية الخلايا الجعلاقةية المقيمة في الماوس المعزولة حديثًا بمضادات الفلورسنت الخضراء المضادة لـ F4/80 والخلايا المضادة الفلورية الفلورية الحمراء المضادة لCD19 ، وتم تسمية نواة الخلايا بوصمة حمض نواة فلورية زرقاء. F4/80 هو علامة محددة للالضامة الماوس30، في حين CD19 هو علامة الخلية B. الشكل 4B يظهر F4/80+ الخلايا التي تم تصويرها بواسطة تدوير القرص confocal المجهر في منطقة المراقبة من غرفة chemotaxis. تم تسمية الخلايا بعد فحص chemotaxis بين عشية وضحاها سجلت هاوية زمنية، المجهر على النقيض من المرحلة.
تم إدخال C5a (chemoattractant) إلى أحد الخزانين عن طريق وضع قطرة 15 ميكرولتر من المتوسط تحتوي على 0.54 ميكروغرام/مل (الماوس المؤتلف) تكمل C5a و 10 ميكروغرام/مل براءة اختراع زرقاء V في ميناء التعبئة 1(الشكل 3A)بعد توصيل المنافذ 2 و 3. تم جذب الوسط الكيميائي الجذاب ببطء إلى الخزان عن طريق الطموح البطيء مع ماصة عبر الميناء 4. ويبين الشكل 3باء انتشار الصبغة الزرقاء بعد سحب قطرة 15 ميكرولتر في خزان. تم استخدام براءة الاختراع الزرقاء V كمؤشر مرئي غير مباشر للانتشار الكيميائي. مكملC5a الجزيئات هي أكبر بكثير من تلك التي من براءات الاختراع الأزرق الخامس (9.0 kDa مقابل 0.57 كيلو) وتنتشر ببطء أكبر. وبعد نشر مكمل C5a في الخزان، كان تركيزه ~ 0.2 ميكروغرام/مل (15 ميكرولتر/40 ميكرولتر [حجم الخزان] × 0.54 ميكروغرام/مل = 0.2 ميكروغرام/مل)، أي ما يعادل ~ 22.5 مليون متر. تدرج حاد متواضع تشكلت عبر منطقة المراقبة بعد 3 ساعة واستمر في الزيادة، لتصل إلى الحد الأقصى في حوالي 12 ساعة31. يوضح الشكل 3C مسارات الهجرة للضامة الهاجرة في تدرج C5a مكمل، بين 6-12 ساعة بعد إضافة العلاج الكيميائي. سرعة الخلية وكفاءة التكتيك الكيميائي، مفهرسة باسم y-FMI (مؤشر الهجرة y-forward؛ النطاق: -1 إلى +1) وx-FMI، من الضامة الفردية تم حسابها من مؤامرات الترحيل(الشكل 3D). يوضح الشكل 3D أيضًا مؤامرة ترحيل تم إنتاجها بعد تطبيع نقطة البداية لكل مسار ترحيل إلى X = 0 و Y = 0 أسفل مخططات المربع. توضح المجموعة الواردة في مخطط الترحيل كيفية حساب y-FMI لكل مسار ترحيل.
الشكل 1: سير عمل الضريبة الكيميائية. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2: التعامل مع الشرائح chemotaxis. (A)عرض 3D من الشريحة chemotaxis مع أربعة المقابس وأربع قبعات. تحتوي الشريحة على ثلاث غرف للتكزّل الكيميائي، تتكون كل منها من خزانين 40 ميكرولتر متصلين بقناة 1 مم × 2 مم، والتي يبلغ ارتفاعها 70 ميكرومتر، ويطلق عليها منطقة المراقبة. (ب)تمتد قناة الاتصال في كلا الطرفين إلى ملء المنافذ 2 و 3. بعد إدخال المقابس في ميناءي التعبئة 1 و4، تم تعبئة منطقة المراقبة مسبقًا بمتوسطة (حمراء) من خلال تطبيق قطرة متوسطة إلى المنفذ 3 وإعادة التعبئة في المنفذ 2 مع طرف ماصة 10-200 ميكرولتر. وفي وقت لاحق، طُبقت قبعات على الميناءين 2 و3 قبل احتضان الشريحة عند درجة حرارة 37 درجة مئوية وإعداد تعليق الخلية. (C)تم زرع منطقة المراقبة، حيث تشكل التدرج الكيميائي، مع الضامة من خلال تطبيق قطرة 10 ميكرولتر من الخلايا الجهوية المقيمة الماوس في الميناء 3 وaspirating ببطء في الميناء 2. ثم احتضنت الشريحة في غرفة الرطوبة في 37 درجة مئوية لمدة 2-3 ساعة. تظهر صورة تباين المرحلة المعروضة على اليمين، التي تم الحصول عليها عبر عدسة موضوعية 10x، الخلايا الجبقية بعد البذر والاحتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. (D)تمتلئ غرف Chemotaxis بالمتوسطة عن طريق توصيل المنافذ 1 و 2 ثم حقن المتوسطة ببطء عبر المنفذ 3 حتى ظهرت في الميناء 4. يمكن تحقيق التعبئة البطيئة والثابتة عن طريق تحويل حلقة إعداد مستوى الصوت من ماصة حجم 20-100 ميكرولتر. بعد ملء الخزان الأول، يمكن ملء الخزان الثاني عن طريق توصيل المنافذ 2 و 3 ثم حقن المتوسط ببطء في الميناء 4 حتى يظهر في الميناء 1. (E)صورة تباين المرحلة لنفس منطقة المراقبة الموضحة أعلاه(C)بعد ملء الخزانين. شريط المقياس = 500 ميكرومتر. عناصر الرسم المقدمة من الياس هورن. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: القول بـ"Chemotaxis". (أ)تم إدخال Chemoattractant إلى أحد خزاني غرفة التازي الكيميائي من خلال تطبيق انخفاض 15 ميكرولتر من المتوسط يحتوي على 0.54 ميكروغرام/مل مكمل C5a و 10 ميكروغرام/مل براءة اختراع زرقاء V لملء الميناء 1، يليه الطموح البطيء في الميناء 4. (B)في البداية بعد أن تم جرها إلى الخزان الأزرق، وكان المتوسطة التي تحتوي على chemoattractant شكل قطرة مقلوبتقريبا، ثم انتشرت ببطء في جميع أنحاء الخزان. (C)مسارات الهجرة من الضامة المهاجرة في التدرج الكيميائي (تكملة C5a) بين 6-12 ح بعد إدخال chemoattractant إلى أحد الخزانات. يشار إلى اتجاه التدرج على اليمين. تتم الإشارة إلى نهاية كل مسار ترحيل بواسطة دائرة ممتلئة. (D)قطع الأراضي Blox من السرعة، x-FMI (مؤشر الهجرة x-إلى الأمام) و y-FMI (مؤشر الهجرة y-إلى الأمام)، وهو مؤشر لكفاءة التكتيك الكيميائي الذي يتراوح من -1 إلى +1. وتم الحصول على البيانات عن طريق تحليل 25 مسارا ً لهجرة الضامة. تم اختيار الضامة في النصف السفلي من منطقة المراقبة وإظهار إزاحة عرض خلية واحدة على الأقل على مدى 6 ساعة بشكل عشوائي للتحليل. فيما يلي مؤامرة من مسارات الترحيل بعد تطبيع نقطة البداية إلى X = 0 و Y = 0. تم حساب مؤشر الضريبة الكيميائية (y-FMI) بقسمة صافي الإزاحة على طول المحور Y (د) على الطول المتراكم (ل) مسار الهجرة، كما هو موضح تخطيطياً. عناصر بيانية في الألواح A و B مقدمة من الياس هورن. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: صور الفلورسنت للخلايا الجبقية المقيمة في الماوس الحية التي تم الحصول عليها بواسطة المجهر confocal القرص الغزل. (أ)صورة التركيز الموسعة (ألمع نقطة دمج جميع الطائرات Z) من الخلايا الجبيئة الماوس معزولة حديثا وصفت مع الأخضر الفلورسنت المضادة F4/80 (علامة الضامة) الأجسام المضادة، الأحمر الفلورسنت المضادة CD19 (B علامة الخلية) الأجسام المضادة، وبقعة حمض النووي الفلورسنت الأزرق. شريط مقياس = 10 ميكرون.(B)لقطة (طائرة Z-plane واحدة) من F4/80+ خلايا (الضامة) في منطقة المراقبة لغرفة chemotaxis التي اتخذت بعد قياس chemotaxis بين عشية وضحاها. تم تسمية الخلايا بأجسام مضادة للفلورسنت الأخضر المضاد ة F4/80 وبقعة حمض نوي فلوري ة زرقاء. تم غسل التدرجات C5a و براءات الاختراع الزرقاء V من خلال إجراء وضع العلامات الخلوية ، مما يفسر لماذا الخزان العلوي في الرسم التخطيطي لغرفة chemotaxis ليس أزرق. شريط المقياس = 10 ميكرون. عنصر الرسم المقدمة من الياس هورن. يرجى الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
يعود التصوير اللاحيسي إلى القرن التاسع عشر ويوفر وسيلة لدراسة سلوك الخلايا المناعية الحية في بيئتها الطبيعية. ومع ذلك ، حتى مع المجهر المتقدم ة والتقنيات الوراثية اليوم ، من الصعب دراسة استجابة الخلايا لمعالجات كيميائية محددة في الجسم الحي. للتحايل على هذه المشكلة، طوّر بويدن18 مقالات ترانسويل في الستينات، لكن هذه المقالات النهائية لم تقدم تصوراً لكيفية هجرة الخلايا فعلاً نحو المنجذبات الكيميائية، مما يجعل من الصعب التمييز بين العلاج الكيميائي، وحفز الهجرة العشوائية بإشارة كيميائية32،وchemotaxis، والهجرة نحو تركيزات أعلى من المحفزات الكيميائية من بعضها البعض33. تم حل هذه المشكلة عن طريق تصميم غرف مفتوحة مختلفة مع جسر، وعادة 1 مم واسعة، وتقع بين خزانين ويمكن الوصول إليها من خلال عدسة موضوعية21،22،23. تطبيق زلة غطاء مقلوب، مبذرة بخلايا ملتصقة، تغلق الغرف وجاذب كيميائي تضاف إلى أحد الخزانات المنتشرة عبر الجسر إلى الخزان المقابل، مما يخلق تدرج تركيز. هنا نصف الضريبة chemotaxis باستخدام نفس المبدأ ولكن باستخدام غرفة مغلقة تضم أربعة ملء الموانئ. باستخدام هذا النظام والوقت الفاصل، مرحلة التباين المجهري، وضعنا فحص لصورة الماوس القماق الجيومالمقيم المهاجرة في التدرج C5a الكيميائية31،34،35,. هذا القول، جنبا إلى جنب مع نماذج الماوس بالضربة القاضية، أثبتت مفيدة في التحقيق في أدوار مختلف رو GTPases والبروتينات الحركية في مورفولوجيا الضامة، والحركة، وchemotaxis31،34،35،36،37.37 لقد استخدمنا أيضا هذا النهج لتصوير الإنسان أحاديالدم المحيطي المهاجرة على سطح 2D أو في نوع الكولاجين 3D أنا مصفوفة38. وعلاوة على ذلك، والقول هو مناسبة للفواج العظام نخاع العظام المستمدة من الضامة أو الضامة المستمدة من الخلايا السلائف النخاعي الخلدةمشروط39،40. لقد استخدمنا سابقا أكياس البولي تترافلوروإيثيلين (PTFE) مع محولات لور لثقافة خلايا نخاع العظام والحصول على الضامة34. ميزة أكياس PTFE هو أن الخلايا يمكن إعادة تعليقها بسهولة وجاهزة للاستخدام بعد وضع الحقيبة على الجليد لمدة 20-30 دقيقة. لاحظ أننا ملء مسبقا في منطقة مراقبة الشرائح chemotaxis قبل إدخال الخلايا. هذا النهج لديه ميزة أن فقاعات الهواء غير المرغوب فيها يمكن مسح هاون (مع نجاح متغير) ومنطقة المراقبة presoaked تمكن من إدخال بطيء من تعليق الخلية عن طريق الأنابيب. ومع ذلك، فإن التعبئة المسبقة تزيد من احتمال تدفق الوسط جزئيًا إلى أحد الخزانات المحيطة أو كليهما، مما سيعزز بذر الخلايا خارج منطقة المراقبة. بدلا من ذلك، يمكن أن يكون تعليق الخلية الأنابيب مباشرة في منطقة مراقبة جافة، ولكن لا يمكن طرد فقاعات الهواء غير المرغوب فيها في وقت لاحق.
يحتوي التجويف الجبريلل للفأرة على مجموعتين رئيسيتين من الخلايا: F4/80+ الضامة و(أصغر) خلايا CD19+ B ، بنسبة حوالي 1:2(الشكل 4A). هذه الخلايا اثنين من السكان تمثل أكثر من 95٪ من خلايا تجويف الجهوية، في حين أن F4/80المتبقية -/ CD19- يمكن عادة تحديد الخلايا على أنها CD11c+ خلايا (خلايا التدنو) أو CD3+ الخلايا (الخلايا التائية). يتم غسل الخلايا B ضعيفة الأتباع من منطقة المراقبة أثناء ملء الخزانات بالوسط(الشكل 2). بعد إضافة العلاج الكيميائي إلى أحد الخزانين ، يمكن استخدام المجهر المؤقت ، والتباين في الطور لتصوير الخلايا المتبقية (الضامة) المهاجرة في تدرج كيميائي متحرك متطور. يمكن محاكاة تشكيل تدرج C5a المكمل في منطقة المراقبة ، عن طريق الانتشار من خزان إلى آخر ، باستخدام صبغة فلورية ذات وزن جزيئي مماثل. بديل جيد ليكمل الماوس المؤتلف C5a (الوزن الجزيئي المتوقع ، 9.0 kDa) هو المسمى الفلورسنت dextran (10 كيلو)31. باستخدام المجهر المحوري، يمكن قياس تدرج الفلورسينس في القناة الضيقة (منطقة المراقبة) التي تربط خزانين من شريحة chemotaxis على فترات ثابتة ويمكن رسم ملامح التركيز في النقاط الزمنية المختلفة24،31. نضيف بشكل روتيني صبغة زرقاء غير فلورية (براءة اختراع زرقاء V) إلى الوسط الكيميائي الجذاب لتوفير مؤشر مرئي مناسب للانتشار وتشكيل التدرج. في غضون 1 ح من إدخال 15 ميكرولتر من اللون الأزرق، الذي يحتوي على وسيط كيميائي في خزان، يبدو الخزان أزرق بشكل موحد، ووفقا لقوانين الانتشار فيفيك، سوف يتشكل تدرج عبر منطقة المراقبة الضيقة التي تربط الخزانات(الشكل 3B). مطلوب عدة أيام للمذاب (صبغة زرقاء أو chemoattractant) لتصبح موزعة بشكل موحد.
يمكن استبدال المجهر الفلوري بالمجهر على النقيض من الطور ، والذي يوفر مزايا لتتبع الخلايا الآلي ، لأنه يمكن تمييز الخلايا المسماة بشكل فلوري بسهولة عن الخلفية. ميزة أخرى هي أن مجموعات محددة من الخلايا المناعية يمكن تتبعها بشكل انتقائي بعد وضع علامات سطحية مع الأجسام المضادة الفلورية. استخدمنا هذا النهج لتصوير الدم المحيطي البشري CD14+ الخلايا (monocytes) المهاجرة في fMLP تكتيكي (N-formylmethionine-leucyl-phenylalanine) التدرج38. وبالمثل، يمكن استخدام الأجسام المضادة الفلورية المضادة F4/80 لتصوير الضامة الماوس المهاجرة في التدرج C5a المكمل للتكتيك الكيميائي. السمية الضوئية هو عيب محتمل من استخدام التصوير الفلوري41. ويمكن تخفيض هذا بوسائل مختلفة42، بما في ذلك استخدام الفلوروفوريس متحمس مع أطوال موجية أطول وإضافة مضادات الأكسدة إلى الوسط. وبدلاً من ذلك، يمكن في البداية تحديد الخلايا المسماة عن طريق المجهر الفلوري ثم تصويرها عن طريق المجهر الفاصل الزمني والتباين على الطور. ومع ذلك ، في الممارسة العملية ، يمكن تصوير الخلايا التي تتحرك بسرعات منخفضة بشكل معتدل ، مثل ~ 1 ميكرومتر / دقيقة (الضامة) أو ~ 4 ميكرومتر / دقيقة (أحادية الخلايا) ، بشكل متقطع عن طريق المجهر الفلوري على فترات من الدقائق ، وهو جيد التحمل38. استخدمنا سابقا المجهر الفلوري والشريحة chemotaxis وصفها هنا ل3D chemotaxis المقالات38،43. في هذه الحالة، تم تعبئة كلا الخزانين مسبقًا بمتوسطة و15 ميكرولتر ًا تم سحب هاوية المنجذبة بالكيماويات إلى أحد الخزانات مباشرة قبل أن تُبوّل ببطء الخلايا المسماة بالفلورسنت المعلقة في وسط يحتوي على نوع الكولاجين الأول في منطقة المراقبة. الجزء الصعب من هذا الإجراء هو التعامل مع الكولاجين من النوع الأول ، والذي يتركز في محلول حمضي. يجب تحييد درجة الحموضة في محلول الكولاجين عن طريق إضافة محلول قلوي قبل خلط محلول الكولاجين البارد مع تعليق الخلية. نقل خليط الكولاجين الخلية إلى حاضنة في 37 درجة مئوية سوف تبدأ البلمرة الكولاجين. أثناء الحضانة ، يجب تدوير الشريحة ببطء حول محورها الطويل بحيث تظل الخلايا موزعة بالتساوي في اتجاهات المحور X و Y و Z بينما يبلمرة الكولاجين في هلام. وقد وصفت مؤخرا شريحة chemotaxis مغلقة ذات الصلة مناسبة لassass chemotaxis 3D، مع ستة المقابس بدلا من أربعة المقابس،29. يسمح هذا النظام بإدخال خليط الكولاجين والخلية إلى منطقة المراقبة قبل ملء كل خزان من الخزانات المحيطة بشكل مستقل ، لأن كل خزان يحتوي على مينتي تعبئة ، بدلاً من ميناء واحد.
باختصار، نحن نصف في الوقت الحقيقي العلاج الكيميائي التازي الذي يسمح تصور الخلايا التنقل في التدرج الكيميائي على مدى فترة 6 ساعات أو أكثر. هنا نركز على الضامة، والتي تلعب أدوارا رئيسية في الأمراض الالتهابية ولكن تم تمثيلها في الوقت الحقيقي العلاج الكيميائي assays بالمقارنة مع أسرع الخلايا المتحركة مثل العدلات وDictyostelium أميباي.
Disclosures
وليس لدى أصحاب البلاغ ما يكشفون عنه.
Acknowledgments
وقد دعم هذا العمل بمنحة (HA 3271/3-2) من DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| µ-Slide (anodized aluminium) rack | Ibidi, Martinsried, Germany | 80003 | Autoclavable stackable rack for channel slides |
| µ-Slide Chemotaxis 2D (chemotaxis slide) | Ibidi, Martinsried, Germany | 80306 | Slide containing chemotaxis chambers (tissue culture treated) |
| 100x penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
| 10-100 µL pipette with volume control ring | Eppendorf | 3123000047 | Eppendorf Research plus pipette |
| 10-200 µL pipette tips | Greiner Bio-One International | 739261 | Pipette tips with beveled tips (96 pieces per rack: sterile) |
| 14 mL polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352059 | Used to collect peritoneal cells |
| 14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera | Hamamatsu Photonics Inc., Japan | EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system | |
| 2-20 µL pipette with volume control ring | Eppendorf | 3123000039 | Eppendorf Research plus pipette |
| 24 G plastic catheter | B Braun Mesungen AG, Germany | 4254503-01 | Used for peritoneal lavage |
| 405 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (405 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
| 488 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
| 561 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
| Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody | Thermo Fisher Scientific | MF48020 | Mouse macrophage marker and plasma membrane label |
| Alexa Fluor 594-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone 6D5) anti-mouse CD19 antibody | BioLegend | 115552 | Mouse B cell marker |
| C-Chip disposable (improved Neubauer) hemocytometer | NanoEnTek (distributed by VWR International) | 631-1098 | Used to count cells |
| CSU-X1 spinning disk scanner | Yokogawa Electric Corporation, Japan | Nipkow spinning disk unit | |
| Hank’s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14170120 | Used for peritoneal lavage |
| Heat-inactivated fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
| Hoechst 34580 | Thermo Fisher Scientific | H21486 | Cell permeable, blue fluorescent nucleic acid stain |
| ImageJ (image processing and analysis in Java) | National Institutes of Health (NIH) | Image analysis software | |
| Lipopolysaccharides from Escherichia coliO111:B4 | Sigma-Aldrich | L4391-1MG | Toll-like receptor 4 ligand |
| Nikon Eclipse Ti inverse microscope | Nikon, Japan | Inverted microscope | |
| Patent Blue V, sodium salt | Sigma-Aldrich | 21605-10G | Blue-colored dye used as visual indicator of gradient formation |
| Recombinant mouse complement C5a protein | R&D Systems | 2150-C5-025 | Chemoattractant for mouse macrophages |
| RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R7388 | Basis medium for assays |
| UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system + Volocity software | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Spinning disk confocal microscope system | |
| Zeiss LSM 510 + Axiovision software | Carl Zeiss Microscopy, Oberkochen, Germany | Confocal laser scanning microscope (LSM) adapted for phase-contrast microscopy |
References
- Lammermann, T., Germain, R. N. The multiple faces of leukocyte interstitial migration. Seminars in Immunopathology. 36, 227-251 (2014).
- Lammermann, T., Sixt, M. Mechanical modes of 'amoeboid' cell migration. Current Opinion in Cell Biology. 21, 636-644 (2009).
- Woodham, E. F., Machesky, L. M. Polarised cell migration: intrinsic and extrinsic drivers. Current Opinion in Cell Biology. 30, 25-32 (2014).
- Devreotes, P. N., et al. Excitable Signal Transduction Networks in Directed Cell Migration. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 33, 103-125 (2017).
- Kamp, M. E., Liu, Y., Kortholt, A. Function and Regulation of Heterotrimeric G Proteins during Chemotaxis. International Journal of Molecular Sciences. 17 (1), 90 (2016).
- Miao, Y., et al. Wave patterns organize cellular protrusions and control cortical dynamics. Molecular Systems Biology. 15, 8585 (2019).
- Ridley, A. J., et al. Cell migration: integrating signals from front to back. Science. 302, 1704-1709 (2003).
- Lammermann, T., et al. Rapid leukocyte migration by integrin-independent flowing and squeezing. Nature. 453, 51-55 (2008).
- Mullins, R. D., Heuser, J. A., Pollard, T. D. The interaction of Arp2/3 complex with actin: nucleation, high affinity pointed end capping, and formation of branching networks of filaments. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 6181-6186 (1998).
- Leithner, A., et al. Diversified actin protrusions promote environmental exploration but are dispensable for locomotion of leukocytes. Nature Cell Biology. 18, 1253-1259 (2016).
- McDonald, B., et al. Intravascular danger signals guide neutrophils to sites of sterile inflammation. Science. 330, 362-366 (2010).
- Leber, T. Ueber die Entstehung der Entzündung und die Wirkung der entzündungserregenden Schädlichkeiten. Fortschritte der Medizin. 6, 460-464 (1888).
- Tauber, A. I.
- Clark, E. R., Linton Clark, E. Reactions of cells in the tail of amphibian larvae to injected croton oil (aseptic inflammation). American Journal of Anatomy. 27, 221-254 (1920).
- Clark, E. R., Linton Clark, E. The reaction of living cells in the tadpole's tail toward starch, agar-agar, gelatin, and gum arabic. The Anatomical Record. 24, (1922).
- Comandon, J. Phagocytose in vitro des Hématozoaires du Calfat (enregistrement cinématographique). Comptes Rendus Hebdomadaires des Séances et Mémoires de la Société de Biologie. 69, 314-316 (1917).
- McCutcheon, M.
- Boyden, S. The chemotactic effect of mixtures of antibody and antigen on polymorphonuclear leucocytes. The Journal of Experimental Medicine. 115, 453-466 (1962).
- Horwitz, D. A., Garrett, M. A. Use of leukocyte chemotaxis in vitro to assay mediators generated by immune reactions. I. Quantitation of mononuclear and polymorphonuclear leukocyte chemotaxis with polycarbonate (nuclepore) filters. Journal of Immunology. 106, 649-655 (1971).
- Bignold, L. P. A novel polycarbonate (Nuclepore) membrane demonstrates chemotaxis, unaffected by chemokinesis, of polymorphonuclear leukocytes in the Boyden chamber. Journal of Immunological Methods. 105, 275-280 (1987).
- Zigmond, S. H. Ability of polymorphonuclear leukocytes to orient in gradients of chemotactic factors. The Journal of Cell Biology. 75, 606-616 (1977).
- Zicha, D., Dunn, G. A., Brown, A. F. A new direct-viewing chemotaxis chamber. Journal of Cell Science. 99, Pt 4 769-775 (1991).
- Muinonen-Martin, A. J., Veltman, D. M., Kalna, G., Insall, R. H. An improved chamber for direct visualisation of chemotaxis. PLoS One. 5, 15309 (2010).
- Zengel, P., et al. mu-Slide Chemotaxis: a new chamber for long-term chemotaxis studies. BMC Cell Biology. 12, 21 (2011).
- Valentim, A. M., Guedes, S. R., Pereira, A. M., Antunes, L. M. Euthanasia using gaseous agents in laboratory rodents. Lab Animal. 50, 241-253 (2016).
- Franks, N. P. General anaesthesia: from molecular targets to neuronal pathways of sleep and arousal. Nature Reviews. Neuroscience. 9, 370-386 (2008).
- Cordelieres, F. P., et al. Automated cell tracking and analysis in phase-contrast videos (iTrack4U): development of Java software based on combined mean-shift processes. PLoS One. 8, 81266 (2013).
- Zantl, R., Horn, E. Chemotaxis of slow migrating mammalian cells analysed by video microscopy. Methods in Molecular Biology. 769, 191-203 (2011).
- Biswenger, V., et al. Characterization of EGF-guided MDA-MB-231 cell chemotaxis in vitro using a physiological and highly sensitive assay system. PLoS One. 13, 0203040 (2018).
- Austyn, J. M., Gordon, S. F4/80, a monoclonal antibody directed specifically against the mouse macrophage. European Journal of Immunology. 11, 805-815 (1981).
- Hanley, P. J., et al. Motorized RhoGAP myosin IXb (Myo9b) controls cell shape and motility. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107, 12145-12150 (2010).
- Wilkinson, P. C. Cell Locomotion and Chemotaxis: Basic Concepts and Methodological Approaches. Methods. 10, 74-81 (1996).
- Pfeffer, W. Locomotorische Richtungsbewegungen durch chemische Reize. Untersuchungen aus dem Botanischen Institut zu Tübingen. 1, 363 (1884).
- Konigs, V., et al. Mouse macrophages completely lacking Rho subfamily GTPases (RhoA, RhoB, and RhoC) have severe lamellipodial retraction defects, but robust chemotactic navigation and altered motility. The Journal of Biological Chemistry. 289, 30772-30784 (2014).
- Horsthemke, M., et al. Multiple roles of filopodial dynamics in particle capture and phagocytosis and phenotypes of Cdc42 and Myo10 deletion. The Journal of Biological Chemistry. 292, 7258-7273 (2017).
- Bachg, A. C., et al. Phenotypic analysis of Myo10 knockout (Myo10(tm2/tm2)) mice lacking full-length (motorized) but not brain-specific headless myosin X. Scientific Reports. 9, 597 (2019).
- Horsthemke, M., et al. A novel isoform of myosin 18A (Myo18Agamma) is an essential sarcomeric protein in mouse heart. The Journal of Biological Chemistry. 294, 7202-7218 (2019).
- Bzymek, R., et al. Real-time two- and three-dimensional imaging of monocyte motility and navigation on planar surfaces and in collagen matrices: roles of Rho. Scientific Reports. 6, 25016 (2016).
- Wang, G. G., et al. Quantitative production of macrophages or neutrophils ex vivo using conditional Hoxb8. Nature Methods. 3, 287-293 (2006).
- Gran, S., et al. Imaging, myeloid precursor immortalization, and genome editing for defining mechanisms of leukocyte recruitment in vivo. Theranostics. 8, 2407-2423 (2018).
- Magidson, V., Khodjakov, A.
- Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. BioEssays : News and Reviews in Molecular, Cellular and Developmental Biology. 39 (8), 1700003 (2017).
- Isfort, K., et al. Real-time imaging reveals that P2Y2 and P2Y12 receptor agonists are not chemoattractants and macrophage chemotaxis to complement C5a is phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)- and p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK)-independent. The Journal of Biological Chemistry. 286, 44776-44787 (2011).
