Immunology and Infection

גישה תוך-ויטאלית המבוססת על מיקרוסקופיה להערכת חמלה במעיים וביצועי שפיכת תאים אפיתל

Published: December 3, 2020 doi: 10.3791/60790

Luz DC. Martínez-Sánchez*¹, Rashmita Pradhan*¹, Phuong A. Ngo¹, Lena Erkert¹, Lukas S. Becker¹, Alastair J. Watson², Imke Atreya*¹, Markus F. Neurath*¹, Rocío López-Posadas*¹

¹Medical Clinic 1, University of Erlangen-Nuremberg, University Hospital of Erlangen, ²Norwich Medical School, University of East Anglia, Norwich Research Park

* These authors contributed equally

Summary

Abstract

מיקרוסקופ תוך-ויטאל של המעיים באמצעות הדמיה קונפוקלית מאפשרת תצפית בזמן אמת על שפיכת תאים אפיתל ודליפת מחסום בבעלי חיים חיים. לכן, רירית המעיים של עכברים מרדימים מוכתמת באופן מקומי בכתמים לא ספציפיים (acriflavine) ומעקב פלורסנט (rhodamine-B dextran), המותקן על צלחת שטופת תמיסת מלח ותמונה ישירה באמצעות מיקרוסקופ confocal. טכניקה זו יכולה להשלים טכניקות לא פולשניות אחרות כדי לזהות דליפה של חמלה מעיים, כגון מעבר transmucosal של מעקבים דרך הדם. חוץ מזה, הגישה המוצגת כאן מאפשרת התבוננות ישירה של אירועים שפיכת תאים בזמן אמת. בשילוב עם עכברים כתב פלורסנט מתאים, גישה זו מתאימה שפיכת אור לתוך מנגנונים תאיים ומולקולריים השולטים בהבלטת תאי אפיתל מעיים, כמו גם תהליכים ביולוגיים אחרים. בעשורים האחרונים, מחקרים מעניינים באמצעות מיקרוסקופ תוך ויטלי תרמו לידע על חמלה אנדותל, תאי מערכת החיסון המעיים ביות, תקשורת חיסונית-אפיתל ופלישה של רכיבים זוהרים, בין היתר. יחד, הפרוטוקול המוצג כאן לא רק יעזור להגביר את ההבנה של מנגנונים השולטים בהבלטת תאים אפיתל, אלא גם יכול להיות הבסיס להתפתחות של גישות אחרות לשמש ככלים כדי לדמיין תהליך תאי דינמי מאוד אחרים, אפילו ברקמות אחרות. בין מגבלות טכניות, מאפיינים אופטיים של הרקמה הספציפית, כמו גם טכנולוגיית ההדמיה שנבחרה ותצורת מיקרוסקופ, בתורו, לקבוע את מרחק העבודה הדמיה, ורזולוציה של תמונות שנרכשו.

Introduction

המעי הוא איבר מיוחד מאוד עם פונקציה מוסדרת היטב המאפשרת תהליכים סותרים, כלומר תזונה והגנה מפני חומרים זוהרים מזיקים. רירית בין גוף האדם לסביבה, אפיתל המעי פועל כמחסום פיזי ואימונולוגי ותורם לתחזוקה של הומאוסטאזיס רירית בבטן^1,^,². אובדן שלמות אפיתל וחחלת צומת הדוקה מוגברת ידוע להיות קשור עם מחלות מעי דלקתיות (IBD)^3,^,^4,^,^5,^,⁶. שינויים אפיתל נחשבים לאחר מכן כגורמים ומדלקים משניים לדלקת מעיים כרונית בIBD. לכן, הבנה משופרת של שינויים אפיתל מוקדם בבטן של חולי IBD יהיה בעל ערך עצום לפיתוח אסטרטגיות חדשות כדי לשחזר את שלמות האפיתל לחיזוי אמין ומניעה שלאחר מכן של נסיגה IBD.

אפיתל מעיים עוקב אחר תהליך תחלופה מורכב ומוסדר היטב. מתחתית הקריפטה, תאי אפיתל מעיים מובחן סופני (IECs) המופקים מתאי גזע פלורופוטנטיים נודדים כלפי מעלה אל קצה הווילוס, שם נשפכים תאים^{בגילאים/פגומים לתוך}הלומן 7 . שיווי המשקל בין החלוקה לבין שברי התא מאפשר תחזוקה של מספרי תאי אפיתל מעיים, הימנעות היווצרות של פערים ודליפה, כמו^{גם הצטברות}של תאי אפיתל שעלולים להוביל להסימת תאים^{ותאי גידולים 8}^,⁹^,10 . למרות התפקיד המרכזי של שפיכת תאי אפיתל בחידוש הפיזיולוגי של אפיתל הבטן, הידע על המנגנונים המולקולריים המניעים את ההבלטה של תאים בקצה villus מוגבל. לכן, יש צורך במחקר בסיסי המספק תיאור מדויק של רצף האירועים המולקולריים המעורבים בהזלת תאים אפיתל.

אינטראקציות מורכבות בין סוגי תאים שונים בתוך ררית המעיים הם המפתח כדי להבין את המנגנונים המולקולריים ויסות תחלופת אפיתל והונוסטרזיס מעיים. כך, במחקרי vivo מציעים יתרונות גבוהים על פני גישות vio ex ו-ex בהקשר זה. יתר על כן, טכניקות הדמיה בזמן אמת מאפשרות את התיאור של רצף האירועים השולטים בתופעות ספציפיות. בהקשר זה, המחקר של תהליכים דינמיים מאוד דורש את השימוש בטכניקות ברזולוציה גבוהה אופטימיזציה להתבוננות ישירה של הרקמה. טכניקות הדמיה תוך-ויטאליות מופיעות ככלים מתאימים ייחודיים לחקר שפיכת תאי האפיתל בבטן.

המונח "מיקרוסקופ תוך ויטאל" מתייחס גישות ניסיוניות ניצול של טכניקות הדמיה ברזולוציה גבוהה (multiphoton או מיקרוסקופית confocal) כדי לדמיין ישירות תאים ורקמות בסביבה המקומית שלהם בתוך בעל חיים^{חי 11.} הוא מאפשר רכישה בזמן אמת של מידע vivo עד רזולוציה של תא יחיד, וכרוך יתרונות ברורים על פני שיטות סטטיות או ברזולוציה נמוכה. מיקרוסקופ תוך-ויטאל מספק מידע משלים ומתגבר על כמה מגבלות מטכניקות קלאסיות ו/או מתקדמות, כגון חפצים עקב עיבוד רקמות. לעומת זאת, המגבלה העיקרית של מיקרוסקופ תוך וינטלי היא כי הרקמה צריכה להיות חשופה ישירות למיקרוסקופ, אשר ברוב המקרים דורש ניתוח. למרות גישות מתוחכמות לשמר את החיוניות ולמזער את ההשפעה של הרקמה הדמיית (תאי skinfold וחלונות הדמיה)^12,^,¹³, ברוב המקרים חתך עור פשוט מבוצע עבור החיצוניזציה של הרקמה (מגני העור)^14. בעשור האחרון, גישות אלה תרמו ראיות מפתח על תהליכים דינמיים מאוד, שהיו בעבר בלתי מובנים. תרגום, הדמיה בזמן אמת סיפקה תובנות ביולוגיות חדשות על תאי גזע וleukocytes^{ביות 15}, כמו גם^{סרטן הפצת גרורות היווצרות 13}^,¹⁶. בהקשר הקליני, אנדומיקרוסקופיה מנוצלת כיום ככלי אבחון^{של סרטן 17} ומחלות במערכת העיכול, כגון IBD¹⁸^,¹⁹; בעוד מיקרוסקופים confocal הפך כלי פתולוגי מהיר במהלך ניתוח²⁰. יחד, מיקרוסקופ תוך ויטאל התגלה לאחרונה ככלי רב ערך ורב-תכליתי למחקר ביו-רפואי ויישום עתידי במרפאה.

מיקרוסקופ תוך ויטאל מיושם כאן להדמיה בזמן אמת של דליפת אפיתל מעיים והתבוננות של אירועי שפיכת תאים אפיתל. דליפה של חרנטיות מעיים ניתן לזהות על ידי אחרים בטכניקות vivo פולשניות, כגון כימות של ניהול דרך האלי של מעקבי פלורסנט בסרום²¹. עם זאת, טכניקה זו אינה מאפשרת תצפית ישירה של ביצועים שפיכה או את ההפרדה בין חירנות para-ו trans-תאי. השילוב של ניסויי מעקב סטנדרטיים ומיקרוסקופיה תוך-ויטאלית מייצג גישה מתאימה: i) לזהות הפרעות חחלל מעיים, ו- ii) לבודד בין חירנות אפיתל para-ו טרנס-תאי. מלבד שפיכת תאים, מיקרוסקופ תוך-וייטל בשילוב עם תיוג פלואורסצנטי vivo מאפשר מחקר של מנגנונים תאיים ומולקולריים אחרים (למשל, צומת הדוק הפצה מחדש במהלך שפיכת תאים^{באמצעות עכברים כתב פלורסנט 22} או אינטראקציות בין IECs ותאים אחרים בתוך רירית העיכול²³).

השיטה המוצגת כאן מייצגת התאמה של מיקרוסקופ תוך-ויטאלי כדי לאפשר תצפית בזמן אמת על רירית מעיים, באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונקודלי (CLSM). לכן, אנו משתמשים בעכברים מותנה נוק-אאוט של GGTase (Geranylgeranyltransferase) בתאי אפיתל מעיים (IECs) ב (Pggt1b^i大IEC עכברים), מאז הם סובלים ממחלת מעיים חמורה וחדירות אפיתל^{מוגברת 24}. הכנה כירורגית של העכבר והכתמים של ררית המעיים, כמו גם הגדרות מתאימות המשמשות לרכישת הדמיה וניתוח לאחר הרכישה מתוארים. פרוטוקול זה יכול לאפשר מחקרים עתידיים התורמים לידע הנוכחי על דינמיקה וקינטיים של שפיכת תאי אפיתל מעיים. יתר על כן, הפרוטוקול יכול לשמש בסיס לתאמות שונות כדי ללמוד תופעות אחרות המתרחשות על פני השטח של ררית המעיים, ואפילו ברקמות אחרות.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

הפרוטוקול הבא אושר על ידי הרשויות המקומיות הרלוונטיות בארלאנגן (רג'ירונג פון אונטרפרנקן, וירצבורג, גרמניה). עכברים היו אוחסנו בתנאים ספציפיים ללא פתוגן.

הערה: עיכוב של prenylation בתיווך GGTase בתוך IECs גורם לשינוי חמור של חחללות מעיים בעכברים iPc²⁴ Pggt1b^iPc . לכן, מודל עכבר זה שימש כדי להדגים כיצד הפרוטוקול יכול להיות שימושי ללמוד פגמים במחסום מעיים. עם זאת, פרוטוקול זה יכול לשמש לחקר של כל קו עכבר אחר.

1. הכנה כירורגית וכתמים מררית מעיים בעכבר

הערה: ההכנה הכירורגית מבוססת על פרוטוקולים שתוארו קודם^{לכן 25}. שמור את העכבר המרדים מתחת למנורה אדומה במהלך ההכנה הכירורגית, כדי למנוע ירידה בטמפרטורת הגוף.

עכבר מים מים על ידי הזרקת תוך אפרטונאל של קטמין / xylazin (96 מ"ג / ק"ג קטמין; ו 12.8 מ"ג / ק"ג xylazin). אמת את ההרדמה על-ידי בדיקה של חוסר רפלקס עפעפיים.
למרוח קרם להגנה על העיניים באמצעות ניצן כותנה.
בצע חתך (1 ס"מ) באזור האוורור השמאלי באמצעות מרסים סטנדרטיים ומספריים עדינים ישרים.
חוץ קטע של המעי (5-7 ס"מ, בערך).
פתח את קטע המעי החיצוני לאורך על ידי אלקטרוקוטריזציה בצד האנטי-מיסנטריק.
לחשוף את רירית ולשטוף בקרוב עם תמיסת מלח כדי להסיר תוכן צואתי.
הערה: לחלופין, להחיל xylazin ישירות על הבטן כדי למנוע חפצים תנועה עקב פריסלזיס.
מכתים את פני השטח של רירית המעיים עם acriflavine ו rhodamine-B דקסטרן (10 kDa).
1. החל את 1 מ"ג /מ"ל acriflavine פתרון (100 μL) על ידי pipetting טיפה על רירית דגירה במשך 3 דקות. לשטוף את הפתרון הנותר עם PBS.
2. להחיל את הפתרון 2 מ"ג /מ"ל rhodamine-דקסטרן (100 μL) על ידי pipetting טיפה על הררית דגירה במשך 3 דקות. לשטוף את הפתרון הנותר עם PBS.
  הערה: לחלופין, הסר דם מההכנה באמצעות כותנה אפטית.
מניחים את העכבר המהמם על מגלשת מכסה המותקן בתא שטיפה בתמיסת מלח חמה מראש (37°C).
הערה: מקטע המעי הפתוח ממוקם לאחר מכן משטח זוהר כלפי מטה, על שקופית הכריכה.
מניחים את ההכנה (עכבר מים בשקע) על שלב המיקרוסקופ ההפוך.
מכסים את החיה במשטח זהותרמי (כ-37°C).
המשך מיד למיקרוסקופ תוך-וייטלי.
הערה: לשמור על ההכנה הכירורגית שטיפה עם תמיסת מלח חם מראש כדי למנוע התייבשות של הרקמה ומוות התא.

2. מיקרוסקופ תוך ויטאל

הערה: בצע שלב 2.1 לפני תחילת ההכנה הכירורגית, כדי למנוע זמני המתנה ארוכים בין הרדמה, ניתוח ורכישת תמונה. במידת הצורך, ניתן לתת מינונים נוספים של הרדמה לבעלי חיים שהוכנו בניתוח כדי לשמור אותם תחת הרדמה לניסוכי הדמיה.

הגדר את מיקרוסקופ ה-CLSM.
1. הפעל את מיקרוסקופ CLSM על-ידי הפעלת בסיס המיקרוסקופ ואת תיבת הסורק. הפעל את המחשב על-ידי לחיצה על לחצן התחל.
2. הפעל את תוכנת רכישת התמונה (לדוגמה, LAS X) על-ידי לחיצה כפולה על הסמל. בחר את התצורה המתאימה (תצורה: מחשב; מיקרוסקופ: DMI6000) ולחץ על אישור.
  1. הגדר את הרזולוציה המתאימה. עבור אל קביעת תצורה | חומרה | רזולוציה | עומק סיביות. בחר 12.
3. עבור לתפריט רכישה. בחר xyzt עבור מצב רכישת התמונה מהתפריט הנפתח. בחר את המטרה מתפריט הנפתח (20x או 40x).
4. עצב את הגדרת הרכישה הנצברת. לחץ על Seq. הוסף רצף שני, על-ידי לחיצה על לחצן הוסף (+). בחר בין מסגרות.
  1. קביעת תצורה של רצף 1 (זיהוי acriflavine; 416 נה"מ; פליטת 514 נה"מ). הפעל את תיבת הלייזר הגלויה. הפעל את PMT1 (מופעל). הגדר את חלון אורך גל הפליטה (490-550 00 00 00 00 00 00 00:00:00:00:00,000 --&
  2. קביעת תצורה של רצף 2 (זיהוי של rhodamineB-dextran; 570 נה"מ excitation; 590 נה"מ, פליטה). הפעל את תיבת הלייזר הגלויה. הפעל את PMT2 (מופעל). הגדר את חלון אורך גל הפליטה (550-760).
5. הפעל את הלייזרים המתאימים (488 ו- 552). עבור אל קביעת תצורה | לייזרים. הפעל לייזרים 488 ו- 552 nm (הפעל).
התאם את ההגדרה לתכונות הספציפיות של הניסוי הנוכחי.
1. הפעל את מקור האור (לחץ על מתח). מניחים את ההכנה (עכבר מנומס בתא) על שלב המיקרוסקופ ולשנות את מיקום xy עד ציר התאורה מתמקד בהכנת הרקמה.
2. בחר את שדה העניין באמצעות מקור האור הסטנדרטי והעין.
  1. בחר את קוביית המסנן (I3). פתח את התריס. התמקד על פני השטח של ררית המעי באמצעות המאקרו והמיקרו-גלגל. חפש אזור שבו ניתן לדמיין מספר villi בתוך שדה הראייה על-ידי שינוי מיקום XY.
3. ודא כי הכתם רודאמין-דקסטרן גלוי גם באזור זה. שנה את קוביית המסנן (N2.1). בדוק את התמונה דרך העיניות.
4. הפעל את רכישת התמונה CLSM מהתוכנה. מטב הגדרות עבור שני הרצפים.
  1. בחר רצף 1. כוונן כוח לייזר, רווח והיסט עבור רצף 1.
  2. בחר רצף 2. כוונן את כוח הלייזר, רווח והיסט עבור רצף 2.
5. הגדר את טווח מחסנית z.
  1. פתח את תפריט המסירה של מחסנית Z. התמקד על פני השטח של ריר באמצעות פקד ציר z. הקש בגין.
  2. התמקדי במגבלה התחתונה שבה האות עדיין ניתן לזיהוי. לחץ על קצה.
  3. הגדר את המספרים של ערימות z (10). הימנע מטעויות זמן של יותר מ-2 דקות עבור שתי נקודות זמן רצופות.
6. הגדר את הגדרות הזמן. עבור לתפריט שעה. לחץ על מזער. בחר רכוש עד לפסקת הזמן.
7. הגדר את ממוצע הקו. בחר Seq 1. בחר ממוצע שורה 2. בחר Seq 2. בחר ממוצע שורה 2.
רכוש תמונות מתאימות.
1. בחר תבנית (1024 x 1024) ומהירות (400). לחץ על התחל.
2. לחץ על עצור לאחר זמן רכישת התמונה הרצוי.
שמור את הקובץ. עבור אל פרוייקט. לחץ לחיצה ימנית על הקובץ המתאים. לחץ על שמור בשם.
1. תן שם לקובץ כראוי. בחר את התיקיה ההולם. לחץ על שמור.
המתת סד החיה (נקע צוואר הרחם) ולאסוף רקמות לניתוח נסתר, במידת הצורך.

3. ניתוח תמונה: לקבוע את קצב שפיכת התא ואת אפיתל המעיים

קצב שפיכת תאים
1. הפעל את תוכנת רכישת התמונה.
2. עבור אל פתח פרוייקטים. בחר את הקובץ המתאים.
3. הגדר את הזמן הכולל של רכישת תמונה.
  1. בחר את מחסנית z המלאה האחרונה. בחר את מיקום ה- Z האחרון מנקודת הזמן שנבחרה קודם לכן. קרא את השעה בפינה התחתונה השמאלית של המסך (הזמן הכולל של רכישת תמונה).
4. בחר וילוס.
  1. בחר את מיקום מחסנית Z המתאים (משטח של villus, אבל עמוק מספיק כדי למנוע את ההפרעה עם תאים כבר לשפוך ורכיבים אחרים נוכחים lumen).
  2. למדוד את אורך קרום בסיס. בחרו בכלי הסרגל. מחלקים את ה-villus במספר קווים כדי לכסות או למשוך את כל ההיקף. הוסף את הערכים השונים (אורך כולל של קרום בזל). מחק את המקטעים של הכלי סרגל.
5. ספירת מספר האירועים המתרחשים במהלך כל משך רכישת התמונה.
  1. מחלקים את ה-villus למקטעים בגודל מתאים. נתח את רצף האירועים/מקטע על-ידי החלקת הרף בנקודות הזמן השונות. ביאור של אירועי שפיכת התא המזוהים.
6. חשב את מספר אירועי שפיכת / זמן / אורך של קרום בסיס, המציין את קצב שפיכת התא. לספור עד 5 villi / וידאו, ולפחות שני קטעי וידאו / עכבר. חשב את ממוצע 10 המידות הללו.
דליפה
1. בחר וילוס.
2. בחר את מיקום מחסנית Z המתאים (משטח של villus, אבל עמוק מספיק כדי למנוע את ההפרעה עם תאים כבר לשפוך ורכיבים אחרים נוכחים lumen). ספירת מספר כולל של תאי אפיתל/villus.
3. לספור את מספר נקודות דליפה (נוכחות Para-תאי של רודמין דקסטרן. אירוע זה הוא ארעי, אשר ניתן לאשר על ידי בדיקת תמונות קודמות ורכש נסתר).
4. חשב את מספר הדליפה/מספר כולל של תאי אפיתל. לנתח 10 villus /מדגם / וידאו שונים ולחשב את המספר הממוצע של דליפה ותאים חדירות / villus.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

הפרוטוקול המוצג כאן מתאר גישה תוך-ויטאלית מבוססת מיקרוסקופיה כדי לדמיין דליפת אפיתל מעיים ולצפות בביצועי שפיכת תאים בבטן בזמן אמת. בקצרה, עכברים מנופים ומוגשים להכנה כירורגית על מנת לחשוף את פני השטח של ררית המעי הדק. IECs מוכתמים לאחר מכן באמצעות יישום אקטואלי של acriflavine; בעוד rhodamine B-דקסטרן זוהר משמש מעקבים כדי לזהות מעבר transmucosal מן הלומן לחלל תת אפיתל. לכן, ההכנה הכירורגית והעכבר המרדים ממוקמים על שקופית המוצבת בצלחת פטרי ומדמיינת לאורך זמן באמצעות CLSM (איור 1). ניתוח שלאחר הרכישה מאפשר חישוב של קצב שפיכת תאים אפיתל (מספר אירועי שפיכת תאים / דקה / אורך של קרום בסיס) כמו גם את אחוז דליפה ארעית (חירות paracellular) ו "תאים חדירים" (חירות טרנס-תאית) בנקודת זמן נחושה.

על מנת לגרום לשינויים של שלמות האפיתל, ניצלנו את מודל העכבר המותנה GGTase-לקוי שתואר קודם לכן על-ידי IEC (עכברי Pggt1b^iƠIEC), שנוצר באמצעות מערכת LoxP-Cre²⁴. כפי שתואר קודם לכן, עכברי Pggt1b^i大IEC (איור 2א')פיתחו פתולוגיה חמורה במעי כפי שמוצג על ידי הגדלת ניקוד הנזק היסטולוגי במעיהדק (איור 2ב'). חריצות אפיתל מעיים מוגברת ניתן לזהות באמצעות מעקב בניסויי vivo באמצעות FITC-dextran מנוהל דרך הדרך (4 kDa) (איור 2C), ולאחר מכן אישר באמצעות מיקרוסקופ תוך ויטלי (איור 2D-2E). בעוד rhodamine dextran מוגבל לתא הזוהר בעכברי שליטה, אנחנו יכולים לזהות את המעקב בתוך תא תת אפיתל עם תבליט של ביטוי GGTase בתוך IECs בעכברים ipct1b^ipc. במהלך רכישת תמונה, ניתן לזהות אירועי שפיכת תאים כתאים הנעים מתוך המונו-שכבת האפיתל אל הלומן, מה שמוביל לפערים זמניים באיטום האפיתל, אשר סוף סוף נסגרים על ידי המגע בין תאים שכנים, מה שנקרא zip-effect (איור 3א'). אנו יכולים לבחון בבירור את הפערים הללו, מה שאנו מכנים דליפת אפיתל זמנית הן בשליטה והן בעכברי IGGT1b^iIeC, אם כי תדירות התופעה הייתה גבוהה יותר באחרון(איור 3B,3C). מעניין, אנחנו יכולים גם לזהות תאים אחרים שבו dextran יכול להתגלות תוך תאית, מה שנקרא "תאים חדירים"; אירועים אלה התרחשו בעיקר בעכברים Pggt1b^i大IEC (איור 3B,3D). יחד, תוך ניצול הגישה התוך-ויטלית המוצגת כאן, נוכל לקבוע כי שלמות אפיתל לקויה בעכברי Pggt1b^iIEC מובילה לשינויי ביצועים של שפיכת תאים וחחלל אפיתל מוגבר בבטן.

איור 1: תיאור סכמטי של גישת המיקרוסקופיה התוך-וייטלית המוצגת כאן. (א) תרשים זרימה. (ב) דיאגרמה. לאחר הכנה כירורגית, רירית המעיים מוכתמת topically עם acriflavine ו rhodamine דקסטרן מותקן על כיסוי החלקה מוטבע על צלחת פטרי כדי לאפשר עירוי עם תמיסת מלח (משטח זוהר כלפי מטה). ררית המעיים היא תמונה לאחר מכן באמצעות מיקרוסקופ CLSM לאורך זמן. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 2: שלמות אפיתל לקויה בעכברי Pggt1b^i大IEC המובילה לחלחלות מעיים מוגברת. (A) כתם מערבי המציג ביטוי GGTase-1B המושרה על-ידי טמוקסיפן בתוך IECs ב- Pggt1b^i大IEC לעומת עכברי בקרה. (ב)ציון היסטולוגי של המעי הדק מהשליטה ועכברי Pggt1b^i大IEC. (ג)כימות חרנטיות אפיתל מעיים ב vivo נמדד על ידי מעבר transmucosal של FITC-Dextran מנוהל דרך הדרך (4 kDa). (D)דיאגרמה המתארת את כיוון רכישת התמונה, מהלומן כלפי מטה ועד לציר villus. תמונות מייצגות מערימה Z. (ה)תמונות מייצגות של מיקרוסקופ תוך-ויטאליות באמצעות acriflavine מיושם אקטואלי ורודמין B-דקסטרן משליטה ועכברים iggt1b^iC, כמתואר בכתב יד זה. הנתונים מבוטאים כבדיקה ± SEM. * ערך P ≤ 0.05; ערך P ≤ 0.0001. לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

איור 3: ביצועי שפיכת תאים אפיתל וחחלל אפיתל para/trans-cellular באמצעות מיקרוסקופיה תוך-ויטלית. (א)תמונות מייצגות המציגות אירוע שפיכת תאים בזמן אמת (חץ לבן). תא המחסן מובלט מהמונו-שכבת האפיתל ללומן. תאים סמוכים לאטום את הדליפה הזמנית (אפקט zip) כדי למנוע אובדן של פונקציית מחסום. (ב)תמונה מייצגת המציגה דליפה (חצים לבנים) ותאי אפיתל חדירים במעיים (חצים כחולים). (C-D) מה אתה עושה? כימות של דליפה זמנית (C) ותאים חדירים(D)בשליטה ועכברים iggt1b^iIEC. הנתונים מבוטאים כבדיקה ± SEM. * ערך P ≤ 0.05; ערך P ≤ 0.0001 . לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של נתון זה.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

למרות שמבחינה טכנית מאתגרת, מתודולוגיה מבוססת מיקרוסקופיה תוך-ויטאלית מייצגת גישה ניסיונית ייחודית כדי לדמיין תהליך תאי דינמי מאוד בזמן אמת, כגון ביצועי שפיכת תאים. עד כה, אין גישה ניסיונית חלופית כדי לדמיין את הבלטת התא ב vivo. אנו מאמינים כי פרוטוקול זה יכול לתרום לתיאור של תהליכים סלולריים מגוונים לשחק תפקיד בתחזוקת ההונואוסטזיס מעיים.

תוך ניצול של מיקרוסקופ תוך-ויטאל, השיטה המוצגת כאן מאפשרת הדמיה בזמן אמת של שפיכת תאי אפיתל במעיים בבעלי חיים חיים. לכן, רירית מעיים מוכתמת topically (acriflavine ו rhodamine B-dextran) של עכברים מרדימים הוא תמונה עד רזולוציה של תא יחיד באמצעות מיקרוסקופית confocal. בשילוב עם ניסויי מעקב סטנדרטיים, הוא מאפשר זיהוי של הפרעות חמלה מעיים בvivio ואת ההבחנה בין חירנות para-ו trans-תאי. בשילוב עם עכברים עיתונאיים, פרוטוקולים דומים מנוצלים כדי לפקח על שפיכת תאים אפיתל יכול להראות הפצה מחדש צומת הדוקה כדי לאטום את דליפה ארעית שמאל על ידי התאים הבולטים (אפקט zip-like)^22,^,²⁶.

מלבד שפיכת תאים אפיתל, שינויים בשיטה המוצגת כאן הותאמו לניתוח של תהליכים תאיים דינמיים מאוד אחרים המתרחשים על פני השטח של רירית המעיים. לדוגמה, ניהול תוך וריד של מולקולות מעקב וכלי דם מכתימים עם נוגדנים נגד CD31 סיפק את ההזדמנות להעריך את שלמות אנדותל^{בבטן 27}. מעבר לאפיתל, גישות דומות שימשו כדי לחקור את תכונות הביות מעיים של תאים^{חיסוניים 28}^,²⁹, כמו גם אינטראקציה בין תאים חיסוניים ו- IECs בהקשר של זיהום מעיים²³.

למרות שפע של יישומים פוטנציאליים של פרוטוקול כאן המתואר, יש גם כמה מגבלות לשימוש בו. פיזור אור בתוך הדגימה פוגע ברכישת הדמיה עמוקה בתוך הרקמה. במקרה של מעי קטן, רכישת התמונה מוגבלת לתופעות המתרחשות על פני הררית (קצה villus). מצד שני, המבנה והתפקוד של הבטן עצמה מגבילים את הביצועים של מיקרוסקופ תוך-ויטאל. למרות תכונות אופטיות איברים אופטימלי, התכווצות רקמה פריסלטית, כמו גם תנועה המושרה זרימה של villi מעיים לרמוז שינויים תכופים על מישור המיקוד במהלך רכישת תמונה.

שינויים פוטנציאליים בפרוטוקול המוצג כאן עשויים להתגבר על חלק ממגבלות אלה. השימוש בטכניקות מיקרוסקופיות חלופיות, כגון פוטן אחד או מיקרוסקופ multiphoton, מרמז על עומק חדירות גבוה יותר על מנת לדמיין מטוסי מיקוד הממוקמים עד 50-100 μm מתחת לפני השטח של המדגם. עם זאת, חשוב לשקול את הפשרה בין רזולוציית תמונה לזמן הרכישה, שכן ניסויים אלה מכוונים להתבוננות בתהליכים מהירים ודינמיים. במונחים של תצורת מיקרוסקופ ו/או הגדרות, השימוש באורכי גל ארוכים יותר, כמו גם הבחירה של מטרות מרחק עבודה חופשי ארוך עם צמצם מספרי גבוה כרוכים בהגדרות ממוטבות עבור הדמיה תוך-ויטלית.

יחד, עיצוב ניסיוני אופטימלי תוך מתן בחשבון את הבחירה של צבעי פלורסנט מתאימים ואת טכניקת המיקרוסקופ, כמו גם את התצורה של מכשיר ההדמיה צריך להיחשב כצעדים מרכזיים על מנת להשיג תוצאה מוצלחת מניסויים אלה. כנקודת מבט עתידית, פיתוח כלי חיזוי/כימות מבוססי תמונה עשוי להקל על הפרשנות של נתונים שנרכשו.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

ללא.

Acknowledgments

המחקר שהוביל לתוצאות אלה קיבל מימון מהתוכנית "פעולות מארי קירי" במסגרת הסכם מענק REA מספר 302170 של תוכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי (FP7/2007-2013); המרכז הבינתחומי למחקר קליני (IZKF) של אוניברסיטת ארלנגן-נירנברג; מרכז המחקר השיתופי TRR241 ו-KFO257 של מועצת המחקר הגרמנית (DFG); וה-די.אף.ג'י.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Acriflavine hydrochloride	Sigma Aldrich	A8251	1 mg/mL solution in PBS
Deltaphase isothermal pad	BrainTree	B-DP-PAD	-
Gemini Cautery System	BrainTree	B-GEM-5917	-
Ketamin	WDT	9089.01.00
LAS X	Leica	-	-
LSM microscope SP8	Leica	-	-
PBS	Biochrom	L182
Rhodamine B dextran	Invitrogen	D1824	10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution
Standard forceps (Dumont SS)	Fine Science Tools	11203-23	-
Straight fine scissors	Fine Science Tools	14060-10	-
Tamoxifen	Sigma Aldrich	T5648	50 mg/mL in ethanol
Xylazin	Bayer	1320422