Her beskriver vi metoder ved hjælp af time-lapse, fase-kontrast mikroskopi til billedmus hjemmehørende peritoneal makrofager i en kemotaktisk supplement C5a gradient. Protokollerne kan udvides til andre immunceller.
Kemotaxis er receptor-medieret vejledning af celler langs en kemisk gradient, mens chemokineis er stimulering af tilfældig cellemotilitet af et kemikalie. Chemokinesis og kemotaxis er afgørende for mobilisering og indsættelse af immunceller. For eksempel, chemokines (kemotaktiske cytokiner) kan hurtigt rekruttere cirkulerende neutrofiler og monocytter til ekstravaskulære steder af inflammation. Kemoattractant receptorer tilhører den store familie af G protein-koblede receptorer. Hvordan kemoattractant (dvs. ligand) gradienter direkte celle migration via G protein-koblet receptor signalering er endnu ikke fuldt forstået. Inden for immunologi, neutrofiler er populære modelceller til at studere kemotaxis in vitro. Her beskriver vi en real-time to-dimensionelle (2D) chemotaxis assay skræddersyet til mus hjemmehørende makrofager, som traditionelt har været vanskeligere at studere. Makrofager bevæger sig i et langsomt tempo på ~ 1 μm/min på en 2D-overflade og er mindre velegnede til punktkildemigrationsanalyser (f.eks. migration mod spidsen af en mikropipette fyldt med kemoattractant) end neutrofiler eller Dictyostelium discoideum, som bevæger sig hurtigere. Udbredte Transwell-analyser er nyttige til at studere de forskellige stoffers kemotaktiske aktivitet, men giver ikke oplysninger om cellemorfologi, hastighed eller kemotaktisk navigation. Her beskriver vi en time-lapse mikroskopi-baseret makrofag chemotaxis assay, der giver mulighed for kvantificering af cellehastighed og kemotaktisk effektivitet og giver en platform til at afgrænse transducers, signal veje, og effektorer af kemotaxis.
Immunceller vandrer typisk singly på en 2D-overflade i en amøbe mode1,2,som indebærer gentagne cyklusser af fremspring af fronten, integrin-medieret celle vedhæftning, og tilbagetrækning af den bageste. Et forudsætningstrin er cellepolarisering, hvor celler danner for- og bagende3. Kemotaxis starter med påvisning af kemoattractanter ved G-protein-koblede receptorer og et komplekst signalnetværk medieret af membranforankrede heterotrimære G-proteiner og små monomeriske G-proteiner samt fosfolipid-bundet guanine nukleotid udvekslingsfaktorer (GEF’er)4,5. Aktivering af Rho GTPases af Cdc42 og Rac underfamilier fremkalde fremspring på forsiden6 og medlemmer af Rho underfamilie, især RhoA, aktivere sammentrækning af den bageste5,7. I et tredimensionelt (3D) miljø er integriner i vid udstrækning overflødige for leukocytmigration, og RhoA bliver vigtigere for at presse celler gennem smalle passager8, mens Cdc42- eller Rac-induceret Arp2/3 aktivering fortsat er vigtig for kemotaktiskstyring9,10.
Immunceller kan stå over for forskellige kemoattractants, især i indstillingerne for vævsskade, patogen invasion, og betændelse. De endogene chemoattractants udtrykt på fagocytter supplerer C3a og C5a, er hurtigt genereret ved aktivering af komplemenlikat, og er anerkendt ved supplement C3a og C5a receptorer. Tilsvarende nekrotiske celler rekruttere fagocytter via formyl peptid receptorer, som anerkender mitokondrier-afledt samt bakterier-afledte formyl peptider11. Immunceller udtrykker også G protein-koblede receptorer for chemokiner, en stor familie af kemoattractant peptider involveret i reguleringen af immuncellehandel under både homøostase og inflammation. Chemokiner klassificeres i fire grupper afhængigt af afstanden mellem de to første cystein (C) restkoncentrationer: C, CC, CXC og CX3C cytokiner, hvor X er en aminosyre. Således in vivo immunceller nødt til at reagere hensigtsmæssigt på meget komplekse rumlige og tidsmæssige signaler, hvilket gør studiet af kemotaxis en skræmmende opgave. Nedenfor giver vi en kort historie om kemotaxis, som begyndte med intravital billeddannelse tilgange.
Undersøgelsen af leukocyt chemotaxis daterer sig tilbage til 188812, når øjenlæge Theodor Karl Gustav Leber klart beskrevet den direkte migration af leukocytter til, og ophobning på, steder af betændelse i en model af mykotisk (svampe) keratitis. Leber understregede, at tiltrækningaf overskydende leukocytter ved hjælp af patogen-afledte stoffer er vigtig for eliminering af skadelige mikroorganismer via fagocytose, som var blevet beskrevet af Metchnikoff (også kendt som Metschnikoff) tidligere i samme årti13. In vivo eksperimenter blev også udført i 1920’erne af Clark og Clark14,15, der benyttede sig af gennemsigtigheden af haletudser og viste, at steril inflammation induceret af croton olie14 eller andre lokalirriterende15 forårsaget leukocytter til at overholde blodkarrene, efterfulgt af diapedese (transendotel migration) og hurtig migration gennem vævet rum mod lokalirriterende. In vitro-eksperimenter ved hjælp af mikrofilmmetoden udviklet af Jean Comandon16 viste, at leukocytter migrerede til en partikelkemoattractantkilde såsom bakterier17. På det tidspunkt var de molekylære identiteter af kemotaktiske faktorer ukendt. I 1960’erne erkendte Stephen Boyden18, at der manglede teknikker til at studere opløselige stoffers kemotaktiske aktivitet. Han udtænkte et kammer, senere kendt som Boyden kammer, med to rum adskilt af et filter papir membran. Der tilsættes en cellesuspension i det øverste rum, og teststoffet tilsættes enten begge rum eller kun til det nederste rum. Efter en inkubationsperiode fjernes filtermembranen, og cellerne fastgøres og farves. Ved at sammenligne, hvor mange celler der vandrer hen over filtermembranen mod den nederste brønd med teststoffet i begge rum, i ingen af rummene eller kun i det nederste rum, kan kemotaktiskaktivitet bestemmes. Transwell assays er stadig populære i dag og er blevet ændret på forskellige måder, herunder brugen af forskellige polycarbonat membraner med definerede pore størrelser og tætheder19,20. En stor ulempe ved Transwell assays er, at det er upraktisk at direkte visualisere celler migrerer og migration sti på tværs af membranen typisk ikke overstiger diameteren af en immuncelle.
Sally H. Zigmond udviklede et kemotaxiskammer21, der muliggjorde visualisering af både gradientdannelse og cellemorfologi ved hjælp af fluorescerende farvestoffer. Kammeret består af et plexiglas (akryl) dias med to parallelle lineære brønde, hver med et volumen på ~ 100 μL, adskilt af en 1 mm bred bro 3-10 μm under det øverste plan af diaset. En coverslip seedet med celler er omvendt og placeret på diaset, således at det spænder over de to brønde. Efter tilsætning af en kemoattractant til en af brøndene, en stejl kemoattractant gradient former over broen, typisk inden for 30-90 min. Human polymorfonukleare leukocytter (granulocytter) i Zigmond kammer observeres orientere sig mod kemoattractant. Variationer af Zigmond kammeret er blevet rapporteret, herunder Dunn22 og Insall23 kamre, som begge bruger en coverslip seedet med celler placeret på tværs af to brønde adskilt af en 1 mm bred bro. Dunnkammeret består af koncentriske brønde adskilt af en cirkulær bro, mens Insall kammeret er tættere forbundet med Zigmond kammer, men giver broer af to forskellige bredder, 0,5 mm og 1 mm. En roman kemotaxis kammer, kaldes μ-Slide Chemotaxis og fremstillet af plast sprøjtestøbning, blev beskrevet af Zemgel et al.24. Kemotaxiskammeret består af to 40 μL reservoirer adskilt af en 1 mm bred kanal med en længde på 2 mm og en højde på 70 μm. Bunden af kammeret er dannet af en gas gennemtrængelig, tynd plastfolie med samme tykkelse og optiske egenskaber af en Nr. 1,5 glas dækslip24. Her beskriver vi en chemotaxis analyse ved hjælp af μ-Slide Chemotaxis kammer til at visualisere migration af mus hjemmehørende peritoneal makrofager i op til 14 timer i en kemotaktisk (supplement C5a) gradient.
Intravital billeddannelse går tilbage til 1800-tallet og giver et middel til at studere adfærdlevende immunceller i deres naturlige miljø. Men selv med nutidens avancerede mikroskopi og genetiske teknikker er det vanskeligt at studere cellernes respons på specifikke kemoattractanter in vivo. For at omgå dette problem udviklede Boyden18 Transwell-analyser i 1960’erne, men disse slutpunktsanalyser gav ikke visualisering af, hvordan celler faktisk migrerede til kemoattractanter, hvilket gjorde det vanskeligt at skelne chemokinesis, stimuleret tilfældig migration med et kemisk cue32, og chemotaxis, migration mod højere koncentrationer af kemiske stimuli fra hinanden33. Dette problem blev løst ved at designe forskellige åbne kamre med en bro, typisk 1 mm bred, beliggende mellem to reservoirer og tilgængelig e en objektiv linse21,22,23. Anvendelse af en omvendt dække slip, seedet med hængende celler, lukker kamre og kemoattractant føjet til en af reservoirerne spreder over broen til den modsatte reservoir, hvilket skaber en koncentration gradient. Her beskriver vi en kemotaxis analyse ved hjælp af samme princip, men ved hjælp af et lukket kammer byder på fire påfyldning havne. Ved hjælp af dette system og time-lapse, fase-kontrast mikroskopi, vi udviklet en analyse til billedmus hjemmehørende peritoneal makrofager migrerer i en kemotaktisk supplement C5a gradient31,34,35,36. Denne analyse, kombineret med knockout mus modeller, viste sig at være medvirkende til undersøgelsen af rollerne af forskellige Rho GTPases og motoriske proteiner i makrofag morfologi, motilitet, og kemotaxis31,34,35,36,37. Vi har også brugt denne tilgang til billede menneskelige perifere blod monocytter migrerer på en 2D overflade eller i en 3D kollagen type I matrix38. Desuden er analysen velegnet til museknoglemarvsafledte makrofager eller makrofager afledt af betinget udødeliggjorte myeloid prækursorceller39,40. Vi har tidligere brugt polytetrafluorethylen (PTFE) poser med luer adaptere til kultur knoglemarvsceller og få makrofager34. Fordelen ved PTFE poser er, at cellerne let kan resuspenderes og klar til brug efter at have lagt posen på is i 20-30 min. Bemærk, at vi prefill chemotaxis slide observation område, før du indfører cellerne. Denne fremgangsmåde har den fordel, at uønskede luftbobler efterfølgende kan skylles ud (med variabel succes) og det forudbesøgte observationsområde muliggør langsom indførelse af en cellesuspension ved pipettering. Præfyldning øger dog sandsynligheden for, at mediet delvist vil strømme ind i en eller begge flankerende reservoirer, hvilket vil fremme såning af celler uden for observationsområdet. Alternativt kan cellesuspensionen føres direkte ind i et tørt observationsområde, men uønskede luftbobler kan ikke efterfølgende udvises.
Musens bughulen indeholder to hovedpopulationer af celler: F4/80+ makrofager og (mindre) CD19+ B-celler i et forhold på ca. 1:2 (Figur 4A). Disse to cellepopulationer tegner sig for over 95% af bughulen celler, mens de resterende F4/80–/ CD19– celler kan normalt identificeres som CD11c+ celler (dendritiske celler) eller CD3+ celler (T-celler). Svagt klæbende B-celler vaskes ud af observationsområdet under påfyldning af reservoirerne med mediet (figur 2). Efter at have tilføjet kemoattractant til en af de to reservoirer, kan time-lapse, fase-kontrast mikroskopi bruges til at forestille de resterende celler (makrofager) migrerer i en udviklende kemoattractant gradient. Dannelsen af den supplerende C5a gradient i observationsområdet, via diffusion fra det ene reservoir til det andet, kan simuleres ved hjælp af et fluorescerende farvestof med lignende molekylvægt. En god erstatning for rekombinant mus supplement C5a (forudsagt molekylvægt, 9,0 kDa) er fluorescerende mærket dextran (10 kDa)31. Ved hjælp af konfokal mikroskopi kan den fluorescensgradient i den smalle kanal (observationsområdet), der forbinder chemotaksdiasets toreservoirer,måles med faste intervaller , og koncentrationsprofiler på de forskellige tidspunkter kan afbildes24,31. Vi tilføjer rutinemæssigt et nonfluorescerende, blåt farvestof (Patent Blue V) til det kemoattractantmedium for at give en praktisk visuel indikator for diffusion og gradientdannelse. Inden for 1 time efter at have indført 15 μL blåt, chemoattractantholdigt medium i et reservoir, fremstår reservoiret ensartet blåt, og ifølge Ficks diffusionslove vil der dannes en gradient i det snævre observationsområde, der forbinder reservoirerne (figur 3B). Flere dage er nødvendige for den opløste (blå farvestof eller kemoattractant) at blive jævnt fordelt.
Fluorescensmikroskopi kan erstattes af fasekontrastmikroskopi, hvilket giver fordele til automatiseret cellesporing, fordi fluorescerende mærkede celler let kan skelnes fra baggrunden. En anden fordel er, at specifikke populationer af immunceller selektivt kan spores efter mærkning overflade markører med fluorescerende antistoffer. Vi brugte denne tilgang til billede menneskelige perifere blod CD14+ celler (monocytter) migrerer i en chemotactic fMLP (N-formylmethionin-leucyl-phenylalanin) gradient38. Tilsvarende, fluorescerende anti-F4/80 antistoffer kan bruges til at billedet mus makrofager migrerer i en kemotaktisk supplement C5a gradient. Fototoksicitet er en potentiel ulempe ved at bruge fluorescens imaging41. Dette kan reduceres på forskellige måder42, herunder ved hjælp af fluorophores ophidset med længere bølgelængder og tilføje antioxidanter til mediet. Alternativt kan mærkede celler i første omgang identificeres ved fluorescensmikroskopi og efterfølgende afbildes ved time-lapse-mikrokopi af fasekontrast. I praksis kan celler, der bevæger sig med moderat lave hastigheder, såsom ~1 μm/min (makrofager) eller ~4 μm/min (monocytter), dog periodisk afbildes ved fluorescensmikroskopi med intervaller på minutter, hvilket tåles godt38. Vi har tidligere brugt fluorescens mikroskopi og kemotaxis dias beskrevet her for 3D chemotaxis assays38,43. I dette tilfælde blev begge reservoirer fyldt med medium og 15 μL chemoattractant-holdige medium blev trukket ind i en af reservoirerne umiddelbart før langsomt pipettering fluorescerende mærkede celler suspenderet i medium indeholdende kollagen type I i observationsområdet. Den vanskelige del af denne procedure er håndteringaf kollagen type I, som er koncentreret i sur opløsning. Kollagenopløsningens pH-analyse skal neutraliseres ved tilsætning af alkalisk opløsning, før den iskolde kollagenopløsning blandes med cellesuspensionen. Overførsel af kollagen-celle blandingen til en inkubator ved 37 °C vil indlede kollagen polymerisering. Under inkubationen skal slæden langsomt roteres omkring sin lange akse, så cellerne forbliver jævnt fordelt i X-, Y- og Z-aksens retninger, mens kollagenpolymeriserer til en gel. En beslægtet lukket chemotaxis dias egnet til 3D chemotaxis assays, med seks stik i stedet for fire stik, er for nylig blevet beskrevet29. Dette system gør det muligt at indføre kollagencelleblandingen i observationsområdet, før hver af de flankerende reservoirer fyldes uafhængigt, fordi hvert reservoir har to påfyldningsporte i stedet for en enkelt port.
Sammenfattende beskriver vi en realtidskemotaxis-analyse, der gør det muligt at visualiseringaf celler, der navigerer i en kemotaktisk gradient over en periode på 6 eller flere timer. Heri fokuserer vi på makrofager, som spiller en stor rolle i inflammatoriske sygdomme, men har været underrepræsenteret i realtid chemotaxis assays sammenlignet med hurtigere bevægelige celler som neutrofiler og Dictyostelium amøbe.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af et tilskud (HA 3271/3-2) fra DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft).
µ-Slide (anodized aluminium) rack | Ibidi, Martinsried, Germany | 80003 | Autoclavable stackable rack for channel slides |
µ-Slide Chemotaxis 2D (chemotaxis slide) | Ibidi, Martinsried, Germany | 80306 | Slide containing chemotaxis chambers (tissue culture treated) |
100x penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
10-100 µL pipette with volume control ring | Eppendorf | 3123000047 | Eppendorf Research plus pipette |
10-200 µL pipette tips | Greiner Bio-One International | 739261 | Pipette tips with beveled tips (96 pieces per rack: sterile) |
14 ml polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352059 | Used to collect peritoneal cells |
14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera | Hamamatsu Photonics Inc., Japan | EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system | |
2-20 µL pipette with volume control ring | Eppendorf | 3123000039 | Eppendorf Research plus pipette |
24-G plastic catheter | B Braun Mesungen AG, Germany | 4254503-01 | Used for peritoneal lavage |
405 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (405 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
488 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
561 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody | Thermo Fisher Scientific | MF48020 | Mouse macrophage marker and plasma membrane label |
Alexa Fluor 594-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone 6D5) anti-mouse CD19 antibody | BioLegend | 115552 | Mouse B cell marker |
C-Chip disposable (improved Neubauer) hemocytometer | NanoEnTek (distributed by VWR International) | 631-1098 | Used to count cells |
CSU-X1 spinning disk scanner | Yokogawa Electric Corporation, Japan | Nipkow spinning disk unit | |
Hank’s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14170120 | Used for peritoneal lavage |
Heat-inactivated fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
Hoechst 34580 | Thermo Fisher Scientific | H21486 | Cell permeable, blue fluorescent nucleic acid stain |
ImageJ (image processing and analysis in Java) | National Institutes of Health (NIH) | Image analysis software | |
Lipopolysaccharides from Escherichia coliO111:B4 | Sigma-Aldrich | L4391-1MG | Toll-like receptor 4 ligand |
Nikon Eclipse Ti inverse microscope | Nikon, Japan | Inverted microscope | |
Patent Blue V, sodium salt | Sigma-Aldrich | 21605-10G | Blue-colored dye used as visual indicator of gradient formation |
Recombinant mouse complement C5a protein | R&D Systems | 2150-C5-025 | Chemoattractant for mouse macrophages |
RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R7388 | Basis medium for assays |
UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system + Volocity software | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Spinning disk confocal microscope system | |
Zeiss LSM 510 + Axiovision software | Carl Zeiss Microscopy, Oberkochen, Germany | Confocal laser scanning microscope (LSM) adapted for phase-contrast microscopy |