Summary
Sfruttando la microscopia intravitale, il metodo qui presentato consente la visualizzazione in tempo reale dello spargimento di cellule epiteliali intestinali negli animali viventi. Pertanto, la mucosa intestinale macchiata localmente (acriflavina e rodiamminaB-dextran) dei topi anestetizzati viene imageizzata fino alla risoluzione a singola cellula utilizzando la microscopia confocale.
Abstract
La microscopia intravitale dell'intestino con imaging confocale consente l'osservazione in tempo reale dello spargimento di cellule epiteliali e la perdita di barriere negli animali viventi. Pertanto, la mucosa intestinale dei topi anestetizzati è macchiata localmente con colorazione non specifica (acriflavina) e un tracciante fluorescente (rodiammina-B dextran), montato su una piastra risciacquata a soluzione salina e direttamente immaginato utilizzando un microscopio confocale. Questa tecnica può integrare altre tecniche non invasive per identificare la perdita di permeabilità intestinale, come il passaggio transmucoso di traccianti somministrati per via orale. Oltre a questo, l'approccio qui presentato consente l'osservazione diretta degli eventi di spargimento di cellule in tempo reale. In combinazione con appropriati topi reporter fluorescenti, questo approccio è adatto per far luce nei meccanismi cellulari e molecolari che controllano l'estrusione delle cellule epiteliali intestinali, nonché in altri processi biologici. Negli ultimi decenni, studi interessanti che utilizzano la microscopia intravitale hanno contribuito alla conoscenza della permeabilità endoteliale, del homing intestinale delle cellule immunitarie, della comunicazione immuno-epiteliale e dell'invasione dei componenti luminali, tra gli altri. Insieme, il protocollo qui presentato non solo aiuterebbe ad aumentare la comprensione dei meccanismi che controllano l'estrusione cellulare epiteliale, ma potrebbe anche essere la base per lo sviluppo di altri approcci da utilizzare come strumenti per visualizzare altri processi cellulari altamente dinamici, anche in altri tessuti. Tra le limitazioni tecniche, le proprietà ottiche del tessuto specifico, così come la tecnologia di imaging selezionata e la configurazione del microscopio, determinerebbero a loro volta la distanza di lavoro dell'imaging e la risoluzione delle immagini acquisite.
Introduction
L'intestino è un organo altamente specializzato con una funzione strettamente regolata che consente processi contrastanti, vale a dire nutrizione e protezione contro le sostanze luminali nocive. Foderando tra il corpo umano e l'ambiente, l'epitelio intestinale agisce come barriera fisica e immunologica e contribuisce al mantenimento dell'omeostasi mucosanell'intestino 1,,2. La perdita di integrità epiteliale e l'aumento della permeabilità alla giunzione stretta sono ben noti per essere associati alla malattia infiammatoria intestinale (IBD)3,,4,,5,,6. Le alterazioni epiteliali sono quindi considerate cause e amplificatori secondari per l'infiammazione intestinale cronica nell'IBD. Pertanto, una migliore comprensione delle prime alterazioni epiteliali nell'intestino dei pazienti affetti da IBD sarebbe di immenso valore per lo sviluppo di nuove strategie per ripristinare l'integrità epiteliale per una previsione affidabile e la successiva prevenzione delle ricadute dell'IBD.
L'epitelio intestinale segue un processo di turnover complesso e strettamente regolato. Dal fondo della cripta, le cellule epiteliali intestinali differenziate terminale (IEC) derivate da cellule staminali pluripotenti migrano verso l'alto verso la punta del villus, dove le cellule invecchiate / danneggiate vengono versate nel lume7. L'equilibrio tra divisione ed estrusione cellulare consente il mantenimento del numero di cellule epiteliali intestinali, evitando la formazione di spazi vuoti e perdite, nonché l'accumulo di cellule epiteliali che potenzialmente portano a masse cellulari e tumorigenesi8,,9,,10. Nonostante il ruolo chiave dello spargimento di cellule epiteliali nel fisiologico rinnovamento dell'epitelio intestinale, la conoscenza dei meccanismi molecolari che guidano l'estrusione delle cellule sulla punta del villus è limitata. Pertanto, è necessaria una ricerca di base che fornisca una descrizione precisa della sequenza di eventi molecolari coinvolti nello spargimento di cellule epiteliali.
Interazioni complesse tra diversi tipi di cellule all'interno della mucosa intestinale sono fondamentali per comprendere i meccanismi molecolari che regolano il turnover epiteliale e l'omeostasi intestinale. Pertanto, gli studi in vivo offrono alti vantaggi rispetto agli approcci in vitro ed ex vivo in questo contesto. Inoltre, le tecniche di imaging in tempo reale consentono la descrizione della sequenza di eventi che controllano fenomeni specifici. In questo contesto, lo studio di processi altamente dinamici richiede l'utilizzo di tecniche ottimizzate ad alta risoluzione per l'osservazione diretta del tessuto. Le tecniche di imaging intravitale appaiono come strumenti adatti unici per lo studio dello spargimento di cellule epiteliali nell'intestino.
Il termine "microscopia intravitale" si riferisce ad approcci sperimentali che sfruttano le tecniche di imaging ad alta risoluzione (microscopia multifotonale o confocale) per visualizzare direttamente cellule e tessuti nei loro dintorni nativi all'interno di un animalevivente 11. Consente l'acquisizione in tempo reale di informazioni in vivo fino alla risoluzione a cella singola e comporta chiari vantaggi rispetto ai metodi statici o a bassa risoluzione. La microscopia intravitale fornisce informazioni complementari e supera alcune limitazioni delle tecniche classiche e/o di fascia alta, come gli artefatti dovuti alla lavorazione dei tessuti. Al contrario, la principale limitazione della microscopia intravitale è che il tessuto deve essere direttamente esposto al microscopio, che nella maggior parte dei casi richiede un intervento chirurgico. Sebbene approcci sofisticati conservino la vitalità e minimizzino l'impatto del tessuto immaginato (camere scuoiate e finestre di imaging)12,,13, nella maggior parte dei casi viene eseguita una semplice incisione cutanea per l'esternalizzazione del tessuto (lembi della pelle)14. Nell'ultimo decennio, questi approcci hanno fornito prove chiave su processi altamente dinamici, che in precedenza erano imperscrutabili. Traslazione, l'imaging in tempo reale ha fornito nuove intuizioni biologiche su cellule staminali e leucociti che hannoaffinato 15, nonché la diffusione del cancro e la formazione di metastasi13,,16. Nel contesto clinico, l'endomicroscopia è attualmente sfruttata come strumento diagnostico delcancro 17 e delle malattie gastrointestinali, come l'IBD18,19; mentre la microscopia a mosaico confocale è diventata uno strumento di patologia rapida durante l'interventochirurgico 20. Insieme, la microscopia intravitale è recentemente emersa come uno strumento prezioso e versatile per la ricerca biomedica e l'applicazione futura in clinica.
La microscopia intravitale è qui implementata per la visualizzazione in tempo reale della perdita epiteliale intestinale e l'osservazione di eventi di spargimento di cellule epiteliali. La perdita di permeabilità intestinale può essere identificata da altre tecniche in vivo non invasive, come la quantificazione della somministrazione orale di traccianti fluorescenti nel siero21. Tuttavia, questa tecnica non consente l'osservazione diretta delle prestazioni di spargimento né la segregazione tra permeabilità para- e transcellulare. La combinazione di esperimenti di tracciante standard e microscopia intravitale rappresenta un approccio adeguato a: i) identificare i disturbi nella permeabilità intestinale e ii) separare tra permeabilità epiteliale para- e transcellulare. Oltre allo spargimento di cellule, la microscopia intravitale in combinazione con l'etichettatura a fluorescenza in vivo consente lo studio di altri meccanismi cellulari e molecolari (ad esempio, una stretta ridistribuzione della giunzione durante lo spargimento di cellule utilizzando topi reporter fluorescenti22 o interazioni tra IEC e altre cellule all'interno della mucosa intestinale23).
Il metodo qui presentato rappresenta un adattamento della microscopia intravitale per consentire l'osservazione in tempo reale della mucosa intestinale, utilizzando la microscopia a scansione laser confocale (CLSM). Pertanto, usiamo topi knock-out condizionali di GGTasi (Geranylgeraniltransferasi) nelle cellule epiteliali intestinali (IEC) in(topi Pggt1biΔIEC), poiché soffrono di una grave malattia intestinale e di una maggiore permeabilità epiteliale24. Vengono descritti la preparazione chirurgica del topo e la colorazione della mucosa intestinale, nonché le impostazioni appropriate utilizzate per l'acquisizione dell'imaging e l'analisi post-acquisizione. Questo protocollo potrebbe consentire studi futuri che contribuiscono alle attuali conoscenze sulla dinamica e cinetica dello spargimento di cellule epiteliali intestinali. Inoltre, il protocollo potrebbe servire come base per vari adattamenti per studiare altri fenomeni che si verificano sulla superficie della mucosa intestinale e persino in altri tessuti.
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Protocol
Il seguente protocollo è stato approvato dalle autorità locali competenti di Erlangen (Regierung von Unterfranken, Würzburg, Germania). I topi erano alloggiati in specifiche condizioni esenti da agenti patogeni.
NOTA: L'inibizione della prenilazione mediata da GGTasi all'interno degli IEC provoca una grave alterazione della permeabilità intestinale nei topi Pggt1biΔIEC 24. Pertanto, questo modello di mouse è stato utilizzato per dimostrare come il protocollo può essere utile per studiare i difetti della barriera intestinale. Tuttavia, questo protocollo potrebbe essere utilizzato per lo studio di qualsiasi altra linea di mouse.
1. Preparazione chirurgica e colorazione della mucosa intestinale del topo
NOTA: La preparazione chirurgica si basa sui protocolli precedentemente descritti25. Tenere il topo anestetizzato sotto una lampada rossa durante la preparazione chirurgica, per evitare un calo della temperatura corporea.
- Anestetizzare il topo mediante iniezione intraperitoneale di chetamina/xilazina (96 mg/kg di chetamina; e 12,8 mg/kg di xilazina). Verificare l'anestesia verificando la mancanza di un riflesso palpebrale.
- Applicare la crema per la protezione degli occhi con un cotton fioc.
- Effettuare un'incisione (1 cm) sull'area ventrale sinistra utilizzando forcette standard e forbici sottili dritte.
- Esternarizzare un segmento dell'intestino (5-7 cm, approssimativamente).
- Aprire il segmento intestinale esternalizzato longitudinalmente per elettrocauterizzazione sul lato antimesenterico.
- Esporre la mucosa e risciacquare a breve con soluzione salina per rimuovere il contenuto fecale.
NOTA: Facoltativamente, applicare xylazin direttamente sull'intestino per evitare artefatti di movimento dovuti alla peristalisi. - Macchiare la superficie della mucosa intestinale con acriflavina e rodiammina-B dextran (10 kDa).
- Applicare la soluzione di acriflavina da 1 mg/mL (100 μL) pipettando goccia a goccia sulla mucosa e incubare per 3 minuti. Lavare la soluzione rimanente con PBS.
- Applicare la soluzione di 2 mg/mL rhodamine-dextran (100 μL) pipettando goccia a goccia sulla mucosa e incubare per 3 min. Lavare la soluzione rimanente con PBS.
NOTA: Facoltativamente, rimuovere il sangue dalla preparazione usando cotone asettico.
- Posizionare la supina del mouse anestetizzata su uno scivolo di copertura montato in una camera risciacquata con soluzione salina preri warmed (37 °C).
NOTA: Il segmento intestinale aperto viene quindi posizionato sulla superficie luminare verso il basso, sullo scivolo di copertura. - Posizionare la preparazione (topo anestetizzato nella camera) sullo stadio del microscopio invertito.
- Coprire l'animale con un tampone isotermico (circa 37 °C).
- Procedere immediatamente alla microscopia intravitale.
NOTA: Mantenere la preparazione chirurgica risciacquata con soluzione salina preri warmed per evitare la disidratazione del tessuto e la morte cellulare.
2. Microscopia intravitale
NOTA: Eseguire il passaggio 2.1 prima di iniziare la preparazione chirurgica, per evitare lunghi tempi di attesa tra anestesia, chirurgia e acquisizione di immagini. Se necessario, ulteriori dosi di anestetici possono essere somministrate ad animali preparati chirurgicamente per tenerli in anestesia per gli esperimenti di imaging.
- Impostare il microscopio CLSM.
- Avviare il microscopio CLSM accendendo la base del microscopio e la scatola dello scanner. Accendere il computer premendo il pulsante Start.
- Avviare il software di acquisizione delle immagini (ad esempio, LAS X) facendo doppio clic sull'icona. Selezionare la configurazione appropriata (Configurazione: macchina; Microscopio: DMI6000) e fare clic su OK.
- Definire la risoluzione appropriata. Vai a Configurazione | | Procedura di risoluzione | Profondità del bit. Selezionare 12.
- Passare al menu Acquisizione. Selezionate xyzt per la modalità di acquisizione dell'immagine dal menu a discesa. Selezionare l'obiettivo dal menu a discesa (20x o 40x).
- Progettare l'impostazione di acquisizione sequenziale. Clicca su Seq. Aggiungere una seconda sequenza, facendo clic sul pulsante aggiungi (+). Selezionare Tra fotogrammi.
- Configurare la sequenza 1 (rilevamento dell'acriflavina; eccitazione a 416 nm; emissione di 514 nm). Accendere la scatola laser visibile. Attivare il PMT1 (ON). Definire la finestra della lunghezza d'onda di emissione (490-550 nm).
- Configurare la sequenza 2 (rilevamento di rhodamineB-dextran; eccitazione a 570 nm; 590 nm, emissione). Accendere la scatola laser visibile. Attivare il PMT2 (ON). Definire la finestra della lunghezza d'onda di emissione (550-760).
- Attivare i laser corrispondenti (488 e 552). Vai a Configurazione | Laser. Attivare laser da 488 e 552 nm (attivare).
- Regolare l'impostazione in base alle feature specifiche dell'esperimento corrente.
- Accendere la sorgente luminosa (premere l'alimentazione). Posizionare la preparazione (mouse anestetizzato nella camera) sullo stadio del microscopio e modificare la posizione xy fino a quando l'asse di illuminazione non è focalizzato sulla preparazione del tessuto.
- Selezionare il campo di interesse utilizzando la sorgente luminosa standard e gli oculari.
- Selezionare il cubo filtro (I3). Aprire l'otturatore. Concentrati sulla superficie della mucosa intestinale utilizzando la macro e la microruola. Cercare un'area in cui è possibile visualizzare diversi villi all'interno del campo visivo modificando la posizione XY.
- Verificare che la colorazione rhodamine-dextran sia visibile anche in quell'area. Modificare il cubo del filtro (N2.1). Controllare l'immagine attraverso gli oculari.
- Avviare l'acquisizione delle immagini CLSM dal software. Ottimizzare le impostazioni per le due sequenze.
- Selezionare Sequenza 1. Regolare la potenza, il guadagno e l'offset laser per la sequenza 1.
- Selezionare Sequenza 2. Regolare la potenza, il guadagno e l'offset laser per la sequenza 2.
- Definire l'intervallo di stack z.
- Aprire il menu di consegna dello stack Z. Concentrati sulla superficie della mucosa usando il controllo dell'asse Z. Premere Begin.
- Concentrati sul limite inferiore in cui il segnale è ancora rilevabile. Premere Fine.
- Definire i numeri delle pile z (10). Evitare perdite di tempo superiori a 2 minuti per due punti di tempo consecutivi.
- Definire le impostazioni dell'ora. Passare al menu Ora. Fare clic su Riduci a icona. Selezionare Acquisisci fino all'arresto.
- Definire la media della linea. Selezionare Seq 1. Selezionare Media riga 2. Selezionare Seq 2. Selezionare Media riga 2.
- Acquisire le immagini corrispondenti.
- Selezionare Formato (1024 x 1024) e Velocità (400). Premere Start.
- Premere Interrompi dopo il tempo di acquisizione dell'immagine desiderato.
- Salvare il file. Passare a Progetto. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul file corrispondente. Premere Salva con nome.
- Assegnare un nome appropriato al file. Selezionare la cartella adeguata. Premere Salva.
- Eutanasia dell'animale (lussazione cervicale) e raccogliere i tessuti per l'analisi del secondo, se necessario.
3. Analisi dell'immagine: determinare la velocità di spargimento cellulare e l'epitelio intestinale
- Tasso di spargimento cellulare
- Avviare il software di acquisizione delle immagini.
- Passare a Apri progetti. Selezionare il file appropriato.
- Definire il tempo totale di acquisizione dell'immagine.
- Selezionare l'ultimo stack z completo. Selezionare l'ultima posizione Z dal punto di tempo selezionato in precedenza. Leggi l'ora nell'angolo inferiore destro dello schermo (tempo totale di acquisizione dell'immagine).
- Selezionare un villus.
- Selezionare la posizione della pila Z appropriata (superficie del villus, ma abbastanza profonda da evitare l'interferenza con celle già versate e altri componenti presenti al lume).
- Misurare la lunghezza della membrana basale. Selezionare lo strumento righello. Dividi il villus in diverse linee per coprire o disegnare l'intero perimetro del villus. Aggiungere i diversi valori (lunghezza totale della membrana basale). Eliminare i segmenti dello strumento Righello.
- Contare il numero di eventi che si verificano durante l'intera durata dell'acquisizione dell'immagine.
- Dividere il villus in segmenti con dimensioni adeguate. Analizza la sequenza di eventi/segmenti facendo scorrere la barra attraverso i diversi punti di tempo. Annotare gli eventi di spargimento delle celle identificati.
- Calcolare il numero di eventi di spargimento/tempo/lunghezza della membrana basale, che indica la velocità di spargimento cellulare. Conta fino a 5 villi/video e almeno due video/mouse. Calcola la media di queste 10 misurazioni.
- Perdita
- Selezionare un villus.
- Selezionare la posizione della pila Z appropriata (superficie del villus, ma abbastanza profonda da evitare l'interferenza con celle già versate e altri componenti presenti al lume). Contare il numero totale di cellule epiteliali/vilo.
- Contare il numero di punti di perdita (presenza paracellulare di rodimina dextran. Questo evento è transitorio, che può essere confermato controllando le immagini acquisite precedenti e più ulterior).
- Calcolare il numero di perdite/numero totale di cellule epiteliali. Analizzare 10 diversi villus/campione/video e calcolare il numero medio di perdite e cellule permeabili/villus.
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Representative Results
Il protocollo qui presentato descrive un approccio intravitale basato sulla microscopia per visualizzare le perdite epiteliali intestinali e osservare le prestazioni di spargimento cellulare nell'intestino in tempo reale. In breve, i topi vengono anestetizzati e sottoposti a preparazione chirurgica al fine di esporre la superficie della mucosa dell'intestino tenue. Gli IEC vengono quindi macchiati tramite l'applicazione topica dell'acriflavina; mentre la rodimina luminare B-dextran è usata come traccianti per rilevare il passaggio transmucoso dal lume allo spazio sub-epiteliale. Pertanto, la preparazione chirurgica e il mouse anestetizzato vengono posizionati su uno scivolo montato in una piastra di Petri e immaginato nel tempo utilizzando clsm (Figura 1). L'analisi post-acquisizione consente il calcolo del tasso di spargimento di cellule epiteliali (numero di eventi di spargimento cellulare / minuto / lunghezza della membrana basale) così come la percentuale di perdite transitorie (permeabilità paracellulare) e "cellule permeabili" (permeabilità transcellulare) in un determinato momento.
Al fine di indurre alterazioni dell'integrità epiteliale, abbiamo approfittato del modello di topo condizionale ggtase-carente specifico dell'IEC precedentemente descritto(topi Pggt1biΔIEC), generato tramite il sistema LoxP-Cre24. Come descritto in precedenza, i topi Pggt1biΔIEC (Figura 2A) hanno sviluppato una grave patologia intestinale, come dimostrato dall'aumento del punteggio di danno istologico nell'intestino tenue (Figura 2B). L'aumento della permeabilità epiteliale intestinale potrebbe essere rilevato tramite esperimenti in vivo di tracciante utilizzando FITC-dextran somministrato per via orale (4 kDa) (Figura 2C), e quindi confermato tramite microscopia intravitale(figura 2D-2E). Mentre il dextran di rodiammina è limitato al compartimento luminare nei topi di controllo, potremmo rilevare il tracciante all'interno del compartimento sub-epiteliale dopo l'abrogazione dell'espressione GGTasi all'interno degli IEC nei topi Pggt1biΔIEC. Durante l'acquisizione dell'immagine, gli eventi di spargimento di cellule potrebbero essere identificati come cellule che si spostano fuori dal monostrato epiteliale nel lume, portando a spazi temporanei nella sigillatura dell'epitelio, che sono infine chiusi dal contatto tra le cellule vicine, il cosiddetto effetto zip (Figura 3A). Potremmo chiaramente osservare queste lacune, ciò che chiamiamo perdita epiteliale temporanea sia nel controllo che nei topi Pggt1biΔIEC, anche se la frequenza di questi fenomeni era più alta in quest'ultimo (Figura 3B,3C). È interessante notare che potremmo anche identificare altre cellule in cui il dextran potrebbe essere rilevato intracellularmente, le cosiddette "cellule permeabili"; questi eventi si sono verificati principalmente nei topi Pggt1biΔIEC (Figura 3B,3D). Insieme, sfruttando l'approccio di microscopia intravitale qui presentato, potremmo determinare che la compromissione dell'integrità epiteliale nei topi Pggt1biΔIEC porta a alterazioni delle prestazioni dello spargimento cellulare e a una maggiore permeabilità epiteliale para- e transcellulare nell'intestino.
Figura 1: Descrizione schematica dell'approccio alla microscopia intravitale qui presentato. (A) Diagramma di flusso. (B ) Diagramma. Dopo la preparazione chirurgica, la mucosa intestinale macchiata localmente con acriflavina e dextran rhodamine viene montata su un coperchio incorporato su una piastra di Petri per consentire la perfusione con una soluzione salina (superficie luminare verso il basso). La mucosa intestinale viene quindi immagine utilizzando un microscopio CLSM nel tempo. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Alterazione dell'integrità epiteliale nei topi Pggt1biΔIEC che portano ad una maggiore permeabilità intestinale. (A) Western blot che mostra l'espressione GGTase-1B indotta da tamoxifene abolita all'interno degli IEC in Pggt1biΔIEC rispetto ai topi di controllo. (B) Punteggio istologico dell'intestino tenue proveniente dal controllo e topi Pggt1biΔIEC. (C) Quantificazione della permeabilità epiteliale intestinale in vivo misurata mediante passaggio transmucoso di FITC-Dextran somministrato per via orale (4 kDa). (D) Diagramma che descrive la direzione dell'acquisizione dell'immagine, dal lume verso il basso all'asse del villus. Immagini rappresentative da una pila z. (E) Immagini rappresentative di microscopia intravitale che utilizzano acriflavina e rodiammina B-dextran applicati localmente dal controllo e topi Pggt1biΔIEC, come descritto nel presente manoscritto. I dati sono espressi come ± test t non accoppiato. * Valore P ≤ 0,05; Valore P ≤ 0,0001. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Prestazioni di spargimento di cellule epiteliali e permeabilità epiteliale para/transcellulare mediante microscopia intravitale. (A) Immagini rappresentative che mostrano un evento di spargimento di celle in tempo reale (freccia bianca). La cella del capannone viene estrusa dal monostrato epiteliale al lume. Le cellule vicine sigillano la perdita temporanea (effetto zip) per evitare la perdita della funzione barriera. (B) Immagine rappresentativa che mostra perdite (frecce bianche) e cellule epiteliali intestinali permeabili (frecce blu). (C-D) Quantificazione delle perdite temporanee (C) e delle cellule permeabili (D) nel controllo e dei topi Pggt1biΔIEC. I dati sono espressi come ± test t non accoppiato. * Valore P ≤ 0,05; Valore P ≤ 0,0001 . Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Sebbene tecnicamente impegnativa, la metodologia basata sulla microscopia intravitale rappresenta un approccio sperimentale unico per visualizzare il processo cellulare altamente dinamico in tempo reale, come le prestazioni di spargimento di cellule. Finora, non esiste un approccio sperimentale alternativo per visualizzare l'estrusione cellulare in vivo. Crediamo che questo protocollo possa contribuire alla descrizione di diversi processi cellulari che svolgono un ruolo nel mantenimento dell'omeostasi intestinale.
Sfruttando la microscopia intravitale, il metodo qui presentato consente la visualizzazione in tempo reale dello spargimento di cellule epiteliali intestinali negli animali viventi. Pertanto, la mucosa intestinale macchiata localmente (acriflavina e rodiammina B-dextran) dei topi anestetizzati viene imageizzata fino alla risoluzione a singola cellula utilizzando la microscopia confocale. In combinazione con esperimenti di tracciante standard, consente l'identificazione di disturbi della permeabilità intestinale in vivo e la distinzione tra permeabilità para- e transcellulare. In combinazione con topi reporter, protocolli simili sfruttati per monitorare lo spargimento di cellule epiteliali potrebbero mostrare una stretta ridistribuzione della giunzione per sigillare la perdita transitoria lasciata dalle cellule estruse (effettozip)22,,26.
Oltre allo spargimento di cellule epiteliali, le modifiche al metodo qui presentato sono state adattate all'analisi di altri processi cellulari altamente dinamici che si verificano sulla superficie della mucosa intestinale. Ad esempio, la somministrazione endovenosa di molecole di tracciante e colorazione dei vasi sanguigni con anticorpi anti-CD31 ha fornito l'opportunità di valutare l'integrità endotelialenell'intestino 27. Oltre all'epitelio, approcci simili sono stati utilizzati per indagare le proprietà di homing intestinaledelle cellule immunitarie 28,29, così come l'interazione tra cellule immunitarie e IEC nel contesto dell'infezione intestinale23.
Nonostante la pletora di potenziali applicazioni del protocollo qui descritto, esistono anche alcune limitazioni al suo utilizzo. Lo scattering della luce all'interno del campione compromette l'acquisizione dell'imaging in profondità all'interno del tessuto. Nel caso dell'intestino tenue, l'acquisizione dell'immagine è limitata a fenomeni che si verificano sulla superficie della mucosa (punta del villus). D'altra parte, la struttura e la funzione dell'intestino stesso limita le prestazioni della microscopia intravitale. Nonostante le proprietà ottiche ottimali dell'organo, la contrazione del tessuto peristaltico e il movimento indotto dal flusso dei villi intestinali implicano frequenti modifiche sul piano di messa a fuoco durante l'acquisizione dell'immagine.
Le potenziali modifiche al protocollo qui presentato potrebbero superare alcune di queste limitazioni. L'uso di tecniche alternative di microscopia, come la microscopia con un fotone o multifoto- implica una maggiore profondità di penetranza al fine di visualizzare i piani di messa a fuoco situati fino a 50-100 μm sotto la superficie del campione. Tuttavia, è importante considerare il compromesso tra risoluzione dell'immagine e tempo di acquisizione, poiché questi esperimenti mirano all'osservazione di processi veloci e dinamici. In termini di configurazione del microscopio e/o impostazioni, l'uso di lunghezze d'onda più lunghe e la selezione di obiettivi a lunga distanza di lavoro libera con elevata apertura numerica comportano impostazioni ottimizzate per l'imaging intravitale.
Insieme, la progettazione sperimentale ottimale che tenga conto della selezione dei coloranti fluorescenti appropriati e della tecnica di microscopia, nonché della configurazione del dispositivo di imaging dovrebbe essere considerata come passi chiave per ottenere un esito positivo da questi esperimenti. Come prospettiva futura, lo sviluppo di strumenti di previsione/quantificazione basati su immagini potrebbe facilitare l'interpretazione dei dati acquisiti.
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Disclosures
Nessuno.
Acknowledgments
La ricerca che ha portato a questi risultati ha ricevuto finanziamenti dal Programma Persone (Azioni Marie Curie) nell'ambito della sovvenzione REA numero 302170 del Settimo Programma Quadro dell'Unione Europea (7PQ/2007-2013); il Centro Interdisciplinare per la Ricerca Clinica (IZKF) dell'Università Erlangen-Norimberga; il Centro di Ricerca Collaborativa TRR241 e il Gruppo di Ricerca Clinica KFO257 del German Research Council (DFG); e il DFG.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Acriflavine hydrochloride | Sigma Aldrich | A8251 | 1 mg/mL solution in PBS |
| Deltaphase isothermal pad | BrainTree | B-DP-PAD | - |
| Gemini Cautery System | BrainTree | B-GEM-5917 | - |
| Ketamin | WDT | 9089.01.00 | |
| LAS X | Leica | - | - |
| LSM microscope SP8 | Leica | - | - |
| PBS | Biochrom | L182 | |
| Rhodamine B dextran | Invitrogen | D1824 | 10,000 kDa MW; 2 mg/mL solution |
| Standard forceps (Dumont SS) | Fine Science Tools | 11203-23 | - |
| Straight fine scissors | Fine Science Tools | 14060-10 | - |
| Tamoxifen | Sigma Aldrich | T5648 | 50 mg/mL in ethanol |
| Xylazin | Bayer | 1320422 |
References
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