Här beskriver vi metoder med time-lapse, fas-kontrast mikroskopi till bild mus bosatt peritoneal makrofager i ett chemotactic komplement C5a gradient. Protokollen kan utvidgas till andra immunceller.
Chemotaxis är receptormedierade vägledning av celler längs en kemisk gradient, medan kemokinesis är stimulering av slumpmässig cellmotilitet av en kemikalie. Chemokinesis och chemotaxis är grundläggande för mobilisering och distribution av immunceller. Till exempel, chemokines (chemotactic cytokines) kan snabbt rekrytera cirkulerande neutrofiler och monocyter till extravaskulära platser för inflammation. Chemoattractant receptorer tillhör den stora familjen av G protein-kopplade receptorer. Hur kemoattractant (dvs ligand) gradienter direkt cellmigration via G protein-kopplade receptor signalering är ännu inte helt klarlagt. Inom immunologi är neutrofiler populära modellceller för att studera kemotaxis in vitro. Här beskriver vi en realtid tvådimensionell (2D) chemotaxis analys skräddarsydd för mus bosatt makrofager, som traditionellt har varit svårare att studera. Makrofager rör sig i långsam takt på ~1 μm/min på en 2D-yta och är mindre väl lämpade för punkt-källa migrationsanalyser (t.ex. migration mot spetsen av en mikropipette fylld med kemoattractant) än neutrofiler eller Dictyostelium discoideum, som flyttar en storleksordning snabbare. Ofta använda Transwell-analyser är användbara för att studera den kemotaktic aktiviteten hos olika ämnen, men ger inte information om cellmorfologi, hastighet eller chemotactic navigering. Här beskriver vi en time-lapse mikroskopi-baserade makrofag chemotaxis analys som möjliggör kvantifiering av cellen hastighet och chemotactic effektivitet och ger en plattform för att avgränsa givare, signal vägar och effektorer av chemotaxis.
Immunceller migrerar vanligtvis singly på en 2D-yta på ett amoeboid sätt1,2, vilket innebär upprepade cykler av utskjutande av fronten, integrin-medierad cell vidhäftning, och upprullning av den bakre. Ett nödvändigt steg är cellpolarisering, där celler bildar främre och bakre ändar3. Chemotaxis börjar med detektion av kemoattractants av G protein-kopplade receptorer och ett komplext signalnät medierad av membran-förankrade heterotrimeric G-proteiner och små monomera g-proteiner, samt fosfolipid-bundna guanin nukleotid utbytesfaktorer (GEFs)4,5. Aktivering av Rho GTPases av Cdc42 och Rac subfamilies framkalla utsprång på framsidan6 och medlemmar av Rho underfamilj, särskilt RhoA, aktivera sammandragning av den bakre5,7. I en tredimensionell (3D) miljö, integrins är till stor del överflödiga för leukocyte migration och RhoA blir viktigare för att klämma celler genom smala passager8, medan Cdc42- eller Rac-inducerad Arp2/3 aktivering är fortfarande viktigt för chemotactic styrning9,10.
Immunceller kan möta olika kemoattractants, särskilt i inställningarna för vävnadsskada, patogeninvasion, och inflammation. De endogena kemoattractants uttryckta på fagocyter kompletterar C3a och C5a, genereras snabbt genom aktivering av komplementkaskaden och erkänns som komplement C3a- och C5a-receptorer. På samma sätt rekryterar nekrotiska celler fagocyter via formylpeptidreceptorer, som känner igen mitokondrierna samt bakteriebaserade formylpeptider11. Immunceller uttrycker också G protein-kopplade receptorer för kemokines, en stor familj av chemoattractant peptider som deltar i regleringen av immuncellshandel under både homeostas och inflammation. Chemokines klassificeras i fyra grupper beroende på avståndet mellan de två första cystein (C) rester: C, CC, CXC, och CX3C cytokiner, där X är en aminosyra. Således, in vivo immunceller måste på lämpligt sätt svara på mycket komplexa rumsliga och tidsmässiga signaler, vilket gör studien av chemotaxis en skrämmande uppgift. Nedan ger vi en kort historia av chemotaxis, som började med intravital imaging metoder.
Studien av leukocyte chemotaxis går tillbaka till 188812, när ögonläkare Theodor Karl Gustav Leber tydligt beskrev riktad migration av leukocyter till, och ackumulering på, platser för inflammation i en modell av mycotic (svamp) keratitis. Leber betonade att attraktionen av överskott leukocyter av patogen-härledda ämnen är viktigt för eliminering av skadliga mikroorganismer via fagocytos, som hade beskrivits av Metchnikoff (även känd som Metschnikoff) tidigare under samma årtionde13. In vivo experiment utfördes också på 1920-talet av Clark och Clark14,15, som drog nytta av öppenheten i grodyngel och visade att steril inflammation framkallas av croton olja14 eller andra irriterande15 orsakade leukocyter att följa blodkärlen, följt av diapedesis (transendotelmigration) och snabb migration genom vävnadsutrymmen mot irriterande. In vitro-experiment med hjälp av mikrocinematografimetoden som utvecklats av Jean Comandon16 visade att leukocyter migrerade mot en partikelkemoattractantkälla såsom bakterier17. På den tiden var de molekylära identiteterna hos kemotaktiska faktorer okända. På 1960-talet erkände Stephen Boyden18 att tekniker för att studera den kemotaktiska aktiviteten hos lösliga ämnen saknades. Han utarbetade en kammare, senare känd som Boyden kammaren, med två fack åtskilda av ett filter papper membran. En cellfjädring tillsätts i det övre facket och testämnet tillsätts antingen i båda facken eller endast till det nedre facket. Efter en inkubationstid avlägsnas filtermembranet och cellerna är fixerade och färgade. Genom att jämföra hur många celler som migrerar över filtermembranet mot den nedre brunnen med testämnet i båda facken, i inget av facken eller endast i det nedre facket, kan chemotactic aktivitet bestämmas. Transwell analyser är fortfarande populära idag och har ändrats på olika sätt, inklusive användning av olika polykarbonat membran med definierade porstorlekar ochdensiteter 19,20. En stor nackdel med Transwell analyser är att det är opraktiskt att direkt visualisera celler migrera och migrationsvägen över membranet vanligtvis inte överstiger diametern på en immuncell.
Sally H. Zigmond utvecklade en chemotaxis kammare21 som möjliggjorde visualisering av både gradientbildning och cellmorfologi med fluorescerande färgämnen. Kammaren består av en plexiglas (akryl) bild med två parallella linjära brunnar, var och en med en volym på ~ 100 μL, åtskilda av en 1 mm bred bro 3-10 μm under det övre planet av bilden. Ett täcket som är sådd med celler vänds in och placeras på bilden så att den spänner över de två brunnarna. Efter tillsats av en chemoattractant till en av brunnarna, bildas en brant chemoattractant lutning över överbrygga, typisk inom 30-90 minuter. Människa polymorphonuclear leukocytes (granulocytes) i zigmondkammaren observeras orientera sig in mot chemoattractanten. Variationer av Zigmond kammaren har rapporterats, inklusive Dunn22 och Insall23 kammare, som båda använder ett täcket seedade med celler placerade över två brunnar åtskilda av en 1 mm bred bro. Dunnkammaren består av koncentriska brunnar åtskilda av en cirkulär bro, medan Insallkammaren är närmare besläktad med Zigmond-kammaren, men ger broar med två olika bredder, 0,5 mm och 1 mm. En ny chemotaxis kammare, kallad μ-Slide Chemotaxis och tillverkas av plast formsprutning, beskrevs av Zemgel et al.24. Cellgiftskammaren består av två 40 μL reservoarer åtskilda av en 1 mm bred kanal med en längd av 2 mm och en höjd av 70 μm. Botten av kammaren bildas av en gas genomsläpplig, tunn plastfolie med samma tjocklek och optiska egenskaper hos en nr 1,5 glas täckhinn24. Här beskriver vi en chemotaxis analys med μ-Slide Chemotaxis kammaren för att visualisera migrationen av mus bosatt peritoneal makrofager för upp till 14 h i en chemotactic (komplement C5a) gradient.
Intravital imaging går tillbaka till 19th century och ger ett sätt att studera beteendet hos levande immunceller i sin naturliga miljö. Men även med dagens avancerade mikroskopi och genetiska tekniker är det svårt att studera cellernas svar på specifika kemoattractants in vivo. För att kringgå detta problem utvecklade Boyden18 Transwell-analyser på 1960-talet, men dessa slutpunktsanalyser gav inte visualisering av hur celler faktiskt migrerade mot kemoattractants, vilket gör det svårt att skilja kemokinesis, stimuleras slumpmässig migration av en kemisk cue32, och chemotaxis, migration mot högre koncentrationer av kemiska stimuli från varandra33. Detta problem löstes genom att utforma olika öppna kammare med en bro, vanligtvis 1 mm bred, belägen mellan två reservoarer och nås med en objektiv21,22,23. Tillämpa en inverterad täckslip, sådd med vidhäftande celler, stänger kamrarna och chemoattractant läggas till en av reservoarerna sprider sig över bron till den motsatta reservoaren, vilket skapar en koncentrationsgradient. Här beskriver vi en chemotaxis-analys med samma princip men med hjälp av en sluten kammare med fyra tankportar. Med hjälp av detta system och time-lapse, fas-kontrast mikroskopi, utvecklade vi en analys för att bild mus bosatt peritoneal makrofager migrera i en chemotactic komplement C5a gradient31,34,35,36. Denna analys, i kombination med knockout mus modeller, visat sig vara avgörande för undersökningen av roller olika Rho GTPases och motoriska proteiner i makrofag morfologi, motilitet, och chemotaxis31,34,35,36,37. Vi har också använt denna metod för att bilden mänskliga perifert blod monocyter migrera på en 2D-yta eller i en 3D kollagen typ I matris38. Dessutom är analysen lämplig för mus benmärg-härledda makrofager eller makrofager som härrör från villkorligt förevigade myeloiska prekursorceller39,40. Vi har tidigare använt polytetrafluoretenpåsar (PTFE) med lueradaptrar för att odla benmärgsceller och få makrofager34. Fördelen med PTFE påsar är att cellerna lätt kan återsuspenderas och klar för användning efter att ha placerat påsen på is i 20-30 min. Observera att vi förfylla chemotaxis slide observation området innan cellerna. Detta tillvägagångssätt har fördelen att oönskade luftbubblor kan spolas ut (med varierande framgång) och det försoakerade observationsområdet möjliggör långsam introduktion av en cellfjädring genom pipettering. Förfyllning ökar dock sannolikheten för att mediet delvis kommer att flöda in i en eller båda av de flankerande reservoarerna, vilket kommer att främja såddning av celler utanför observationsområdet. Alternativt kan cellupphängningen direkt ledas in i ett torrt observationsområde, men oönskade luftbubblor kan inte utvisas senare.
Den peritoneal hålighet av musen innehåller två huvudpopulationer av celler: F4/80+ makrofager och (mindre) CD19+ B-celler, i ett förhållande av ca 1:2 (Figur 4A). Dessa två cellpopulationer står för över 95% av bukhinnan hålighet celler, medan de återstående F4/80–/CD19– celler kan vanligtvis identifieras som CD11c+ celler (dendritiska celler) eller CD3+ celler (T-celler). Svagt vidhäftande B-celler tvättas ut ur observationsområdet under fyllningen av reservoarerna med mediet (figur 2). Efter att ha lagt till chemoattractant till en av de två reservoarerna, time-lapse, fas-kontrast mikroskopi kan användas för att avbilda de återstående cellerna (makrofager) migrera i en framväxande chemoattractant gradient. Bildandet av komplementet C5a lutning i observationsområdet, via diffusion från en reservoar till den andra, kan simuleras med hjälp av en fluorescerande färgämne med liknande molekylvikt. Ett bra substitut för rekombinant mus komplement C5a (förutspådde molekylvikt, 9,0 kDa) är fluorescerande märkt dextran (10 kDa)31. Med hjälp av konfokalmikroskopi kan fluorescensgradienten i den smala kanalen (observationsområdet) som förbinder de två reservoarerna i cellgiftsbilden mätas med fasta intervall och koncentrationsprofiler vid de olika tidpunkterna kan ritas24,31. Vi lägger rutinmässigt till en nonfluorescent, blå färgämne (Patent Blue V) till chemoattractant medium för att ge en bekväm visuell indikator på diffusion och gradient bildning. Inom 1 h efter införandet av 15 μL blått, chemoattractant-innehållande medium i en reservoar, verkar behållaren jämnt blå och, enligt Ficks diffusionslagar, kommer en lutning att bildas över det smala observationsområdet som förbinder reservoarerna (figur 3B). Flera dagar krävs för att lösen (blått färgämne eller chemoattractant) ska bli jämnt fördelad.
Fluorescensmikroskopi kan ersättas med faskontrastmikroskopi, vilket ger fördelar för automatiserad cellspårning, eftersom fluorescerande märkta celler lätt kan skiljas från bakgrunden. En annan fördel är att specifika populationer av immunceller selektivt kan spåras efter märkning av ytmarkörer med fluorescerande antikroppar. Vi använde detta tillvägagångssätt för att avbilda humant perifert blod CD14+ celler (monocyter) migrera i en chemotaktisk fMLP (N-formylmetionin-leucyl-fenylalanin) gradient38. På samma sätt kan fluorescerande anti-F4/80 antikroppar användas för att avbilda mus makrofager migrera i ett chemotactic komplement C5a gradient. Fototoxicitet är en potentiell nackdel med att använda fluorescensavbildning41. Detta kan minskas med olika medel42, inklusive med fluorofores upphetsad med längre våglängder och lägga antioxidanter till mediet. Alternativt kan märkta celler initialt identifieras genom fluorescensmikroskopi och därefter avbildas av time-lapse, fas-kontrast mikroskopi. I praktiken kan dock celler som rör sig med måttligt låga hastigheter, såsom ~1 μm/min (makrofager) eller ~4 μm/min (monocyter), intermittent avbildas genom fluorescensmikroskopi med intervaller på minuter, vilket tolereras väl38. Vi använde tidigare fluorescensmikroskopi och chemotaxis slide beskrivs här för 3D chemotaxis analyser38,,43. I detta fall var båda reservoarerna förfyllda med medium och 15 μL chemoattractant-innehållande medium drogs in i en av reservoarerna omedelbart före långsamt pipetterande fluorescerande märkta celler upphängda i medium som innehåller kollagen typ I i observationsområdet. Den svåra delen av detta förfarande är hanteringen av kollagen typ I, som är koncentrerad till sur lösning. Kollagenlösningens pH måste neutraliseras genom tillsats av alkalisk lösning innan den iskalla kollagenlösningen blandas med cellfjädringen. Överföring av kollagencellblandningen till en inkubator vid 37 °C kommer att initiera kollagenpolymerisering. Under inkubationen ska bilden långsamt roteras runt sin långa axel så att cellerna förblir jämnt fördelade i riktningarna X-, Y- och Z-axeln medan kollagenet polymeriserar till en gel. En närstående sluten chemotaxis bild lämplig för 3D chemotaxis analyser, med sex pluggar i stället för fyra pluggar, har nyligen beskrivits29. Detta system gör det möjligt att föra in kollagencellblandningen i observationsområdet innan den självständigt fyller var och en av de flankerande reservoarerna, eftersom varje reservoar har två fyllningsportar, snarare än en enda port.
Sammanfattningsvis beskriver vi en realtid chemotaxis analys som gör det möjligt visualisering av celler navigera i en chemotactic gradient under en period av 6 eller fler timmar. Häri fokuserar vi på makrofager, som spelar stora roller i inflammatoriska sjukdomar men har varit underrepresenterade i realtid chemotaxis analyser jämfört med snabbare rörliga celler som neutrofiler och Dictyostelium amöba.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av ett bidrag (HA 3271/3-2) från DFG (Deutsche Forschungsgemeinschaft).
µ-Slide (anodized aluminium) rack | Ibidi, Martinsried, Germany | 80003 | Autoclavable stackable rack for channel slides |
µ-Slide Chemotaxis 2D (chemotaxis slide) | Ibidi, Martinsried, Germany | 80306 | Slide containing chemotaxis chambers (tissue culture treated) |
100x penicillin/streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
10-100 µL pipette with volume control ring | Eppendorf | 3123000047 | Eppendorf Research plus pipette |
10-200 µL pipette tips | Greiner Bio-One International | 739261 | Pipette tips with beveled tips (96 pieces per rack: sterile) |
14 ml polypropylene round bottom tubes | BD Falcon | 352059 | Used to collect peritoneal cells |
14-bit Hamamatsu C9100-50 Electron Multiplying-Charged Couple Device (EM-CCD) peltier-cooled camera | Hamamatsu Photonics Inc., Japan | EM-CCD camera of the spinning disk confocal microscope system | |
2-20 µL pipette with volume control ring | Eppendorf | 3123000039 | Eppendorf Research plus pipette |
24-G plastic catheter | B Braun Mesungen AG, Germany | 4254503-01 | Used for peritoneal lavage |
405 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (405 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
488 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (488 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
561 nm solid state laser, 50 mW | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Laser (561 nm) source of spinning disk confocal microscope system | |
Alexa Fluor 488-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone BM8) anti-mouse F4/80 antibody | Thermo Fisher Scientific | MF48020 | Mouse macrophage marker and plasma membrane label |
Alexa Fluor 594-conjugated rat (IgG2a) monoclonal (clone 6D5) anti-mouse CD19 antibody | BioLegend | 115552 | Mouse B cell marker |
C-Chip disposable (improved Neubauer) hemocytometer | NanoEnTek (distributed by VWR International) | 631-1098 | Used to count cells |
CSU-X1 spinning disk scanner | Yokogawa Electric Corporation, Japan | Nipkow spinning disk unit | |
Hank’s buffered salt solution without Ca2+ and Mg2+ | Thermo Fisher Scientific | 14170120 | Used for peritoneal lavage |
Heat-inactivated fetal bovine serum | Thermo Fisher Scientific | 10082139 | Used as supplement for RPMI 1640 media |
Hoechst 34580 | Thermo Fisher Scientific | H21486 | Cell permeable, blue fluorescent nucleic acid stain |
ImageJ (image processing and analysis in Java) | National Institutes of Health (NIH) | Image analysis software | |
Lipopolysaccharides from Escherichia coliO111:B4 | Sigma-Aldrich | L4391-1MG | Toll-like receptor 4 ligand |
Nikon Eclipse Ti inverse microscope | Nikon, Japan | Inverted microscope | |
Patent Blue V, sodium salt | Sigma-Aldrich | 21605-10G | Blue-colored dye used as visual indicator of gradient formation |
Recombinant mouse complement C5a protein | R&D Systems | 2150-C5-025 | Chemoattractant for mouse macrophages |
RPMI 1640 medium containing 20 mM Hepes | Sigma-Aldrich | R7388 | Basis medium for assays |
UltraVIEW Vox 3D live cell imaging system + Volocity software | Perkin Elmer, Rodgau, Germany | Spinning disk confocal microscope system | |
Zeiss LSM 510 + Axiovision software | Carl Zeiss Microscopy, Oberkochen, Germany | Confocal laser scanning microscope (LSM) adapted for phase-contrast microscopy |